DK173507B1

DK173507B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre

Info

Publication number: DK173507B1
Application number: DK198904599A
Authority: DK
Inventors: Tatsuo Hoshino; Setsuko Nomura; Teruhide Sugisawa
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-18
Publication date: 2001-01-15
Also published as: DE68915692T2; ATE106451T1; EP0366922B1; DK459989A; DE68915692D1; DK459989D0; JPH02150287A; EP0366922A1; US4960695A; JP2825551B2

Description

i DK 173507 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ved fermentativ omdannelse af L-sorbose med et høj t udbyt te.

2-Keto-L-gulonsyre er et vigtigt mellemprodukt ved fremstillingen af 5 L-ascorbinsyre, som den kan omdannes til ved den velkendte Reich-stein-metode.

Fermentativ fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra D-sorbitol eller L-sorbose er kendt.

JP 40154/1976 beskriver således fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud 10 fra D-sorbitol ved hjælp af mikroorganismer af slægten Acetobacter,

Bacterium eller Pseudomonas, som er i stand til at oxidere D-sorbitol under aerobe betingelser, hvorved der fremstilles 2-keto-L-gulonsyre. Udbyttet ved denne kendte fremgangsmåde er imidlertid temmeligt ringe, nemlig mindre end 6 g/1.

15 Ifølge en anden kendt fremgangsmåde, der er beskrevet i "Acta Micro-biologica Sinica" 21(2), 185-191 (1981), kan 2-keto-L-gulonsyre fremstilles ud fra L-sorbose ved hjælp af en blandet mikroorganisme-kultur, der omfatter Pseudomonas striata og Gluconobacter oxydans; udbyttet er 30 g/1, når man starter med en koncentration på 70 g/1 L-20 sorbose, og 37 g/1, når man starter med en koncentration på 100 g/1 L-sorbose.

Desuden beskriver EP 221 707 fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose ved hjælp af Pseudogluconobacter saccharoketogenes med og uden ledsagende bakterier. Imidlertid er udbyttet ved denne kendte 25 fremgangsmåde ved hjælp af Pseudogluconobacter saccharoketogenes i sig selv højst 55,3-87,6 g/1 (omdannelsesgrad: 34,2-54,1¾) (se side 13, tabel 4, i EP 221 707).

EP 278 447 beskriver også en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose ved hjælp af en blandet mikroorga-30 nismekultur, hvoriblandt én har de identificerende træk af DSM nr.

4025, og en anden har de identificerende træk af DSM nr. 4026 (en Bacillus megaterium-stamme). Selv om den mikroorganisme, der har de 2 DK 173507 B1 identificerende træk af DSM nr. 4025, især DSM nr. 4025 i sig selv, som sådan i det væsentlige ikke har nogen evne til at vokse og producere 2-keto-L-gulonsyre, vokser den blandede kultur, der som anden bestanddel indeholder en Bacillus megaterium-mikroorganisme, faktisk 5 og producerer 2-keto-L-gulonsyre i udbytter på 40 g/1 og derover.

Således blev tilstedeværelsen af den anden mikroorganismebestanddel (Bacillus megaterium) betragtet som værende essentiel for udøvelsen af den fremgangsmåde, der er beskrevet i EP 278 447.

EP 213591 A2 beskriver stammer af Gluconobacter oxidans, som i nær-10 værelse af gærekstrakt kan producere 2-keto-L-gulonsyre ved fermenta-tiv omdannelse af L-sorbose. Disse kendte stammer er dog ikke i stand til at producere 2-keto-L-gulonsyre med et udbytte på over 70 g/1.

Den foreliggende opfindelse bygger på den overraskende erkendelse, at det er muligt at fremstille 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose under 15 anvendelse af Gluconobacter oxidans stamme DSM nr. 4025, uden samtidig anvendelse af en anden mikroorganisme, dvs. Bacillus megaterium.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ved fermentativ omdannelse af L-sorbose under anvendelse af Gluconobacter oxidans stamme DSM nr. 4025, der 20 som sådan i det væsentlige ikke har nogen evne til at vokse og producere 2-keto-L-gulonsyre, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en ren kultur af mikroorganismen, og at fermenteringen udføres i nærværelse af gær eller et gærprodukt som medie-bestanddel.

25 Ifølge den foreliggende opfindelse er det muligt at fremstille 2- keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose i et væsentligt forbedret udbytte, nemlig et udbytte på over 72 g/1 (omdannelsesgrad: 93,7%), når der startes med en L-sorbosekoncentration på 80 g/1, og endog over 100 g/1 (omdannelsesgrad: 92,8%), når der startes med en L-sorbose-30 koncentration på 100 g/1, og i højere udbytter, når der startes med højere koncentrationer. Omdannelsesgraden beregnes på grundlag af de producerede mængder 2-keto-L-gulonsyre og det forbrugte L-sorbose.

3 DK 173507 B1

Den mikroorganismestamme, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er Gluconobacter oxidans stamme DSM nr. 4025, der som sådan i det væsentlige ingen evne har til at vokse og producere 2-keto-L-gulonsyre. De vigtigste identificerende træk er: 5 negativ oxidase-test; ethanol oxideres til eddikesyre; D-glucose oxideres til D-gluconsyre og 2-keto-D-gluconsyre; ketogenese af polyalkoholer; dihydroxyacetone produceres i det væsentlige ikke ud fra glycerol; 2-keto-D-glucarsyre produceres ud fra D-sorbi-tol og D-glucarsyre, men ikke ud fra D-glucose, D-fructose, D-10 gluconsyre, D-mannitol eller 2-keto-D-gluconsyre; polymorf, tilsyneladende ingen flageller; brunt pigment produceres ud fra fructose; god vækst ved samdyrkning i nærværelse af Bacillus megaterium eller en celleekstrakt deraf; streptomycin-følsom.

Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en ren kultur af mikroor-15 ganismen. Udtrykket "en ren kultur af mikroorganismen" betegner en kultur, som kun indeholder mikroorganismen uden nogen andre samtidige mikroorganismer såsom Pseudomonas striata og Bacillus megaterium, hvorved den adskiller sig fra de kulturer, der anvendes ved de fremgangsmåder, som er beskrevet i "Acta Microbiologica Sinica" 21(2), 20 185-191 (1981) som nævnt ovenfor og i EP 278 447, hvor anvendelsen af blandede kulturer er beskrevet.

Den anvendte mikroorganismestamme er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gottingen med DSM nr. 4025 den 17. marts 1987 i henhold til Budapest-Traktaten (dette Instituts nuværende adresse er: 25 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Masche-roder Weg lb, D-3300 Braunschweig, Forbundsrepublikken Tyskland).

Cellerne af DSM nr. 4025-mikroorganismen er stavformede med afrundede ender. Diameteren af en celle af mikroorganismen er i gennemsnit ca.

0,3-0,6 /im, længden ca. 0,9-1,6 jim, især 1-1,5 μιη.

30 I en foretrukken udførelsesform af den foreliggende opfindelse udføres fremstillingen af 2-keto-L-gulonsyre ved dyrkning af den ovenfor nævnte mikroorganisme i et medium, der indeholder L-sorbose og gær eller et gærprodukt samt passende næringsstoffer. Alternativt kan DK 173507 B1 4 denne fremgangsmåde udføres ved dyrkning af mikroorganismen i ovennævnte medium, hvorefter de hele celler, der isoleres fra kulturen, eller en cellefri ekstrakt deraf bringes i kontakt med L-sorbose.

Den gær, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter en 5 hvilken som helst gær, der tilhører underklassen Ascomycetes, især slægten Saccharomyces såsom Saccharomyces cerevisiae (bagergær), Saccharomyces carlsbergensis (Saccharomyces uvarum) (bryggerigær) eller Saccharomyces sake, eller slægten Schizosaccharomyces såsom Schizosaccharomyces pombe, eller slægten Pichia såsom Pichia mem-10 branaefaciens, eller slægten Hansenula såsom Ransenula anomala, eller gær hørende til underklassen Hyphomycetes, især slægten Candida såsom Candida tropicalis eller Candida utilis, eller slægten Torulopsis såsom Torulopsis versatilis (Candida versatilis) eller Torulopsis holmii (Candida holmii), eller et gærprodukt deraf. De ovenfor nævnte 15 gærstammer er frit tilgængelige fra deponeringsinstitutioner eller fra kommercielle kilder. Således kan de ovenfor nævnte gærstammer, der tilhører arten Saccharomyces cerevisiae, fås fra private firmaer, fx i form af bagergær. Fx kan følgende typer bagergær fås fra følgende firmaer: 20 Oriental-gær (Oriental Yeast Co.)

Kaneka-gær (Kanegafuchi Chemical Industry Co.)

Daiya-gær (Kyowa Hakko Kogyo Co.)

Sankyo-gær (Sankyo Co.)

Chuetsu-gær (Chuetsu Yeast Co.) 25 Yeast 45 (Toyo Jozo Co.)

Nitten-gær (Nippon Beet-Sugar Co.)

Desuden kan følgende gærstammer også fås hos IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan):

Saccharomyces cerevisiae IFO 1234 30 Saccharomyces carlsbergensis IFO 0565 (Saccharomyces uvarum)

Saccharomyces sake IFO 0309

Candida tropicalis IFO 1400

Candida utilis IFO 0396 DK 173507 B1 5

Toirulopsis versaCilis IFO 10056 (Candida versatilis)

Torulopsis holmii IFO 1629 (Candida holmii) 5 Schizosaccharomyces pombe IFO 0362

Pichia membranaefaciens IFO 10215

Hansenula anomala IFO 10213

Det er essentielt, at den gær, der anvendes ved den foreliggende fremgangsmåde, indeholder vækstfaktorer for de mikroorganismer, der 10 anvendes ifølge den foreliggende opfindelse. De almindelige egenskaber for sådanne vækstfaktorer er varmestabilitet og opløselighed i vand.

Den gær eller de gærprodukter, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter såkaldt "frisk gær", tørgær, gærekstrakt og 15 lignende. Udtrykket "frisk gær" betegner i nærværende sammenhæng gærceller, der netop er opsamlet fra dyrkningsvæsken ved hjælp af centrifugering, filtrering eller lignende. Bagergær, således som det forhandles i almindelig form, er en specifik repræsentant for en sådan "frisk gær". Imidlertid kan der ved fremgangsmåden ifølge op-20 findelsen også med fordel anvendes frisk gær såsom bagergær efter opvarmning ved fx 121eC. Faktisk foretrækkes anvendelse af steriliseret gær, da levende gær vil metabolisere en del af det L-sorbose, der benyttes som substrat, og derved reducere 2-KGA-udbyttet. Således udgør anvendelse af steriliseret gær såsom steriliseret bagergær en 25 særlig foretrukken udførelsesform af den foreliggende opfindelse.

Hvis mikroorganismen dyrkes i et næringsmedium indeholdende L-sorbose samt gær eller et gærprodukt, dyrkes mikroorganismen hensigtsmæssigt i et vandigt medium under aerobe betingelser.

Koncentrationen af den ovenfor nævnte gær ifølge den foreliggende 30 opfindelse er fortrinsvis fra ca. 5 g/1 til ca. 150 g/1 beregnet efter vådvægt i mediet, især fra ca. 20 g/1 til ca. 100 g/1 beregnet efter vådvægt i mediet.

DK 173507 B1 6

Den foreliggende fermenteringsfremgangsmåde kan udføres ved en pH mellem ca. 4,0 og 9,0, fortrinsvis mellem ca. 6,0 og 8,0.

Et foretrukket temperaturområde til udførelse af den foreliggende fermenteringsfremgangsmåde er mellem ca. 13 og 36“C. Især udføres den 5 foreliggende fermenteringsfremgangsmåde ved en temperatur mellem ca.

18 og 33eC.

Selv om fermenteringsperioden kan variere afhængigt af anvendt pH, temperatur og næringsmedium, giver 2-5 dage sædvanligvis gunstige resultater.

10 Koncentrationen af det L-sorbose, der anvendes som udgangsmateriale ved den foreliggende fremgangsmåde, kan variere mellem ca. 20 og 250 g/1, fortrinsvis mellem ca. 50 og ca. 200 g/1.

Det ved den foreliggende fermenteringsfremgangsmåde anvendte dyrkningsmedium indeholder sædvanligvis næringsstoffer for mikroorganis-15 merne såsom assimilerbare carbonkilder, fordøjelige nitrogenkilder og uorganiske stoffer, vitaminer, sporelementer og andre vækstfremmende faktorer. Ud over L-sorbose, der anvendes som udgangsmateriale ved den foreliggende fremgangsmåde, kan der også tilsættes andre stoffer, som er carbonkilder, såsom glycerol, D-glucose, D-mannitol, 20 D-fructose, D-arabitol og lignende.

Forskellige organiske eller uorganiske stoffer kan også anvendes som nitrogenkilder ved den foreliggende fremgangsmåde såsom kødekstrakt, pepton, casein, maj sstøbevæske, urinstof, aminosyrer, nitrater, ammoniumsalte og lignende. Som uorganiske stoffer kan der anvendes 25 magnesiumsulfat, kaliumphosphat, ferro- og ferrichlorider, calcium-carbonat og lignende.

I det tilfælde, hvor der benyttes fordyrkede hele celler, som er opsamlet fra kulturen, udføres dyrkningen af mikroorganismen under de samme eller lignende betingelser som beskrevet ovenfor. Disse hele 30 celler anvendes i et vandigt medium under aerobe betingelser, og ingen yderligere næringsstoffer (ud over det L-sorbose, der anvendes som udgangsmateriale) er nødvendige.

DK 173507 B1 7

Hvis der anvendes cellefrie ekstrakter fra kulturen, sattes disse ekstrakter til substratet i et vandigt medium og anvendes ved omdannelsen af L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre under aerobe betingelser på lignende måde som anført ovenfor, og i dette tilfælde er yderlige-5 re næringsstoffer heller ikke nødvendige.

Den 2-keto-L-gulonsyre, der fås ved den foreliggende fremgangsmåde, kan fx isoleres fra reaktionsblandingen ved dannelse af et salt eller under anvendelse af forskelle i egenskaber mellem produktet og de omgivende urenheder såsom opløselighed, absorberbarhed og distributi-10 onskoefficient mellem opløsningsmidlerne. Adsorption, fx på ionbyt-terharpikser, udgør en hensigtsmæssig metode til isolering af produktet. Det således vundne produkt kan oprenses yderligere på konventionel måde, fx ved omkrystallisation eller kromatografi.

Alternativt kan reaktionsblandingen anvendes direkte til omdannelse 15 til L-ascorbinsyre ved esterificering, efterfulgt af enolisering og lactonisering.

Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 20 Et podedyrkningsmedium indeholdende 8,02 L-sorbose (separat steriliseret), 0,052 glycerol, 0,252 MgS04*7H20, 1,752 maj sstøbevæske, 0,252 gærekstrakt B-II (Oriental Yeast Co.), 0,52 CaC03 og 0,52 urinstof (separat steriliseret) (pH 7,0 før sterilisation) blev fordelt i reagensglas (5 ml i hver) og steriliseret ved 121°C i 20 minutter. I 25 dette podedyrkningsmedium blev der inokuleret et podeøjefuld celler af mikroorganismen DSM nr. 4025, der var dyrket på et skråkulturmedi-tun indeholdende 3,02 glycerol, 0,252 MgS04*7H20, 1,752 majsstøbevæske, 0,252 gærekstrakt B-II, 0,52 CaC03, 0,52 urinstof (separat steriliseret) og 2,02 agar (pH 7,0 før sterilisation) ved 27°C i 4 dage, 30 og mediet blev inkuberet ved 30°C i 24 timer. Den resulterende podekultur blev inokuleret i 50 ml af det samme podedyrkningsmedium som DK 173507 B1 8 beskrevet ovenfor i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberet i 24 timer ved 30eC. Det basale produktionsmedium (50 ml) indeholdende 8,0% L-sorbose (steriliseret separat), 0,05% glycerol, 1,0% urinstof (steriliseret separat), 0,25% MgS04*7H20, 1,5% CaCOj og 3,0% majsstøbe-5 væske blev tilsat 0,5% gærekstrakt B-II og/eller 5% bagergær (Oriental Yeast Co.) i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe og steriliseret ved 121eC i 20 minutter. Disse produktionsmedier tilsattes hver 5 ml af den ovenfor fremstillede podekultur og blev inkuberet ved 30°C i 4 dage ved en agitationshastighed på 180 omdr./minut.

10 Ved højtryksvæskekromatografisk analyse blev indholdet af 2-keto-L-gulonsyre (2-KGA) i dyrkningsvæsken tilsat bagergær bestemt til at være 72,1 g/1 (omdannelsesgrad: 93,7%). På den anden side var 2-KGA-indholdet i de væsker, der var tilsat gærekstrakt B-II og gærekstrakt B-II/bagergær henholdsvis 57,1 (omdannelsesgrad: 88,8%) og 64,9 g/1 15 (omdannelsesgrad: 94,4%).

EKSEMPEL 2

Et podedyrkningsmedium indeholdende 8,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 0,25% MgSO^^^O, 1,75% majsstøbevæske, 5,0% bagergær, 0,5% CaCOj og 0,5% urinstof (separat steriliseret) (pH 7,0 20 før sterilisation) blev fordelt i reagensglas (5 ml i hver) og steriliseret ved 121°C i 20 minutter. I dette podedyrkningsmedium blev der inokuleret et podeøjefuld celler af mikroorganismen DSM nr. 4025, der var dyrket på et skråkulturmedium indeholdende 5,0% D-mannitol, 0,25% MgSO^*7H20, 1,75% maj sstøbevæske, 0,25% bagergær, 0,5% CaC03, 0,5% 25 urinstof (separat steriliseret) og 2,0% agar (pH 7,0 før sterilisation) ved 27°C i 4 dage, og mediet blev inkuberet ved 30°C i 24 timer. Den resulterende podekultur blev inokuleret i 50 ml af det samme podedyrkningsmedium som beskrevet ovenfor i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberet i 24 timer ved 30°C. Det basale produktionsmedium 30 (50 ml) indeholdende 10,0% L-sorbose (steriliseret separat), 0,05% glycerol, 1,6% urinstof (steriliseret separat), 0,25% MgSO^^^O, 1,5% CaCOj og 3,0% majsstøbevæske blev tilsat de i tabel i anførte gærtyper i 500 ml Erlenmeyer-kolber og steriliseret i 20 minutter ved 121°C. Disse produktionsmedier blev tilsat 5 ml hver af podekulturen DK 173507 B1 9 som fremstillet ovenfor og inkuberet ved 30eC i 4 dage med en agitationshastighed på 180 omdr./minut.

2-KGA-værdier i kolber under forskellige betingelser er angivet i tabel 1.

5 TABEL 1

Virkning af forskellige gærtyper anvendt som medie-bestanddel på 2-KGA-produktion

Resterende Celle- 10 Mængde 2-KGA L- sorbose vækst Gærtyper Kilde (%) (g/1) (g/1) Gærekstrakt B-II Oriental 0,25 68,5 31,1 + 15 0,5 74,1 25,3 + Gærpulver HG Oriental 0,25 75,6 23,0 + (tørgær) 0,5 79,4 20,9 +

Yeasta 20A Bovril*) 0,25 84,2 15,3 ++ 20 (tørgær) 0,5 87,3 12,0 ++

Saf-instant S.I. Le- 0,25 81,1 17,4 ++ (tørgær) saffre^) 0,5 86,0 13,8 ++

Oriental- Oriental 0,25 76,8 21,3 ++ tørgær 0,5 86,5 13,7 ++ 25 Bagergær Oriental 5,0 93,5 8,9 +++ (S. cerevL- 6,25 97,2 4,4 +++ siae)

Ingen 0 4,0 93,0 ±

Grad af vækst: ± dårlig -» +++ god 1) Saccharomyces cerevisiae fra Oriental Yeast Co.

2) Bagergær DK 173507 B1 EKSEMPEL 3 10 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet en podekultur, som blev inokuleret i 50 ml af et produktionsmedium indeholdende 9,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 3,0% 5 majsstøbevæske, 1,4% urinstof (separat steriliseret), 5,6% bagergær, 0,25% MgS04*7H20 og 1,5% CaC03 i en 500 ml Erlenmeyer-koble og inkuberet ved 30°C i 4 dage med en agitationshastighed på 180 omdr./mi-nut.

Som resultat heraf blev der produceret 89,0 g/1 (omdannelsesgrad: 10 91,8%) 2-KGA.

EKSEMPEL 4 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet en podekultur, som blev inokuleret i 50 ml af et produktionsmedium indeholdende 10,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 15 3,0% majsstøbevæske, 1,6% urinstof (separat steriliseret), 6,25% bagergær, 0,25% MgS0^»7H20 og 1,5% CaCOj i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberet ved 30eC i 4 dage med en agitationshastighed på 180 omdr./minut.

Som resultat heraf blev der produceret 97,2 g/1 (omdannelsesgrad: 20 90,2%) 2-KGA.

EKSEMPEL 5 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet en podekultur, som blev inokuleret i 50 ml af et produktionsmedium indeholdende 12,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 25 3,0% majsstøbevæske, 1,9% urinstof (separat steriliseret), 7,5% ba gergær, 0,25% MgSO4»7H20 og 1,5% CaCOj i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberet ved 30eC i 4 dage med en agitationshastighed på 180 omdr./minut.

DK 173507 B1 11

Som resultat heraf blev der produceret 98,5 g/1 (omdannelsesgrad: 89,4%) 2-KGA.

EKSEMPEL 6 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet en 5 podekultur, som blev inokuleret i 50 ml af et produktionsmedium

Indeholdende 8,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 3,0% majsstøbevæske, 1,25% urinstof (separat steriliseret), 0,25%

MgS0£»7H20, 1,5% CaCOj og 2-5% bagergær og inkuberet ved 30eC i 3-4 dage.

10 Det fremgår af tabel 2, at der blev produceret 82,6 g/1 (omdannelsesgrad: 95,8%) 2-KGA efter 4 dages inkubation i mediet, der var tilsat 4% bagergær.

TABEL 2

Virkning af koncentration af bagergær 15 på 2-KGA-produktion

Produceret 2-KGA (g/1)

Bagergær 3 dage 4 dage (Omdannelse: %) 20 2 75,1 77,5 (95,4) 3 80,6 81,3 (94,3) 4 81,6 82,6 (95,8) 5 81,8 82,6 (95,8) 25 EKSEMPEL 7 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet 200 ml af en podekultur. En 3 liters krukkefermentor blev tilsat 1,2 liter basalt medium indeholdende 0,05% glycerol, 3,0% majsstøbevæske, 5,0% bagergær og 0,25% MgS04*7H20 for at komme op på 2,0 liter, og det DK 173507 B1 12 hele blev steriliseret ved 121eC i 20 minutter. 8% L-sorbose (slut-koncentration) og 1,25% urinstof (slutkoncentration) blev separat steriliseret og tilsat fermentoren. Efter inokulering med podekulturen blev kulturvolumenet indstillet til 2 liter ved tilsætning af 5 steriliseret vand. Fermenteringen blev udført ved 30°C og 800 omdr./-minut til agitation og 1 liter/minut til beluftning. Kulturens pH blev holdt på 7,0 med 4N Na2C03· I løbet af 40 timers fermentering blev der produceret 84 g/1 (omdannelsesgrad: 97,4%) 2-KGA.

10 EKSEMPEL 8 På samme måde som beskrevet i eksempel 7 blev der udført en 3 liters krukkefermentering i et medium indeholdende 10,0% L-sorbose, 1,6% urinstof, 0,05% glycerol, 0,25% MgS04*7H20, 3,0% maj sstøbevæske og 6,25% bagergær.

15 Som resultat heraf blev der i løbet af 50 timers fermentering produceret 100,0 g/1 (omdannelsesgrad: 92,8%) 2-KGA.

EKSEMPEL 9 På samme måde som beskrevet i eksempel 7 blev der udført en 3 liters krukkefermentering i et medium indeholdende 12,0% L-sorbose, 1,9% 20 urinstof, 0,05% glycerol, 0,25% MgSO^^^O, 3,0% maj s støbevæske og 7,5% bagergær.

Som resultat heraf blev der i løbet af 75 timers fermentering produceret 98,0 g/1 (omdannelsesgrad: 92,3%) 2-KGA. 21,5 g/1 L-sorbose forblev uopbrugt.

EKSEMPEL 10 DK 173507 B1 13

En 3 liters krukkefermentering blev startet på samme måde som beskrevet i eksempel 7. Samtidigt blev 80 g L-sorbose solubiliseret i 400 ml vand og steriliseret ved 121eC i 20 minutter, hvorefter det 5 kontinuerligt blev ført ind i fermentoren med en hastighed på ca, 11 ml/minut fra 6-42 timers fermentering. Efter afslutning af L-sorbose-tilførslen blev fermenteringen fortsat i yderligere 25 timer. Den samlede fermenteringsperiode var 67 timer. I dyrkningsvæsken (2,6 liter) blev der produceret 95 g/1 2-KGA. I alt blev der produceret 10 247 g 2-KGA ud fra 240 g L-sorbose. Molær omdannelsesgrad: 95,5%.

EKSEMPEL 11

En 3 liters krukkefermentering blev startet på samme måde som beskrevet i eksempel 7. På den anden side blev 120 g L-sorbose solubiliseret i 400 ml vand og steriliseret ved 121eC i 20 minutter, hvorefter 15 det kontinuerligt blev ledt ind i fermentoren med en hastighed på ca.

11 ml/minut fra 6 timers til 42 timers fermentering. Efter afslutning af L-sorbosetilførsien blev fermenteringen fortsat i yderligere 35 timer. Den samlede fermenteringsperiode var 77 timer. I dyrknings- væsken (2,7 liter) blev der produceret 104 g/1 2-KGA. I alt blev der 20 produceret 280,8 g 2-KGA ud fra 280 g L-sorbose. Molær omdannelsesgrad: 93,1%.

EKSEMPEL 12

En 3 liters krukkefermentering blev startet på samme måde som beskrevet i eksempel 7. På den anden side blev 160 g L-sorbose solubilise-25 ret i 400 ml vand og steriliseret ved 121 ®C i 20 minutter, hvorefter det kontinuerligt blev ledt ind i fermentoren med en hastighed på ca.

11 ml/minut fra 6 timers til 42 timers fermentering. Efter afslutning af L-sorbosetilførslen blev fermenteringen fortsat i yderligere 49 timer. Den samlede fermenteringsperiode var 91 timer. I dyrknings- 30 væsken (2,7 liter) blev der produceret 110 g/1 2-KGA. I alt blev der DK 173507 B1 14 produceret 297 g 2-KGA ud fra 320 g L-sorbose. Molær omdannelsesgrad: 86,1%.

EKSEMPEL 13 På samme måde som beskrevet i eksempel 2 blev der fremstillet en 5 podekultur. 5 ml af hver af podekulturerne blev inokuleret i 50 ml produktionsmedier indeholdende 10% L-sorbose (steriliseret separat), 0,05% glycerol, 1,6% urinstof (steriliseret separat), 0,25%

MgS0^*7H20, 3,0% majsstøbevæske, 1,5% CaCOj og 6,25% bagergær fra forskellige leverandører som anført i tabel 3 i 500 ml Erlenmeyer-10 kolber. Fermenteringen blev udført ved 30°C i 4 dage med en agitationshastighed på 180 omdr./minut. Resultaterne er vist i tabel 3.

TABEL 3

Virkning af forskellige typer bagergær på 2-KGA-produktion 15 Type 2-KGA (Omdannelse) Resterende bagergær (g/1) (%) L-sorbose (g/1)

Oriental-gær 97,2 (94,4) 4,4

Kaneka-gær 91,4 (90,5) 6,3 20 Daiya-gær 94,6 (92,3) 4,9

Sankyo-gær 87,4 (88,7) 8,6

Chuhetsu-gær 93,7 (92,2) 5,7

Yeast 45 90,1 (89,5) 6,6

Nitten-gær 97,2 (93,8) 3,8 25 __ EKSEMPEL 14

Et basalt produktionsmedium (5 ml), der indeholdt 8% L-sorbose (steriliseret separat), 0,05% glycerol, 1,25% urinstof (steriliseret separat), 0,25% MgSO^»7H20, 1,5% CaCOj og 3,0% majsstøbevæske (pH 7,5 30 før sterilisation), blev tilsat gærceller (5% vådvægt/volumen), for- DK 173507 B1 15 delt i reagensglas (1,8 x 20 cm) og steriliseret ved 121“C i 20 minutter. Som gærceller anvendtes kulturer af Saccharomyces sake IFO 0309, Schizosaccharomyces pombe IFO 0362, Saccharomyces carlsbergen-sis IFO 0565, Saccharomyces cerevisiae IFO 1234, Candida utilis IFO 5 0396, Candida tropicalis IFO 1400, Torulopsis holmii IFO 1629, Toru- lopsis versatilis IFO 10056, Hansenula anomala IFO 10213 og Pichia membranaefaciens IFO 10215 på et agardyrkningsmedium indeholdende 1,0% maltekstrakt (Difco), 0,1% gærekstrakt (Difco), 0,1% soytone (Difco), 1,0% glucose og 2,0% agar, der var dyrket ved 27eC i 4 dage, 10 I hvert af produktionsmedierne blev der inokuleret 0,5 ml af podekulturerne af mikroorganismen DSM nr. 4025, der var fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 2, og det hele blev inkuberet ved 30eC i 4 dage.

2-KGA-værdierne i reagensglas under forskellige betingelser er vist i 15 tabel 4.

TABEL 4 16 DK 173507 B1

Virkning af gærtyper hørende til slægterne Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Hansenula og Pichia anvendt som mediebestanddel på 2-KGA-produktion 5 _

Resterende Mængde 2-KGA L-sorbose Gærtyper (%) (g/1) (g/1) 10 Saccharomyces sake 5,0 74,37 5,56 IFO 0309

Schizosaccharomyces pomhe 5,0 77,99 1,46 IFO 0362

Saccharomyces carlsbergensis 5,0 70,82 2,61 15 IFO 0565

Saccharomyces cerevisiae 5,0 72,39 3,89 IFO 1234

Candida utilis 5,0 71,05 0 IFO 0396 20 Candida tropicalis 5,0 80,95 2,91 IFO 1400

Torulopsis holmii 5,0 72,20 6,32 IFO 1629

Torulopsis versaCilis 5,0 78,01 0 25 IFO 10056

Hansenula anomala 5,0 75,91 1,97 IFO 10213

Pichia membranaefaciens 5,0 65,56 12,78 IFO 10215 30 ______

REFERENCEEKSEMPEL

Et podedyrkningsmedium SI indeholdende 8,0% L-sorbose (separat steriliseret), 0,05% glycerol, 0,25% MgSO^»?!^, 1,5% gærekstrakt B-II og 1,5% CaCOj (separat steriliseret) (pH 7,0 før sterilisation) blev

Claims

15 Det opnåede 2-KGA-udbytte var 12,8 g/1 i tilfælde af dyrkningsmedium SI og 10,2 g/1 i tilfælde af dyrkningsmedium S2. Dette viser, at Gluconobacter oxydans U-13 (FERM-BP nr. 1269), der i form af en ren kultur har evne til at vokse og producere 2-KGA, ikke gav 2-KGA i højt udbytte i gærholdige produktionsmedier.

20 PATENTKRAV ,1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ved fermenta-tiv omdannelse af L-sorbose under anvendelse af Gluconobacter oxidans DSM nr. 4025, der som sådan i det væsentlige ikke har nogen evne til at vokse og producere 2-keto-L-gulonsyre, 25 kendetegnet ved, at der som den eneste mikroorganisme udover gær anvendes en ren kultur af mikroorganismen, og at fermenteringen udføres i nærværelse af gær eller et gærprodukt som medie-bestanddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 30 kendetegnet ved, at der som mediebestanddel anvendes gær, der tilhører underklassen Ascomycetes, især slægten Saccharomyces såsom Saccharomyces cerevisiae (bagergær), Saccharomyces carlsbergen-sis (Saccharomyces uvarum) (bryggerigær) eller Saccharomyces sake, DK 173507 B1 eller slægten Schizosaccharomyces såsom Schizosaccharomyces pombe, eller slægten Pichia såsom Pichia membranaefaciens, eller slægten Hansenula såsom Hansenula anomala, eller gær hørende til underklassen Hyphomycetes, især slægten Candida såsom Candida tropicalis eller 5 Candida utilis, eller slægten Torulopsis såsom Torulopsis versatilis (Candida versatilis) eller Torulopsis holmii (.Candida holmii), eller et gærprodukt deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der som mediebestanddel anvendes frisk 10 gær, fortrinsvis efter sterilisation.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gæren anvendes i en koncentration på fra ca. 5 g/1 til ca. 150 g/1 beregnet efter vådvægt, fortrinsvis fra ca. 20 g/1 til ca. 100 g/1 beregnet efter vådvægt.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at L-sorbose anvendes i en koncentration på fra ca. 20 g/1 til ca. 250 g/1, fortrinsvis fra ca. 50 g/1 til ca. 200 g/1.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, 20 kendetegnet ved, at 2-keto-L-gulonsyre produceres med et udbytte på mindst 72 g/1, fortrinsvis mindst 100 g/1.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at fermenteringen udføres ved en pH mellem ca. 4,0 og 9,0, fortrinsvis mellem ca. 6,0 og 8,0.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at fermenteringen udføres ved en temperatur mellem ca. 13 og 36eC, fortrinsvis mellem ca. 18 og 33°C.