JPH0369515B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はコリネバクテリウム属に属する２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）より誘導した５
−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）に
よる２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成に於いて、
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有発酵液中の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）
を界面活性剤で殺菌し、当該発酵液を直接原料と
して使用する方法に関するものである。さらに、
詳しくは、２−ケト−Ｌ−グロン酸製造のための
原料基質２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の分解
を回避して、微量の界面活性剤の添加のみによ
り、常温下に、数時間のうちに（）を効率良く
殺菌する方法に関するものである。 ここに言う（）とは後に詳述するＤ−グルコ
ースから２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生産
し得る微生物であり、（）とは、コリネバクテ
リウム属に属する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌
株（）より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸
代謝欠損変異株のことを称する。 本発明者等は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の工業
的生産を意図として、（）の培養液に、（）を
用いて調製した２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
発酵液（（）の生菌108〜1010個／mlを含む）を
直接添加して２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する
ことを試みたところ、（）を使用する場合とは
異なり、（）を使用すると、２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の生産が著しく阻害されることを見出し
た。 これについて種々検討した結果、この阻害現象
は、この工程に於いて（）が、およそ105個／
ml以上に増殖した場合に発生することが明らかと
なつた。 ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液中の
（）の殺菌方法としては、熱滅菌および過除
菌等が考えられるが、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸は熱に不安定であること、また過除菌法
は高価であり、工業規模では実用化が困難である
ことなどの理由により、他の更に経済的な（）
の殺菌方法の確立が、本発明者等による２−ケト
−Ｌ−グロン酸生産の工業的実施のためには必須
となつた。このため、種々の検討を行つた結果、
界面活性剤による（）の安全、確実な殺菌方法
を確立することによつて本発明が完成された。 すなわち本発明によればコリネバクテリウム属
に属する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）
より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損
変異株（）を培地中に生育させ、この培地中に
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有培養液を添
加したうえ、培養を継続して、混合培養液中に２
−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積させ、これを採
取する２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法におい
て、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有培養液
の添加に先立つて、該培養液中に存在する２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）を界面
活性剤を用いて殺菌することを特徴とする方法が
提供される。 本発明方法は、その実施にあたつて殺菌のため
の設備の増設が不要であり、（）による２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の生産を阻害しない界面活性剤
が容易に選択出来、かつ、界面活性剤が安価で入
手し易いなどの利点を有している。さらに容易に
大規模な実施が可能であることなどの利点も有し
ている。検討した各種界面活性剤のうちではドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）がとくに好ましいも
のとされる。 本発明方法の概要は次のように示すことができ
る。先ず原料基質としてのＤ−グルコース、コー
ン・ステイープ・リカー等の窒素源および無機塩
類を含む培地にグルコノバクター属（ここに言う
グルコノバクター属とは、バージーズ・マニユア
ル・オブ・デタミナテイブ・バクテリオロジー
（以後「マニユアル」と呼ぶ）（第８版）に準拠す
るものである。従つて「マニユアル」（第７版）
に於けるアセトバクター属、アセトモナス属およ
びグルコノバクター属をも含む。以後同じ。）あ
るいはエルウイニア属に属する２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸生産菌株（）を28℃で通気撹拌
培養し、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液
を調製する。次いで、この発酵液を２つに分割
し、その一方には、界面活性剤濃度が0.01〜0.25
％（ｗ／ｖ）になるように無菌的に添加し、５〜
28℃の温度で数時間処理する。この間、時々、緩
やかに撹拌する。一方、界面活性剤を添加しない
方の発酵液も、５〜28℃で同様に数時間保持す
る。この間、（）の生菌数は菌株および界面活
性剤の種類によつても異なるが、例えばドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）の場合、未処理の対照と
比較して、100万分の１以下に減少する。なお、
他方の界面活性剤による処理をしていない２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の一部を採り
過除菌する。つぎに、界面活性剤処理、過除菌
処理および未処理の２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸発酵液共に（）の培養液に添加する直前に
Ｄ−グルコースを１〜10％濃度になるように無菌
的に添加する。 一方、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液
の界面活性剤処理の時間に合わせて（）を培養
しておく。（）のこれらの培養液に対してさき
に用意した種々の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸発酵液を、それぞれ個別にその濃度が0.2％に
なるように２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の残
量を見ながら、15〜120分毎に添加し、添加開始
後48時間培養を続ける。その結果、界面活性剤に
よつて殺菌処理した２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸発酵液あるいは過除菌した発酵液を添加し
た系では、いずれも、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸から２−ケト−Ｌ−グロン酸への転換が順
調に進行する。しかし、未処理の２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸発酵液を添加した系では、（）
がおよそ105個／ml以上に増殖し、２−ケト−Ｌ
−グロン酸の生成は停止する。 本発明方法において使用される２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）はグルコノバク
ター属あるいはエルウイニア属に属する微生物で
あり、第１表に例示したものが挙げられる。
ト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）より誘導した５
−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）に
よる２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成に於いて、
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有発酵液中の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）
を界面活性剤で殺菌し、当該発酵液を直接原料と
して使用する方法に関するものである。さらに、
詳しくは、２−ケト−Ｌ−グロン酸製造のための
原料基質２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の分解
を回避して、微量の界面活性剤の添加のみによ
り、常温下に、数時間のうちに（）を効率良く
殺菌する方法に関するものである。 ここに言う（）とは後に詳述するＤ−グルコ
ースから２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生産
し得る微生物であり、（）とは、コリネバクテ
リウム属に属する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌
株（）より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸
代謝欠損変異株のことを称する。 本発明者等は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の工業
的生産を意図として、（）の培養液に、（）を
用いて調製した２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
発酵液（（）の生菌108〜1010個／mlを含む）を
直接添加して２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する
ことを試みたところ、（）を使用する場合とは
異なり、（）を使用すると、２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の生産が著しく阻害されることを見出し
た。 これについて種々検討した結果、この阻害現象
は、この工程に於いて（）が、およそ105個／
ml以上に増殖した場合に発生することが明らかと
なつた。 ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液中の
（）の殺菌方法としては、熱滅菌および過除
菌等が考えられるが、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸は熱に不安定であること、また過除菌法
は高価であり、工業規模では実用化が困難である
ことなどの理由により、他の更に経済的な（）
の殺菌方法の確立が、本発明者等による２−ケト
−Ｌ−グロン酸生産の工業的実施のためには必須
となつた。このため、種々の検討を行つた結果、
界面活性剤による（）の安全、確実な殺菌方法
を確立することによつて本発明が完成された。 すなわち本発明によればコリネバクテリウム属
に属する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）
より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損
変異株（）を培地中に生育させ、この培地中に
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有培養液を添
加したうえ、培養を継続して、混合培養液中に２
−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積させ、これを採
取する２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法におい
て、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有培養液
の添加に先立つて、該培養液中に存在する２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）を界面
活性剤を用いて殺菌することを特徴とする方法が
提供される。 本発明方法は、その実施にあたつて殺菌のため
の設備の増設が不要であり、（）による２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の生産を阻害しない界面活性剤
が容易に選択出来、かつ、界面活性剤が安価で入
手し易いなどの利点を有している。さらに容易に
大規模な実施が可能であることなどの利点も有し
ている。検討した各種界面活性剤のうちではドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）がとくに好ましいも
のとされる。 本発明方法の概要は次のように示すことができ
る。先ず原料基質としてのＤ−グルコース、コー
ン・ステイープ・リカー等の窒素源および無機塩
類を含む培地にグルコノバクター属（ここに言う
グルコノバクター属とは、バージーズ・マニユア
ル・オブ・デタミナテイブ・バクテリオロジー
（以後「マニユアル」と呼ぶ）（第８版）に準拠す
るものである。従つて「マニユアル」（第７版）
に於けるアセトバクター属、アセトモナス属およ
びグルコノバクター属をも含む。以後同じ。）あ
るいはエルウイニア属に属する２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸生産菌株（）を28℃で通気撹拌
培養し、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液
を調製する。次いで、この発酵液を２つに分割
し、その一方には、界面活性剤濃度が0.01〜0.25
％（ｗ／ｖ）になるように無菌的に添加し、５〜
28℃の温度で数時間処理する。この間、時々、緩
やかに撹拌する。一方、界面活性剤を添加しない
方の発酵液も、５〜28℃で同様に数時間保持す
る。この間、（）の生菌数は菌株および界面活
性剤の種類によつても異なるが、例えばドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）の場合、未処理の対照と
比較して、100万分の１以下に減少する。なお、
他方の界面活性剤による処理をしていない２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の一部を採り
過除菌する。つぎに、界面活性剤処理、過除菌
処理および未処理の２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸発酵液共に（）の培養液に添加する直前に
Ｄ−グルコースを１〜10％濃度になるように無菌
的に添加する。 一方、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液
の界面活性剤処理の時間に合わせて（）を培養
しておく。（）のこれらの培養液に対してさき
に用意した種々の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸発酵液を、それぞれ個別にその濃度が0.2％に
なるように２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の残
量を見ながら、15〜120分毎に添加し、添加開始
後48時間培養を続ける。その結果、界面活性剤に
よつて殺菌処理した２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸発酵液あるいは過除菌した発酵液を添加し
た系では、いずれも、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸から２−ケト−Ｌ−グロン酸への転換が順
調に進行する。しかし、未処理の２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸発酵液を添加した系では、（）
がおよそ105個／ml以上に増殖し、２−ケト−Ｌ
−グロン酸の生成は停止する。 本発明方法において使用される２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸生産菌株（）はグルコノバク
ター属あるいはエルウイニア属に属する微生物で
あり、第１表に例示したものが挙げられる。
【表】
また本発明方法において使用する５−ケト−Ｄ
−グルコン酸代謝欠損変異株（）とは、２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を生産するコリネバクテリウム属に属する
微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）
と称する）を変異させ、５−ケト−Ｄ−グルコン
酸には生育しないかまたはほとんど生育せず且つ
Ｄ−グルコン酸に良く生育するよう誘導した変異
株を意味する。この５−ケト−Ｄ−グルコン酸代
謝欠損変異株（）を生育させ２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸と接触させると２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸を実質的に併産せず２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸を生成する。５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株（）の例として、（）であるコリ
ネバクテリウム・スピーシーズ（FERM−
P2770、ATCCNo.31090）より誘導した変異株
（微工研条寄FERM−BP108）や（）であるコ
リネバクテリウム・スピーシーズ（FERM−
P2687、ATCCNo.31081）より誘導した変異株
（微工研条寄FERM−BP107）等が挙げられる。 上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝能を欠損させることによつて２−ケト−
Ｄ−グルコン酸産生能を欠損あるいは著しく弱化
させ得た事実は、コリネフオーム・グリープ（バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー第８版の定義による）に属する
すべての２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌に関して
共通のことである。 実施例 Ａ 菌株（）による２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸発酵： () 種培地 Ｄ−グルコース 1.0％ コーン・ステイープ・リカー（CSL） 5.0％ リン酸第一カリウム（KH2PO4） 0.1％ 硫酸マグネシウム（MgSO4・7H2O） 0.02％ 炭酸カルシウム（CaCO3） 0.5％ を含む水溶液のPH（10％NaOHにより調節）
を6.8〜7.0に調節し、500ml三角フラスコに
50mlずつ分注し、120℃で、20分間、滅菌し
て種培地とする。 () 種培養 上記フラスコに第１表に示したエルウイニ
ア・プンクタータFERM−P5452を一白金耳
植菌し、８〜11時間振盪培養（振幅71mm、回
転数270rpm、温度28℃）した。光学密度が
約８となる時をもつて種培養の終点とした。 () 発酵培地 Ｄ−グルコース 20％ CSL ３％ KH2PO4 0.1％ CaCO3 6.3％ ポリプロピレングリコール2000（Ｐ−2000、
消泡剤） 0.01％ を含む水溶液を上記と同様にPH調節し、120
℃で、20分間、滅菌したのち、予め滅菌して
おいた１リツトル（）の発酵槽に455mlず
つ分注し、さらに上記種培養液45mlをそれぞ
れ加えた。 () 本培養 温 度 28℃ 撹 拌 1740rpm 通 気 600Nml／分 時 間 20〜30時間 () 終了点 本培養は薄層クロマトグラフイーにおいて
２−ケト−Ｄ−グルコン酸のピンクのスポツ
トが消失する点を以つて終了点とした。 Ｂ ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液中の
菌株（）の界面活性剤による殺菌 使用した界面活性剤を第２表に示す。発酵の終
了した２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液は
直ちに分割し、個別にそれぞれの界面活性剤の濃
度が２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液で
0.025％（ｗ／ｖ）になるように無菌的に添加し、
時々撹拌しながら、28℃で６時間、処理した。こ
のうちSDSによつて処理した２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸発酵液を、次記の菌株（）による
２−ケト−Ｌ−グロン酸発酵に用いた。
−グルコン酸代謝欠損変異株（）とは、２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を生産するコリネバクテリウム属に属する
微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）
と称する）を変異させ、５−ケト−Ｄ−グルコン
酸には生育しないかまたはほとんど生育せず且つ
Ｄ−グルコン酸に良く生育するよう誘導した変異
株を意味する。この５−ケト−Ｄ−グルコン酸代
謝欠損変異株（）を生育させ２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸と接触させると２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸を実質的に併産せず２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸を生成する。５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株（）の例として、（）であるコリ
ネバクテリウム・スピーシーズ（FERM−
P2770、ATCCNo.31090）より誘導した変異株
（微工研条寄FERM−BP108）や（）であるコ
リネバクテリウム・スピーシーズ（FERM−
P2687、ATCCNo.31081）より誘導した変異株
（微工研条寄FERM−BP107）等が挙げられる。 上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝能を欠損させることによつて２−ケト−
Ｄ−グルコン酸産生能を欠損あるいは著しく弱化
させ得た事実は、コリネフオーム・グリープ（バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー第８版の定義による）に属する
すべての２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌に関して
共通のことである。 実施例 Ａ 菌株（）による２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸発酵： () 種培地 Ｄ−グルコース 1.0％ コーン・ステイープ・リカー（CSL） 5.0％ リン酸第一カリウム（KH2PO4） 0.1％ 硫酸マグネシウム（MgSO4・7H2O） 0.02％ 炭酸カルシウム（CaCO3） 0.5％ を含む水溶液のPH（10％NaOHにより調節）
を6.8〜7.0に調節し、500ml三角フラスコに
50mlずつ分注し、120℃で、20分間、滅菌し
て種培地とする。 () 種培養 上記フラスコに第１表に示したエルウイニ
ア・プンクタータFERM−P5452を一白金耳
植菌し、８〜11時間振盪培養（振幅71mm、回
転数270rpm、温度28℃）した。光学密度が
約８となる時をもつて種培養の終点とした。 () 発酵培地 Ｄ−グルコース 20％ CSL ３％ KH2PO4 0.1％ CaCO3 6.3％ ポリプロピレングリコール2000（Ｐ−2000、
消泡剤） 0.01％ を含む水溶液を上記と同様にPH調節し、120
℃で、20分間、滅菌したのち、予め滅菌して
おいた１リツトル（）の発酵槽に455mlず
つ分注し、さらに上記種培養液45mlをそれぞ
れ加えた。 () 本培養 温 度 28℃ 撹 拌 1740rpm 通 気 600Nml／分 時 間 20〜30時間 () 終了点 本培養は薄層クロマトグラフイーにおいて
２−ケト−Ｄ−グルコン酸のピンクのスポツ
トが消失する点を以つて終了点とした。 Ｂ ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液中の
菌株（）の界面活性剤による殺菌 使用した界面活性剤を第２表に示す。発酵の終
了した２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液は
直ちに分割し、個別にそれぞれの界面活性剤の濃
度が２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液で
0.025％（ｗ／ｖ）になるように無菌的に添加し、
時々撹拌しながら、28℃で６時間、処理した。こ
のうちSDSによつて処理した２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸発酵液を、次記の菌株（）による
２−ケト−Ｌ−グロン酸発酵に用いた。
【表】
【表】
Ｃ ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液への
グルコースの添加 SDS処理発酵液、過除菌発酵液（別途調製）
および無処理発酵液に対し、菌株（）の培養液
への添加開始直前にそれぞれ個別に予め滅菌して
おいたＤ−グルコース50％溶液を最終濃度が3.8
％になるように加えた。以後、２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の原料として使用する２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸発酵液を基質溶液と呼ぶ。 Ｄ 菌株（）による２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸からの２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産 () 種培地 Ｄ−グルコース 1.0％ バクト・イースト・エキストラクト
（Difco） 0.5％ バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ を含む水溶液のPHを前記と同様に7.0〜7.2に
調節し、500ml容の三角フラスコに50mlずつ
分注し、115℃で20分間滅菌する。 () 種培養 上記フラスコに、コリネバクテリウム・ス
ピーシーズ（FERM−P2770、ATCC31090）
より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株（FERM−BP108）を一白金耳
植菌し、20〜24時間培養（振幅71mm、回転数
270rpm、温度28℃）した。 () 本発酵培地 Ｄ−グルコース 2.0％ CSL 3.0％ 硝酸ソーダ（NaNO3） 0.2％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ Ｐ−2000 0.01％ を含む水溶液のPHを前記と同様に7.0〜7.2に
調節し、培地450mlを115℃、20分間滅菌後、
予め滅菌した１発酵槽に添加した。 () 本発酵−(a) 上記の１発酵槽に、先の種培養液を約50
mlずつ植菌し、10〜16時間培養（通気量
600Nml／分、撹拌1740rpm、温度28℃）し
た。 () 本発酵−(b) FERM−BP108（）の培養液からグルコ
ースが消失した後、C.で調製した基準溶液を
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の最終濃度
が0.2％になるように加えた。以後培地中の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の減少を監
視しながら１回に添加する２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸の最終濃度が、約0.2％にな
るように、15分から120分の間隔で、基質溶
液を添加した。基質溶液の添加は、添加開始
後45時間目で停止し、さらに３時間培養を継
続し、添加開始後48時間目まで培養した。培
養液は適当な時期に、無菌的に採取し、採取
した培養液は必要に応じて次記Ｅの分析方法
によつて、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
および２−ケト−Ｌ−グロン酸を分析し、か
つ液中に生菌数を測定した（測定法Ｆ）。 第３表は、こうした測定の結果を総括したもの
である。
グルコースの添加 SDS処理発酵液、過除菌発酵液（別途調製）
および無処理発酵液に対し、菌株（）の培養液
への添加開始直前にそれぞれ個別に予め滅菌して
おいたＤ−グルコース50％溶液を最終濃度が3.8
％になるように加えた。以後、２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の原料として使用する２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸発酵液を基質溶液と呼ぶ。 Ｄ 菌株（）による２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸からの２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産 () 種培地 Ｄ−グルコース 1.0％ バクト・イースト・エキストラクト
（Difco） 0.5％ バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ を含む水溶液のPHを前記と同様に7.0〜7.2に
調節し、500ml容の三角フラスコに50mlずつ
分注し、115℃で20分間滅菌する。 () 種培養 上記フラスコに、コリネバクテリウム・ス
ピーシーズ（FERM−P2770、ATCC31090）
より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株（FERM−BP108）を一白金耳
植菌し、20〜24時間培養（振幅71mm、回転数
270rpm、温度28℃）した。 () 本発酵培地 Ｄ−グルコース 2.0％ CSL 3.0％ 硝酸ソーダ（NaNO3） 0.2％ KH2PO4 0.1％ MgSO4・7H2O 0.02％ Ｐ−2000 0.01％ を含む水溶液のPHを前記と同様に7.0〜7.2に
調節し、培地450mlを115℃、20分間滅菌後、
予め滅菌した１発酵槽に添加した。 () 本発酵−(a) 上記の１発酵槽に、先の種培養液を約50
mlずつ植菌し、10〜16時間培養（通気量
600Nml／分、撹拌1740rpm、温度28℃）し
た。 () 本発酵−(b) FERM−BP108（）の培養液からグルコ
ースが消失した後、C.で調製した基準溶液を
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の最終濃度
が0.2％になるように加えた。以後培地中の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の減少を監
視しながら１回に添加する２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸の最終濃度が、約0.2％にな
るように、15分から120分の間隔で、基質溶
液を添加した。基質溶液の添加は、添加開始
後45時間目で停止し、さらに３時間培養を継
続し、添加開始後48時間目まで培養した。培
養液は適当な時期に、無菌的に採取し、採取
した培養液は必要に応じて次記Ｅの分析方法
によつて、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
および２−ケト−Ｌ−グロン酸を分析し、か
つ液中に生菌数を測定した（測定法Ｆ）。 第３表は、こうした測定の結果を総括したもの
である。
【表】
【表】
Ｅ 分析方法
() ２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−
Ｄ−グルコン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸 (イ) ガスクロマトグラフイー：カラム、
SE52（５％）；サンプル、トリメチルシリ
ル化；キヤリアーガス、ヘリウム；温度
160〜210℃。 (ロ) ペーパー・クロマトグラフイーまたは
薄層クロマトグラフイー 担体：東洋紙No.50または「TLCアル
ミシートセルロース」（メルク商品名） 展開溶媒：フエノール：蟻酸：水＝75：４：25 発色：AHF溶液（アニリン0.93ｇとフ
タール酸1.66ｇを水飽和ブタノール100
mlに溶解したもの）を噴霧し、105℃で
２分間処理して発色させる。 () グルコース：グルコースＢ−テスト
（和光純薬） Ｆ （）の生菌数測定： 培養液を無菌生理食塩水で希釈した後グリセ
リーブイヨン寒天培地に塗布し、28℃で24〜36
時間程度培養して生菌数を測定する。 注：（）は（）より生育速度が速いので、
多数の（）の中に混在する（）も容易に
分別測定出来る。 前記実験結果により、以下の事実が明らかとな
つた。すなわち、 (1) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵
液中の（）の殺菌剤として検討し種々の
界面活性剤のうちSDS（トデシル硫酸ナト
リウム）が殺菌効果において最も優れたも
のであつたこと（第２表参照）。 (2) 前記Ｃによつて調製した３種類の基質
溶液を用いて行つた２−ケト−Ｌ−グロン
酸生成実験（第３表参照）において、 () 未処理の基質溶液を添加した培養
系では、基質溶液添加開始後24時間を経
過したのち、（）の生菌数が105〜107
個／mlに達しており、一方２−ケト−Ｌ
−グロン酸の蓄積量は24時間以降、他の
２系と比較してほとんど増加していな
い。 () これに対し、SDS処理した基質溶
液を添加した培養系では、基質溶液添加
開始後48時間を経過しても、（）の生
菌数は104個／ml以下に抑制され、２−
ケト−Ｌ−グロン酸の蓄積量は約27mg／
mlに達している。 () この２−ケト−Ｌ−グロン酸の蓄
積量は、過除菌した基質溶液を添加し
た培養系における蓄積量と同等である。 () 過除菌した基質溶液を添加した
培養系では当然のことながら（）の生
菌は検出されず、２−ケト−Ｌ−グロン
酸の生産は支障なく進行している。 しかしながら、このような高濃度の２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の過除菌は実験室
規模に限つて可能であり、現在のところの工程を
工業的規模で経済的に実施することは不可能と考
えられている。
Ｄ−グルコン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸 (イ) ガスクロマトグラフイー：カラム、
SE52（５％）；サンプル、トリメチルシリ
ル化；キヤリアーガス、ヘリウム；温度
160〜210℃。 (ロ) ペーパー・クロマトグラフイーまたは
薄層クロマトグラフイー 担体：東洋紙No.50または「TLCアル
ミシートセルロース」（メルク商品名） 展開溶媒：フエノール：蟻酸：水＝75：４：25 発色：AHF溶液（アニリン0.93ｇとフ
タール酸1.66ｇを水飽和ブタノール100
mlに溶解したもの）を噴霧し、105℃で
２分間処理して発色させる。 () グルコース：グルコースＢ−テスト
（和光純薬） Ｆ （）の生菌数測定： 培養液を無菌生理食塩水で希釈した後グリセ
リーブイヨン寒天培地に塗布し、28℃で24〜36
時間程度培養して生菌数を測定する。 注：（）は（）より生育速度が速いので、
多数の（）の中に混在する（）も容易に
分別測定出来る。 前記実験結果により、以下の事実が明らかとな
つた。すなわち、 (1) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵
液中の（）の殺菌剤として検討し種々の
界面活性剤のうちSDS（トデシル硫酸ナト
リウム）が殺菌効果において最も優れたも
のであつたこと（第２表参照）。 (2) 前記Ｃによつて調製した３種類の基質
溶液を用いて行つた２−ケト−Ｌ−グロン
酸生成実験（第３表参照）において、 () 未処理の基質溶液を添加した培養
系では、基質溶液添加開始後24時間を経
過したのち、（）の生菌数が105〜107
個／mlに達しており、一方２−ケト−Ｌ
−グロン酸の蓄積量は24時間以降、他の
２系と比較してほとんど増加していな
い。 () これに対し、SDS処理した基質溶
液を添加した培養系では、基質溶液添加
開始後48時間を経過しても、（）の生
菌数は104個／ml以下に抑制され、２−
ケト−Ｌ−グロン酸の蓄積量は約27mg／
mlに達している。 () この２−ケト−Ｌ−グロン酸の蓄
積量は、過除菌した基質溶液を添加し
た培養系における蓄積量と同等である。 () 過除菌した基質溶液を添加した
培養系では当然のことながら（）の生
菌は検出されず、２−ケト−Ｌ−グロン
酸の生産は支障なく進行している。 しかしながら、このような高濃度の２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の過除菌は実験室
規模に限つて可能であり、現在のところの工程を
工業的規模で経済的に実施することは不可能と考
えられている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属に属する２−ケト−Ｌ
−グロン酸生産菌株（）より誘導した５−ケト
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）を培地中
に生育させ、この培地中に、２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸含有培養液を添加したうえ、培養を
継続して、混合培養液中に２−ケト−Ｌ−グロン
酸を生成蓄積させ、これを採取する２−ケト−Ｌ
−グロン酸の製造方法において、２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸含有培養液の添加に先立つて、
該培養液中に存在する２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸生産菌株（）を界面活性剤を用いて殺菌
することを特徴とする方法。 ２ 該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 ３ 該２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有培養
液に対するSDSの添加濃度が0.01〜0.25％（ｗ／
ｖ）の範囲にあることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 ４ ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株
（）がグルコノバクター属あるいはエルウイニ
ア属に属するものであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3545482A JPS58152492A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 |
| US06/469,780 US4543331A (en) | 1982-03-05 | 1983-02-25 | Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid |
| DK103583A DK161106C (da) | 1982-03-05 | 1983-02-28 | Fremgangsmaade til fremstilling af 2-keto-l-gulonsyre |
| DE8383102164T DE3364468D1 (en) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid and mutants therefor |
| HU83755A HU195536B (en) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | Process for producing 2-keto-l-gulonic acid |
| KR1019830000883A KR900009051B1 (ko) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | 2-케토-l-굴론산의 제조방법 |
| ES520323A ES520323A0 (es) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | Un procedimiento mejorado para preparar acido 2-ceto-l-gulonico. |
| AU12050/83A AU562910B2 (en) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid |
| EP83102164A EP0088408B1 (en) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid and mutants therefor |
| IE487/83A IE54704B1 (en) | 1982-03-05 | 1983-03-07 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid |
| GB08306232A GB2116549B (en) | 1982-03-05 | 1983-03-07 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid |
| CA000422970A CA1200220A (en) | 1982-03-05 | 1983-03-07 | Process for preparing 2-keto-l-gulonic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3545482A JPS58152492A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58152492A JPS58152492A (ja) | 1983-09-10 |
| JPH0369515B2 true JPH0369515B2 (ja) | 1991-11-01 |
Family
ID=12442245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3545482A Granted JPS58152492A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58152492A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104971679A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-14 | 开平市开物化工建材有限公司 | 智能聚合硫酸铝铁制备及固化装置 |
-
1982
- 1982-03-05 JP JP3545482A patent/JPS58152492A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104971679A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-14 | 开平市开物化工建材有限公司 | 智能聚合硫酸铝铁制备及固化装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58152492A (ja) | 1983-09-10 |
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