JP2825551B2 - 発酵方法 - Google Patents

発酵方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌ−ソルボースから、発酵変換により高収
率で２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造する方法に関する。
２−ケト−Ｌ−グロン酸は、良く知られているライヒ
シユタイン法を用いるＬ−アスコルビン酸の製造方法に
おける重要な中間体である。
Ｄ−ソルビトールやＬ−ソルボースからの２−ケト−
Ｌ−グロン酸の発酵による製造方法は、これまでに知ら
れている。
すなわち、日本特許出願広告昭51−40154号におい
て、Ｄ−ソルビトールを好気的条件下において酸化する
能力を有するアセトバクター（Acetobacter）属、バク
テリウム（Bacterium）属もしくはシユウドモナス（Pse
udomonas）属に属する微生物をもちいてＤ−ソルビトー
ルから２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造する方法が開示さ
れている。しかしながら、本製造方法による収率は低
く、6g/以下である。
Acta Microbiologica Sinica,21（２）,185〜191（19
81）に開示されている他の公知方法によれば、２−ケト
−Ｌ−グロン酸は、シユウドモナス ストリアータ（Ps
eudomonas striata）とグルコノバクター オキシダン
ス（Gluconobacter oxydans）からなる微生物混合培養
物により、Ｌ−ソルボースから、Ｌ−ソルボースの濃度
70g/で開始したときは30g/の収率で、またＬ−ソル
ボース濃度100g/で開始したときは37g/の収率で製
造出来るとされている。
さらに、ヨーロツパ特許公開番号0221 707におい
て、共存する微生物の存在または非存在下にシユウドグ
ルコノバクター サツカロケトジエネス（Pseudoglucon
obacter saccharoketogenes）を用いた、Ｌ−ソルボー
スからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製法が開示されてい
る。しかしながら、シユウドグルコノバクターそれ自体
を用いた本製造方法の収率はせいぜい55.3〜87.6g/
（変換率:34.2〜54.1％）である（参照：ヨーロツパ特
許公開番号0221 707、13ページ、表４）。
さらに、ヨーロツパ特許公開番号0278 447において
は、微生物の混合培養によるＬ−ソルボースからの２−
ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法が開示されている。用い
られる微生物の一方のものはDSM No.4025株の同定にお
ける特徴を有する微生物であり、もう一方のものはDSM
No.4026（バチルス メガテリウム（Bacillus megateri
um）株）の同定における特徴を有する微生物である。DS
M No.4025株の同定における特徴を有する微生物、特にD
SM No.4025株そのものは、それ自体、実質的に生育せ
ず、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する能力を有さない
が、第二の成分としてのバチルスメガテリウム菌を含む
混合培養において生育し２−ケト−Ｌ−グロン酸を40g/
以上の収率で生産する。このように、ヨーロツパ特許
公開番号0278 447に開示されている製造方法では、そ
の操作性から第二の微生物成分（バチルスメガテリウ
ム）の存在が必須であると考えられる。
本発明によればDSM No.4025株の同定における特徴を
有する微生物を用いて、他の微生物、たとえばバチルス
メガテリウムを共存させること無しにＬ−ソルボース
から２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造することが可能であ
る。本発明は、このような驚くべき発見に基づいてい
る。
従つて、本発明は、発酵系の作用に基づくＬ−ソルボ
ースの発酵的変換による２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造
方法であり、該発酵系が： ａ） 微生物DSM No.4025の同定における特徴を有し、
Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する
能力を実質的に有さないグルコノバクター属の微生物の
純粋培養物； ならびに ｂ） 酵母または該酵母から得られる同酵母の生育促進
活性を有する該酵母由来成分、 からなり、２−ケト−Ｌ−グロン酸は前記微生物と前記
酵母または酵母由来成分との培養によってつくられる、
２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法に関する。
本発明によれば、Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−
グロン酸を実質的に改良された収率で生産することが可
能であり、Ｌ−ソルボース濃度80g/で開始した場合
に、72g/以上の収率（変換率:93.7％）で、また、Ｌ
−ソルボース濃度100g/で開始した場合に100g/以上
の収率（変換率:92.8％）を示し、より高い濃度で開始
したときは、より高い収率が得られる。変換収率は消費
されたＬ−ソルボースあたりの生産された２−ケト−Ｌ
−グロン酸の量をもとに計算している。
本発明において使用される微生物は、DSM No.4025株
の同定における特徴を有し、それ自体では実質的に生育
せず、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する能力を有さな
い。その主たる同定するための特徴を以下に示す： オキシダーゼ試験 陰性；エタノールは酢酸に酸化さ
れる;D−グルコースはＤ−グルコン酸および２−ケト−
Ｄ−グルコン酸に酸化される；ポリアルコールのケトン
生成を行う；グリセロールからジヒドロキシアセトンを
実質的に生産しない;D−ソルビトールおよびＤ−グルカ
ール酸から２−ケト−Ｄ−グルカース酸を生成するが、
Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコン酸、
Ｄ−マンニトールもしくは２−ケト−Ｄ−グルコン酸か
らは生成しない；多形成で、外観上、べん毛を認めな
い；フルクトースから褐色の色素を生成する；バチルス
メガテリウムもしくはその細胞抽出物の存在下に共培
養すると良好な生育をしめす；ストレプトマイシン感受
性。
本発明においては、該微生物の純粋培養を用いてい
る。“該微生物の純粋培養”とは、シユードモナス ス
トリアータやバチルス メガテリウムのような他の微生
物が共存せず、該微生物のみからなる培養を意味する。
従つて、前述の“Acta Microbiologica Sinica",21
（２）,185〜191（1981）に開示されている製法に用い
られている培養と異なり、また、混合培養の利用が開示
されているヨーロツパ特許公開番号278 447での製造方
法における培養とも異なる。
特定の好ましい微生物はDeutsche Sammlung von Mikr
oorganismen（Goettingen）にDSM No.4025として1988年
３月17日にブタペスト条約に基づいて寄託されている
（本研究所の現住所:Deutsche Sammlung von Mikroorga
nismen und Zelkulturen GmbH,Mascheroder Weg lb,D−
3300Braunschweig,Federal Republic of Germany）。こ
れは、グルコノバクター オキシダンス微生物と命名さ
れた。
さらに、好ましい微生物としては、微生物DSM No.402
5株と機能的な同等物、継代培養物、突然変異株および
誘導体が考えられる。
微生物DSM No.4025の細胞は、両端が丸い棒状をして
いる。該微生物の細胞の直径は平均約0.3〜0.6μｍ、そ
の長さは約0.9〜1.6μｍであり、主として１〜1.5μｍ
である。
本発明の好ましい実施態様としては、２−ケト−Ｌ−
グロン酸の生産を、適当な栄養源に加えてＬ−ソルボー
ス、および酵母または酵母由来成分を含む培地に、上述
の該微生物を培養することによつて行う。別法として
は、上述した培地に該微生物を培養した後に、培養液か
ら集めた菌体もしくはその無細胞抽出液をＬ−ソルボー
スと接触せしめることによつても可能である。
本発明の反応を実施するには、微生物DSM No.4025の
同定における特徴を有するいかなる微生物を使用しても
よい。DSM No.4025株の同定における特徴を有するこの
ような微生物は、同微生物の酵母または酵母由来成分と
の組合せにおいてＬ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸に変換する能力を有する継代培養物、機能的な同等
物、誘導体および突然変異株を含む。通常のいかなる酵
母または酵母由来成分をも使用することができる。本発
明において使用可能な該酵母由来成分は、その由来する
該酵母の成長促進作用を有する、該酵母から得られたい
かなる成分であつてもよい。
本発明において用いられる酵母としては、子のう菌類
に属する酵母、特にサツカロミセス セレヴイシエ（パ
ン酵母）、サツカロミセス カールスベルゲンシス（サ
ツカロミセス ウヴアルム）（ビール酵母）やサツカロ
ミセス サケのようなサツカロミセス属に属するもの、
また、シゾサツカロミセス ポンベのようなシゾサツカ
ロミセス属に属するもの、また、ピヒア メンブラナフ
アシエンスのようなピヒア属に属するもの、また、ハン
ゼヌラ アノマラのようなハンゼヌラ属に属するものが
あり、あるいは、不完全糸状菌類に属する酵母、特にカ
ンヂダ トロピカリスやカンヂダ ユチリスのようなカ
ンヂダ属に属するもの、また、トルロプシス ヴアーサ
チリス（カンヂダヴアーサチリス）や、トルロプシス
ホルミイ（カンヂダ ホルミイ）のようなトルロプシス
属に属する酵母およびこれらの酵母由来成分の、何れも
が含まれる。上述の酵母は、寄託機関から、または商品
として無制限に入手可能である。すなわち、上述のサツ
カロミセス セレヴイシエ種に属する酵母は、例えばパ
ン酵母として私企業から入手可能である。例をあげる
と、以下に示すパン酵母は以下に示す会社から購入可能
である。
オリエンタル イースト（オリエンタル酵母工業） カネカ イースト（鐘淵化学工業） ダイヤ イースト（協和発酵工業） サンキョウ イースト（三共） チユウエツ イースト（中越酵母） イースト 45（東洋醸造） ニツテン イースト（日本甜菜製糖） さらに、以下に示す酵母もまた、IFO（発酵研究所、
大阪、日本）から入手可能である。
サツカロミセス セレヴイシエ IFO 1234 サツカロミセス カールスベルゲンシス （サツカロミセス ウヴアルム） IFO 0565 サツカロミセス サケ IFO 0309 カンヂダ トロピカリス IFO 1400 カンヂダ ユチリス IFO 0396 トルロプシス ヴアーサチリス IFO 10056 （カンジダ ヴアーサチリス） トルロプシス ホルミイ IFO 1629 （カンヂダ ホルミイ） シゾサツカロミセス ポンベ IFO 0362 ピヒア メンブラナフアシエンス IFO 10215 ハンゼヌラ アノマラ IFO 10213 本製法に用いる酵母は、本発明において用いられる該
微生物の生育因子を含んでいることが必須である。該生
育因子の共通の性質は、熱安定であり、かつ水溶性であ
る。
本発明にて用いられる酵母および酵母由来生成物は、
所謂、生酵母、乾燥酵母、酵母抽出物およびそれに類似
したものを含む。此処にいうところの生酵母とは、培養
液から遠心分離、濾過等によつて、ただ集めただけの酵
母細胞を意味する。ごく普通に商品化されているパン酵
母は、まさに生酵母の代表例である。しかしながら、12
1℃で加熱されたパン酵母のような生酵母でも、本発明
における製法においては好適に用いることができる。実
際、生きた酵母は、基質としてもちいるＬ−ソルボース
を部分的に代謝し、それによつて２−ケト−Ｌ−グロン
酸の収率を減ずるであろうという事実を考えると、滅菌
された酵母の使用は、より好ましい。このように、滅菌
されたパン酵母のような滅菌された酵母の使用は、本発
明における高度に好ましい実施態様のひとつである。
該微生物をＬ−ソルボースおよび酵母もしくは酵母由
来生成物を含む栄養培地で培養するに際しては、好気的
条件下に液体培地中で培養するのが便利である。
本発明における上述の酵母の濃度は、培地中における
湿重量が約5g/から150g/が好ましく、培地中におけ
る湿重量が約20g/から約100g/がより好ましい。
本発酵方法は、約4.0から9.0の間のpH、好ましくは約
6.0から8.0のpHで実施できる。
本発酵方法を実施するのに好ましい温度範囲は約13か
ら36℃の間である。さらに好ましくは本発酵方法は、約
18と33℃の間で実施される。
発酵時間は、使用するpH,温度および栄養培地によつ
て変化するが、通常は約２から５日間で好ましい結果が
もたらされる。
本発明の方法において出発原料として用いられるＬ−
ソルボースの濃度は、約20〜250g/、好ましくは約50
〜約200g/の間で変化させることができる。
本発明の発酵方法において使用される培地は、該微生
物が同化可能な炭素源、消化可能な窒素源ならびに無機
物質、ビタミン、微量元素および他の生長促進因子のよ
うな、栄養源を含有する。本発明の方法において出発原
料として用いられるＬ−ソルボースのほかに、炭素源と
なる他の物質、例えばグリセロール、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトー
ル等も添加することができる。
本発明の方法においては、窒素源として各種の有機ま
たは無機物質、たとえば肉エキス、ペプトン、カゼイ
ン、コーンスチープリカー、尿素、アミノ酸、硝酸縁、
アンモニウム塩等を使用できる。無機物質としては、硫
酸マグネシウム、リン酸カルシウム、塩化第一鉄および
第二鉄、炭酸カルシウム等を使用できる。
培養物から集めた予め生育させた全細胞を使用する場
合は、微生物の培養は上述したのと同一または類似の条
件下に行なわれる。これらの全細胞は好気条件下、液体
培地中で用いられ、その他の（出発原料として用いられ
るＬ−ソルボース以外の）栄養素は必要ない。
該培養物からの無細胞抽出物を用いる場合には、これ
らの抽出物は液体培地中の栄養源に添加され、上述と同
様な方法で好気性条件下でＬ−ソルボースの２−ケト−
グロン酸への変換において使用され、付加的な栄養素
は、この場合も不要である。
本発明の方法により得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸
は、反応混合物から、たとえば塩の形成によりまたは生
成物と周囲の不純物との間の性質たとえば溶解度、吸着
性および溶媒間の分配係数の差を用いて単離できる。た
とえばイオン交換樹脂への吸着は、生成物の単離に有利
な手段である。かくして得られた生成物はさらに慣用方
法により、たとえば再結晶またはクロマトグラフイーに
よつて精製できる。
別法として、反応混合物を直接エステル化、ついでエ
ノール化およびラクトン化してＬ−アスコルビン酸に変
換することもできる。
次に本発明を以下の実施例により例示する。
例１ Ｌ−ソルボース 8.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、MgSO4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー
1.75％、酵母エキスＢ−II（オリエンタル酵母工業）
0.25％、炭酸カルシウム 0.5％および尿素 0.5％（別
殺菌）（殺菌前にpHを7.0に調整）からなる種培地を、
試験管に分注（5mlずつ）、121℃で20分間滅菌した。こ
の種培地に、グリセロール 3.0％、MgSO4・7H2O 0.25
％、コーンスチープリカー 1.75％、酵母エキスＢ−II
0.25％、炭酸カルシウム 0.5％および尿素 0.5％
（別殺菌）および寒天 2.0％（殺菌前にpHを7.0に調
整）からなる斜面培養培地上で、25℃で４日間生育させ
たDSM No.4025株の菌体を一白金耳植菌し、30℃で24時
間培養した。得られた種培養を、上述の種培地50mlの入
つた500mlの三角フラスコに植菌し30℃にて24時間培養
した。一方、500mlの三角フラスコに、Ｌ−ソルボース
8.0％（別殺菌）、グリセロール 0.05％、尿素 １
％（別殺菌）、MgSO4・7H2O 0.25％、炭酸カルシウム
1.5％およびコーンスチープリカー 3.0％からなる基
礎培地（500ml）に、酵母エキスＢ−II 0.5％および／
もしくはパン酵母（オリエンタル酵母工業）５％を添加
し121℃で20分間滅菌した。これらの生産培地に、上記
のように調製した種培地を5mlずつ加えたのち、30℃で
４日間、180回転／分にて培養した。
高性能液体クロマトグラフイーによる分析によつて、
パン酵母を添加した培養液中に２−ケト−Ｌ−グロン酸
（２−KGA）含量は、72.1g/（変換率:93.7％）と定量
された。一方、酵母エキスＢ−IIを添加した培養液およ
び酵母エキスＢ−II/パン酵母を添加した培養液の２−K
GA含量は、それぞれ57.1g/（変換率:88.8％）および6
4.9g/（変換率:94.4％）であつた。
例２ Ｌ−ソルボース 8.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、MgSO4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー
1.75％、パン酵母 5.0％、炭酸カルシウム 0.5％お
よび尿素 0.5％（別殺菌）（殺菌前にpHを7.0に調整）
からなる種培地を、試験管に分注し（5mlずつ）、121℃
で20分間滅菌した。この種培地に、Ｄ−マンニトール
5.0％、MgSO4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー
1.75％、パン酵母 0.25％、炭酸カルシウム 0.5％、
尿素 0.5％（別殺菌）および寒天 2.0％（殺菌前にpH
を7.0に調整）からなる斜面培養培地上で、27℃で４日
間生育させたDSM No.4025株の菌体を一白金耳植菌し、3
0℃で24時間培養した。得られた種培養を、上述の種培
地50mlの入つた500mlの三角フラスコに植菌し30℃にて2
4時間培養した。一方、500mlの三角フラスコに、Ｌ−ソ
ルボース 10％（別殺菌）、グリセロール 0.05％、尿
素 1.6％（別殺菌）、MgSO4・7H2O 0.25％、炭酸カル
シウム 1.5％およびコーンスチープリカー ３％から
なる基礎培地（50ml）に、表.1に掲げた酵母を添加し12
1℃で20分間滅菌した。これらの生産培地に、上記のよ
うに調製した種培地を5mlずつ加えたのち、30℃で４日
間、180回転／分にて培養した。
各種条件下におけるフラスコの２−KGAの値を第１表
に示す。
例３ 例２に記載したのと同様の方法を用いて種培養を調製
し、Ｌ−ソルボース 9.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、コーンスチープリカー 3.0％、尿素 1.4％
（別殺菌）、パン酵母 5.6％、MgSO4・7H2O 0.25％、
炭酸カルシウム 1.5％からなる生産培地50mlの入つた5
00mlの三角フラスコに植菌し、30℃で４日間、180回転
／分にて培養した。
その結果、89.0g/（変換率:91.8％）の２−KGAの生
産が認められた。
例４ 例２に記載したのと同様の方法を用いて種培養を調製
し、Ｌ−ソルボース 10.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、コーンスチープリカー 3.0％、尿素 1.6％
（別殺菌）、パン酵母 6.25％、MgSO4・7H2O 0.25％
および炭酸カルシウム 1.5％からなる生産培地50mlの
入つた500mlの三角フラスコに植菌し、30℃で４日間、1
80回転／分にて培養した。
その結果、97.2g/（変換率:90.2％）の２−KGAの生
産が認められた。
例５ 例２に記載したのと同様の方法を用いて種培養を調製
し、Ｌ−ソルボース 12.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、コーンスチープリカー 3.0％、尿素 1.9％
（別殺菌）、パン酵母 7.5％、MgSO4・7H2O 0.25％お
よび炭酸カルシウム 1.5％からなる生産培地50mlの入
つた500mlの三角フラスコに植菌し、30℃で４日間、180
回転／分にて培養した。
その結果、98.5g/（変換率:89.4％）の２−KGAの生
産が認められた。
例６ 例２に記載したのと同様の方法を用いて種培養を調製
し、Ｌ−ソルボース 8.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％、コーンスチープリカー 3.0％、尿素 1.25
％（別殺菌）、MgSO4・7H2O 0.25％、炭酸カルシウム
1.5％および２から５％のパン酵母からなる生産培地5
0mlの入つた500mlの三角フラスコに植菌し、30℃で３な
いし４日間、180回転／分にて培養した。
第２表に示すように、４％のパン酵母を添加した培地
において、４日間の培養で82.6g/（変換率:95.8％）
の２−KGAが生産された。
例７ 例２に記載したのと同様の方法を用いて200mlの種培
養を調製した。３−Ｌ容のジヤー培養槽に、1.2リツト
ルのグリセロール 0.05％、コーンスチープリカー 3.
0％、パン酵母 0.5％およびMgSO4・7H2O 0.25％から
なる基礎培地（全量2.0リツトルに調製時の終濃度）を
加えて、121℃で20分間殺菌した。Ｌ−ソルボース ８
％（最終濃度）および尿素 1.25％（最終濃度）は、別
殺菌してから発酵槽に添加した。種培養植菌後、培養液
量を滅菌水を添加することによつて、２リツトルになる
ように調整した。発酵は、30℃で、撹拌を800回転／
分、通気を１リツトル／分で行つた。培養液のpHは、4N
の炭酸ソーダをもちいて7.0に維持した。
40時間の培養によつて、84g/（変換率:97.4％）の
２−KGAが生産された。
例８ 例７に記載したのと同様の方法によつて、Ｌ−ソルボ
ース 10.0％、尿素1.6％、グリセロール 0.05％、MgS
O4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー 3.0％およ
びパン酵母 6.25％を含む培地を用いて３−Ｌジヤー培
養を行つた。
その結果、100.0g/（変換率:92.8％）の２−KGA
が、50時間の培養で生産された。
例９ 例７に記載したのと同様の方法によつて、Ｌ−ソルボ
ース 12.0％、尿素1.9％、グリセロール 0.05％、MgS
O4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー 3.0％およ
びパン酵母 7.5％を含む培地を用いて３−Ｌジヤー培
養を行つた。
その結果、98.0g/（変換率:92.3％）の２−KGAが、
75時間の培養で生産された。21.5g/のＬ−ソルボース
が利用されずに残存した。
例10 例７に記載したと同様の方法で、３−Ｌジヤー培養を
開始した。一方、80gのＬ−ソルボースを400mlの水に溶
解し121℃で20分間殺菌したものを、培養の６時間目か
ら42時間目にかけて、約11ml/分の添加速度で連続的に
培養槽に添加した。Ｌ−ソルボース添加終了後、発酵は
更に25時間継続した。全培養時間は、67時間であつた。
本培養液（2.6リツトル）中には、95g/の２−KGAが生
産されていた。全体では、240gのＬ−ソルボースから、
247gの２−KGAが生産されていた。モル変換率:95.5％ 例11 例６に記載したと同様の方法で、３−Ｌジヤー培養を
開始した。一方、120gのＬ−ソルボースを400mlの水に
溶解し121℃で20分間殺菌したものを、培養の６時間目
から42時間目にかけて、約11ml/分の添加速度で連続的
に培養槽に添加した。Ｌ−ソルボース添加終了後、発酵
は更に35時間継続した。全培養時間は、77時間であつ
た。本培養液（2.7リツトル）中には、104g/の２−KG
Aが生産されていた。全体では、280gのＬ−ソルボース
から、280.8gの２−KGAが生産されていた。モル変換率:
93.1％ 例12 例７に記載したと同様の方法で、３−Ｌジヤー培養を
開始した。一方、160gのＬ−ソルボースを400mlの水に
溶解し121℃で20分間殺菌したものを、培養の６時間目
から42時間目にかけて、約11ml/分の添加速度で連続的
に培養槽に添加した。Ｌ−ソルボース添加終了後、発酵
は更に49時間継続した。全培養時間は、91時間であつ
た。本培養液（2.7リツトル）中には、110g/の２−KG
Aが生産されていた。全体では、320gのＬ−ソルボース
から、297gの２−KGAが生産されていた。モル変換率:8
6.1％ 例13 例２に記載したのと同様の方法を用いて種培養を調製
し、該種培養を5mlずつ、Ｌ−ソルボース10％（別殺
菌）、グリセロール 0.05％、尿素 1.6％（別殺
菌）、MgSO4・7H2O 0.25％、コーンスチープリカー
3.0％、炭酸カルシウム 1.5％および第３表に掲げる各
種パン酵母6.25％からなる生産培地50mlの入つた500ml
の三角フラスコに植菌し、30℃で４日間、180回転／分
にて培養した。結果を第３表に示す。
例14 Ｌ−ソルボース ８％（別殺菌）、グリセロール 0.
05％、尿素 1.25％（別殺菌）、MgSO4・7H2O 0.25
％、炭酸カルシウム 1.5％、およびコーンスチープリ
カー ３％からなる基礎培地（5ml）（殺菌前にpH7.5％
に調整）に、酵母の菌体（５％湿重量／体積）を添加
し、試験管（1.8×20cm）に入れ、121℃で20分間滅菌し
た。酵母菌体としては、サツカロミセス サケ IFO 0
309、シゾサツカロミセス ポンベ IFO 0362、サツカ
ロミセス カールスベルゲンシス IFO 0565、サツカ
ロミセス セレヴイシエ IFO 1234、カンヂダ ユチ
リス IFO 0396、カンヂダ トロピカリス IFO 140
0、トルロプシス ホルミイ IFO 1629、トルロプシス
ヴアーサチリス IFO 10056、ハンゼヌラ アノマラ
IFO 10213およびピヒア メンブラナフアシエンス
IFO 10215を、麦芽エキス（Difco）1.0％，酵母エキス
（Difco）0.1％，ソイトン（Difco）0.1％，グルコース
1.0％および寒天 ２％からなる寒天培地上で、27℃
にて４日間生育させたものを用いた。本生産培地に、例
２にて記載したと同様の方法で調製したDSM No.4025株
の種培養0.5mlづつを植菌し、30℃で４日間培養した。
各種条件における試験管の２−KGA値を、第４表に示
す。
比較例 Ｌ−ソルボース 8.0％（別殺菌）、グリセロール
0.05％ MgSO4・7H2O 0.25％、酵母エキス Ｂ−II
1.5％および炭酸カルシウム 1.5％（別殺菌）（滅菌前
に、pH 7.0に調整）からなる種培養培地S1を、試験管
に5mlずつ分注し121℃で20分間、滅菌した。この種培養
培地に、斜面培養培地に生育した、一白金耳のグルコノ
バクター オキシダンスＵ−13（FERM−BP No.1269）を
植菌し30℃で48時間培養した。得られた種培養は、500m
lの三角フラスコに50mlの上述の種培養培地を入れたも
のに、植菌し30℃で48時間培養した。一方、別の種培養
を、上述したのと同様の方法によつて、Ｌ−ソルボース
8.0％（別殺菌）、MgSO4・7H2O 0.25％、グリセロー
ル 0.05％、炭酸カルシウム1.5％、尿素 0.5％、コー
ンスチープリカー 1.75％およびパン酵母 5.0％から
なる種培養培地S2を用いて調製した。このようにして調
製した種培養S1およびS2を、例２に記載したのと同様の
方法によつて、植菌した。発酵は、30℃で４日間行つ
た。
得られた２−KGAの収量は、S1培地を用いた場合、12.
8g/であり、S2培地を用いた場合は10.2g/であつ
た。このことは、グルコバクター オキシダンス Ｕ−
13（FERM−BP No.1269）のように、純粋培養として生育
可能で、かつ２−KGA生産能力を有する菌は、酵母を含
む生産培地においては、高い２−KGA収量をもたらさな
いことを示している。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01 1:72） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:74） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:78） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:84） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:85） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:86） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:865） (Ｃ１２Ｐ 39/00 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:88）

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】発酵系の作用に基づくＬ−ソルボースの発
    酵的変換による２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法であ
    り、該発酵系が： ａ） 微生物DSM No.4025の同定における特徴を有し、
    Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産する
    能力を実質的に有さないグルコノバクター属の微生物の
    純粋培養； ならびに、 ｂ） 酵母または該酵母から得られる同酵母の生育促進
    活性を有する該酵母由来成分 からなり、２−ケト−Ｌ−グロン酸は前記微生物と前記
    酵母または酵母由来成分との培養によってつくられるこ
    とを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
  2. 【請求項２】DSM No.4025に対応する微生物、またはそ
    の機能的同等物、継代培養物、突然変異株もしくは誘導
    体が使用される請求項第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】子のう菌類に属する酵母、または不完全糸
    状菌類に属する酵母、あるいはそれらの酵母由来成分が
    培地成分として使用される請求項第１項または第２項の
    いずれか一つに記載の方法。
  4. 【請求項４】サッカロミセス（Saccharomyces）属、シ
    ゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、ピヒア
    （Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、カンジダ
    （Candida）属、またはトルロプシス（Torulopsis）属
    に属する酵母が培地成分として使用される請求項第３項
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】サッカロミセス セレヴィシエ（Saccharo
    myces cerevisiae）（パン酵母）、サッカロミセス カ
    ールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）
    （サッカロミセス ウヴァルム（Saccharomyces uvaru
    m））（ビール酵母）、サッカロミセス サケ（Sacchar
    omyces sake）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizos
    accharomyces pombe）、ピヒア メンブラナファシエン
    ス（Pichia membranaefaciens）、ハンゼヌラ アノマ
    ラ（Hansenula anomala）、カンジダ トロピカリス（C
    andida tropicalis）、カンジダ ユチリス（Candida u
    tilis）、トルロプシス ヴァーサチリス（Torulopsis
    versatilis）（カンジダ ヴァーサチリス（Candida ve
    rsatilis））、またはトルロプシス ホルミイ（Torulo
    psis holmii）（カンジダ ホルミイ（Candida holmi
    i））が培地成分として使用される請求項第４項に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】培地成分として、生酵母を使用することを
    特徴とする請求項第１項、第２項または第３項のいずれ
    か一つに記載の方法。
  7. 【請求項７】該酵母が、湿重量において約5g/から約1
    50g/の濃度にて使用される請求項第１項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】Ｌ−ソルボースが、約20g/から約250g/
    の濃度にて使用される請求項第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】２−ケト−Ｌ−グロン酸が、少なくとも72
    g/の収量をもって生産される請求項第１項−第８項の
    いずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】発酵が、約4.0と9.0の間のpHにおいて行
    なわれる請求項第１項−第９項のいずれか１項に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】発酵が、約13と36℃の間の温度にて行な
    われる請求項第１項−第10項のいずれか１項に記載の方
    法。
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