JPS6150598B2

JPS6150598B2 -

Info

Publication number: JPS6150598B2
Application number: JP7068085A
Authority: JP
Inventors: Takayasu Sonoyama; Shigeo Yagi; Bunji Kageyama; Masahiro Tanimoto
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1985-04-02
Publication date: 1986-11-05
Also published as: JPS6163278A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＤ―グルコースを２，５―ジケト―Ｄ
―グルコン酸に変換する能力を有する新たに分離
された微生物に係る。２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸はアスコルビ
ン酸製造のための中間体として有用である。すな
わち、２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸はアスコ
ルビン酸の前駆物質である２―ケト―Ｌ―グロン
酸に選択的に還元することができるからである。
（たとえば特公昭47―38193号，特開昭54―145283
号公報参照）これまで、２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸は
主として、アセトバクター，アセトモナスおよび
グルコノバクター属に属する好気性菌株によるグ
ルコースの選択的酸化によつて製造されて来た
が、エルウイニア属に属する菌株によつて製造さ
れた例は報告されていない。本発明者らは後述のように、土壌および各種の
果実から分離した下記エルウイニア属菌株が本発
明の目的に添うＤ―グルコースから２，５―ジケ
ト―Ｄ―グルコン酸への選択的酸化を遂行するこ
とを発見し、本発明を完成した。本発明は、Ｄ―グルコースを選択的に酸化して
Ｄ―グルコースを２，５―ジケト―Ｄ―グルコン
酸に変換する能力を有するすべての、エルウイニ
ア属に属する菌株を含む。そのうち本発明者らが
新たに分離した新種を次頁の第一表に列挙する。列挙されたものはすべてこの３種に属しこれら
の変種を構成するものとする。また、これらの菌株の分類学的諸性質を第二表に
記述する。なお、本明細書を通じSHSとは発明者等の整理
上の記号であり、Shionigi Ｓeizobuを表わし、
FERM−Ｐは徴工研菌寄託番号を表わす。 ATCCはアメリカン・タイプ・カルチユア・コ
レクシヨン寄託番号を、それぞれ表わす。

【表】

【表】なお、第一表に記載の各菌株は、第二表に示し
た各菌株の分類学的諸性質をバージイズ・マニユ
アル・オブ・デタミナテイブ・バクテリオロジイ
第８版（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology、8th Ed，1974，以下単にマニユア
ルと記載する）の記載と対比することによりそれ
ぞれ同定した。１科の同定：上記全菌株がいずれもグラム陰性、通性嫌気性
の短桿菌であり、胞子を形成せず、オキシダーゼ
陰性でカタラーゼ陽性であるところからエンテロ
バクテリア科（Enterobacteriaceae）と同定され
る。２属の同定： β―メチルグルコシドおよびスクロースより生
酸し（但し、SHS―2003株のみは例外的にスクロ
ールより生酸しない、しかしスクロールを単一炭
素源として利用できる。）、アドニトール，ズルシ
トール，メレチトースから生酸しないこと；安息
香酸，蓚酸，プロピオン酸を利用できないこと；
澱粉を加水分解しないこと；グルタミン酸，アル
ギニン，リジンおよびオルニチンからの脱炭酸反
応が陰性であること（但し、SHS―2004，2005，
2006および2007株はグルタミン酸を脱炭酸す
る）；およびウレアーゼおよびリバーゼを生成し
ないことから、エルウイニア属（Genus
Erwinia）と同定される。３種の同定： SHS―2003株本菌株は鞭毛を有しないことからハービコラ群
（group harbicola）の中のエルウイニア・ステ
ユーワーテイ（Erwinia stewarii）に近縁とみ
なされるが次の点でその性質を異にしている。 (i)Ｓ―2003株は生育にニコチン酸またはニコチ
ンアミドを要求する， (ii)システインから硫化水素を生成する， (iii)硝酸塩還元能を有する， (iv)スクロース※，アラビノース，ラフイノー
ス，およびソルビトールから生酸しない， (v)サリシン，セロビオース，およびグリセロー
ルから生酸する， (vi)酒石酸を単一炭素源として利用できない、マ
ニユアル中には他に該当する菌種を見出せない
ことから、本菌株は新種を構成するものと判定
し、エルウイニア・シトレウス（Erwinia
citreus）と命名した。（※ スクロールから生酸はしないが単一炭素
源として利用する。） SHS―2004，2005，2006および2007株：これらの菌株も鞭毛を有せず、エルウイニア・
スチユワーテイに近縁の菌株とみなしうるが、エ
ルウイニア・スチユワーテイに属する菌とは共通
して次の性質を異にする。 (i)生育にニコチン酸またはニコチンアミドを要
求する， (i)システインから硫化水素を生成する， (iii)硫酸塩還元能を有する， (iv)グルタミン酸炭酸反応が陽性である， (v)アラビノース，マンニトール，ラクトースお
よびソルビトールから生酸しない， (vi)サリシンおよびセロビオースから生酸する， (vii)酒石酸を単一炭素源として利用出来ない、ま
た、これらの菌株は前記SHS―2003とはグルタ
ミン酸を脱炭酸する点、マンニトール、乳糖か
ら生酸しない点、乳糖、酢酸及び乳酸を単一炭
素源としてほとんど利用しない点、ならびにリ
トマスミルクに対してほとんど作用しない点に
おいて相違している。マニユアル中には本菌株
群を配すべき種を見出すことができないので、
これらの菌株群は一新種を構成するものとみな
し、エルウイニア・ブンクタータ（Erwinia
punctata）と命名した。これらのうちSHS―2004とSHS―2006とは、 (i)ラフイノースからも生酸しない、また (ii)マンニトール、酢酸および乳酸を単一炭素源
としてほとんど利用できない、点において共通するが、SHS―2004はSHS―2006
と対比して、 (i)グルコースからアセトインを生成する、 (ii)硝酸塩を窒素源として利用できる、 (iii)グリセロールから生酸する、また (iv)ギ酸を単一炭素源として利用する、点において相違を認める。一方SHS―2005もマンニトール、酢酸および乳
酸を単一炭素源としてほとんど利用できない点で
SHS―2006と共通するが、 (i)グリセロールからも生酸する、 (ii)グルコースからアセトインを生成する、 (iii)キング（King）Ｂ倍地で蛍光色素を生成す
る、 (iv)ラフイノースからも僅かに生酸する、また (v)ギ酸を単一炭素源として利用する、点において相違を認める。さらにSHS―2007も同様にマンニトール、酢酸
および乳酸を単一炭素源としてほとんど利用でき
ない点においてSHS―2006と共通するが、 (i)ラフイノースからも生酸する、 (ii)グルコースからアセトインを生成する、 (iii)ギ酸を単一炭素源として利用できる、また (iv)生育温度が4.0〜47.5℃と幅が広い、点において相違を認める。上記により、これらの菌株群SHS―2004，SHS
―2005，SHS―2006およびSHS―2007は、それぞ
れ上記エルウイニア・ブンクタータに属し、互い
にその変種を構成する。 SHS―2008およびSHS―2010：これらの菌株は側鞭毛を有し、エルウイニア・
トラヘイフイラ（Erwinia tracheiphila）また
はエルウイニア・クエルシナ（E. quercina）に
近縁とみなされるが、これらの性質をマニユアル
に記載のエルウイニア・トラヘイフイラの性質と
対比すると次の点で相違している。 (i)SHS―2008およびSHS―2010は36℃以上でも
生育する、 (ii)肉汁寒天培地での生育が良好である、 (iii)粘液状の生育（mucoid growth）をする、 (iv)硝酸還元能を有する、 (v)サリシン，キシロース，メリビオースおよび
マンノースから生酸する、 (vi)乳酸を単一炭素源として利用できる、またエルウイニア・クエルシナの性質と対比して
も次の点で異つている。 (i)グルコン酸の酸化能を有する、 (ii)硝酸の還元能を有する、 (iii)メリビオース・セロビオースから生酸する、 (iv)マンニトール，α―メチルグルコシド，エス
クリンおよびソルビトールから生酸しない、 (v)グルコース・ベプトン培地からガスを生成し
ない。マニユアル中にはこれらの菌株を配すべき種を見
出すことができないので新種を構成するものとみ
なし、エルウイニア・テリウス（Erwinia
terreus）と命名した。なお、SHS―2010株はSHS―2008株と対比して (i)グルセロールから生酸しない、 (ii)SHS―2008がリボースから生酸するのに対し
SHS―2010は僅かしか生酸しない、 (iii)メチル・レツド・テストが微弱陽性である、また、 (iv)キングＢ培地で蛍光色素を生成する、点で相違が認められるが他の性質においてはほぼ
一致する。SHS―2009 ：本菌株は側鞭毛を有しエルウイニア・トラヘイ
フイラ，エルウイニア・クエルシナ、またはエル
ウイニア・ハービコラ・バリアント・ハービコラ
（E.herbicola var. harbicola）に近縁とみなされ
る。本菌株の性質をマニユアルに記載のエルウイニ
ア・トラヘイフイラの性質と対比すると、 (i)SHS―2009は肉汁寒天培地での生育が良好、 (ii)36℃以上でも生育する、 (iii)粘液状の生育をする、 (iv)硝酸還元能を有する、また (v)サリシン，キシロール，メリビオース，セロ
ビオース，グルセロールおよびマンノースから
生酸する、点において顕著な相違が認められる。さらにエルウイニア・クエルシナの性質と比較
すると、 (i)グルコン酸を酸化できる、 (ii)硝酸還元能を有する、 (iii)グルコースからのアセトインの生成力が弱
い、 (iv)キシロール，メリビオースおよびセロビオー
スから生酸する、 (v)マンニトール，α―メチルグルコシド、エス
クリン、リボースおよびソルビトールから生酸
しない、 (vi)酒石酸を単一炭素源として利用できない、また、 (vii)グルコース・ベプトン培地からガスを生成し
ない、点において顕著な相違が認められる。さらにエルウイニア・ハービコラ・バリアン
ト・ハービコラの性質と比較すると、 (i)生育にニコチン酸またはニコチンアミドを要
求する、 (ii)グルコースからのアセトインの生成力が弱
い、 (iii)ゼラチンの液化能がない、 (iv)メリビオース，セロビオースおよびグルセロ
ールから生酸する、また (v)アラビノース，マンニトール，マルトース，
デキストリン，ラムノース，リボースおよびソ
ルビトールから生酸しない、点において顕著な相違が認められる。一方、本菌株を前記SHS―2008株と対比する
と、 (i)グルコースからのアセトインの生成力が弱
い、また (ii)リボースから生酸しない、点における相違が認められるが他の諸性質におい
てほぼ一致しているので、本菌株も上記エルウイ
ニア・テリウスに属し、その一変種を構成する。SHS―2011 ：本菌株は側鞭毛を有しエルウイニア・トラヘイ
フイラまたはエルウイニア・アミロボラ（Ｅ．
amylovora）に近縁とみなされる。本菌株の性質をマニユアルに記載のエルウイニ
ア・トラヘイフイラの性質と対比すると、 (i)SHS―2011は肉汁寒天培地での生育が中等
度、 (ii)36℃以上でも生育する、 (iii)粘液状の生育をする、 (iv)硝酸還元能を有する、 (v)サリシン，キシロース，メリビオース，セロ
ビオースおよびマンノースから生酸する、また、 (vi)乳酸を単一炭素源として利用できる、点において顕著な相違が認められる。さらにエルウイニア・アミロボラの性質と対比
すると、 (i)システインから硫化水素を生成する、 (ii)36℃以上でも生育する、 (iii)硝酸還元能を有する、 (iv)ゼラチン液化能がない、 (v)サリシン，キシロール，メリビオース，セロ
ビオースおよびマンノースから生酸する、また、 (vi)リボースから生酸しない、点において顕著な相違を有する。一方、本菌株を前記SHS―2008株と対比する
と、リボースおよびグルセロールから生酸しない、点に相違が認められるが、他の諸性質においてほ
ぼ一致しているので、本菌株は上記エルウイニ
ア・テリウスの一変種を構成する。さらに、これらの分離株の自然変異株も２，５
―ジケト―Ｄ―グルコン酸産生能を有する限り本
発明の微生物に包含されるものであり、これらの
分離株を所望に応じ、人工的に誘導して得た変異
菌株も、分離株と同様に本発明に含まれ、所望に
より適応（馴致）させて用いることができること
は勿論である。上記菌株はいずれもＤ―グルコースを主炭素源
とし窒素源としてのコーン・ステイーブ・リツカ
ーおよび少量の無機塩類を含む培地中でよく生育
する。好気的に醗酵させるときは、従来使用され
ていた菌株に比し、きわめて高いＤ―グルコース
仕込み濃度で安定に醗酵し２，５―ジケト―Ｄ―
グルコン酸を好収率で産生する。培地中のＤ―グルコース濃度は、とくに望むな
らば40W/V％も高濃度とすることができるが、
通常15〜25W/V％好ましくは、ほぼ20W/V％程
度の濃度が２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸の経
済的な生産にとつて都合がよい。発酵温度は15〜35℃、好ましくは20〜30℃、最
も好ましくは約28℃が浪い。培地の初期pHは5.5
〜7.5の範囲、好ましくはpH6.0〜7.0の範囲にあ
ることがよい。またこのpH値は当初より緩衝用
の無機塩類を添加しておくか、発酵途中に塩基類
を投入することによつて所望の値pH4.0〜5.5に
維持する。塩および塩基の例は炭酸カルシウムま
たは水酸化ナトリウムである。また、接種後の培地は、撹拌機（約1750r.p.
m）によつて撹拌し、約600Nml／分の割合で通
気する。発酵は２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸の収率
が約90％（Ｄ―グルコース基準）となるまで行
う。所要時間は約17〜31時間である。また本発酵終了液は、要すればpH調整その他
の処理を経たのち、２，５―ジケト―Ｄ―グルコ
ン酸またはその塩の結晶が得られるが、これを分
離することなく、そのまま次段用発酵液してて利
用できる。たとえば２―ケト―Ｌ―グロン酸の製
造への直接利用が可能であり、従来法に比較して
収率良く達成することが出来る。本発明の微生物は、通常の菌体に他にたとえば
休止菌、または固定化菌体、または菌株破砕物も
しくはその処理物（たとえば産生酵素）として使
用することも出来る。以下実施例によつて本発明をより詳細に説明す
る。実施例１ (1) 種培地Ｄ―グルコース（含水，含量91％，以下同じ） 1.0％コーン・ステイーブ・リツカー（CSL） 5.0％りん酸二水素カリウム（KH₂PO₄） 0.1％硫酸マグネシウム（MgSO₄・7H₂O） 0.02％炭酸カルシウム（CaCO₃） 0.5％を含む水溶液を、pH値（10％NaOHにより調
節）6.8〜7.0に調整し、 500ml三角フラスコ（滅菌）に50ml宛分注して
種培地とする。 (2) 種培養上記フラスコに第三表に示した各菌株を一白金
耳ずつ植菌し、28℃に保ちながら約５―11時間振
盪培養（振巾71mm，回転数270r.p.m）した。光
学濃度（OD）が約８となる時をもつて種培養の
終点とした。 (3) 発酵培地Ｄ―グルコース 20％ CSL ３％ KH₂PO₄ 0.1％ CaCO₃ 6.3％を含む水溶液を上記と同様にpH調節、１発酵
槽に455ml宛分注し、上記種培養液45mlをそれぞ
れに加えた。 (4) 本培養温度 28℃ 撹拌 1740r.p.m 通気 600Nml／分時間 17〜31時間 (5) 定量法下記要目による上昇法ペーパー・クロマトグラ
フイーで分離し、デンシトメトリーにより定量し
た。 (i)担体：東洋濾紙No.50 (ii)展開溶媒：フエノール：蟻酸：水＝75：４：25 (iii)発色： AHF溶液（アニリン0.93gとフタール酸1.66g
を水飽和ｎ―ブタノール100mlに溶解したも
の）噴霧、105℃で２分間処理して発色させ
る。 (iv)色調およびRf値：２，５―ジケト―Ｄ―グルコン酸：褐色 0.16−0.18 ２―ケト―Ｄ―グルコン酸：ピンク色： 0.27−0.29 Ｄ―グルコース：褐色 0.48−0.50 このほか、担体として「TLCアルミシートセル
ローズ」（メルク商品名）を用い上記した展開溶
媒および発色法による薄層クロマトグラフイーを
併用した。この場合定量は標準試料との比較によ
つた。 (6) 終了点：本培養は上記薄層クロマトグラフにおいて２―
ケト―Ｄ―グルコン酸のピンク色のスポツトが消
失する時点を以て終点とした。 (7) 結果：

【表】実施例２および３（菌体懸濁液および粗酵素抽出液による生産） (1) 菌株採取用培地Ｄ―グルコース 2.0％ポリペプトン（大五栄養薬品製） 0.2％酵母エキス（大五栄養薬品製） 0.1％ KH₂O₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％ CaCO₃ 0.6％を含む水溶液のpH値を7.0に調整し、500ml三角
フラスコに80ml宛分注した。 (2) 培養、集菌、粗酵素分離上記培地に実施例１の種培養と同様に植菌し、
28℃に保ちながら16時間振盪培養（270r.p.m.振
巾71mm）した。培養終了後、菌株を遠心分離して集め、生理食
塩水にて２度洗浄した。このうち一部を生理食塩
水中の懸濁液とし、一部は１／50モルートリスー
塩酸緩衝液（pH7.5）に懸濁させ、超音波処理し
て菌体を破砕し、遠心分離により不溶性残渣を除
去し、上澄液を粗酵素液とした。上記懸濁液および粗酵素液とＤ―グルコースと
の接触反応とその結果を次に示す。 (3) 菌体懸濁液との接触反応液は、１／10モル―３，３―ジメチルグル
タール酸緩衝液（pH5.0）中で、グルコース濃度
が５W/V％、菌体濃度が660mμにおけるODで測
定して約10となるように調製した。この反応液を
23mm（直径）×196mm（長さ）の試験管に10mlづつ
分注したのち、28℃で３時間振盪反応させた。遠心分離後の上澄液をペーパー・クロマトグラ
フイにて分析し、次の第四表に総括した結果を得
た。（振盪開始前のグルコース濃度を示す）

【表】 (4) 粗酵素液との接触反応液は、１／10モル―３，３―ジメチルグル
タール酸緩衝液中でグルコース濃度が５W/V
％、粗酵素濃度がタンパク量〔フオーリン
（Folin）法にて測定〕として0.25mg/mlとなるよ
うに調製した。これを上記と同様に振盪したの
ち、10W/V％トリクロル酢酸２滴を加え、除タ
ンパク済の上澄液をペーパークロマトグラフイに
て分析し次の第五表に示す結果を得た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１Ｄ―グルコースを２，５―ジケト―Ｄ―グル
コン酸に変換する能力を有しエルウイニア・シト
レウス（Erwinia citreus）種に属する微生物。
２エルウイニア・シトレウス（Erwinia
citreus）SHS―2003株（FERM―P5449，ATCC
31623）である特許請求の範囲第１項に記載の微
生物。３Ｄ―グルコースを２，５―ジケト―Ｄ―グル
コン酸に変換する能力を有しエルウイニア・ブン
クタータ（Erwinia punctata）種に属する微生
物。４エルウイニア・ブンクタータ（Erwinia
punctata）SHS―2006株（FERM―P5452，
ATCC 31626）である特許請求の範囲第３項に記
載の微生物。５エルウイニア・ブンクタータ・バリ
（Erwinia punctata var.）SHS―2004株（FERM
―P5450，ATCC 31624）である特許請求の範囲
第３項に記載の微生物。６エルウイニア・ブンクタータ・バリ
（Erwinia punctata var.）SHS―2005株（FERM
―P5451，ATCC 31625）である特許請求の範囲
第３項に記載の微生物。７エルウイニア・ブンクタータ・バリ
（Erwinia punctata var.）SHS―2007株（FERM
―P5453，ATCC 31627）である特許請求の範囲
第３項に記載の微生物。８Ｄ―グルコースを２，５―ジケト―Ｄ―グル
コン酸に変換する能力を有しエルウイニア・テリ
ウス（Erwinia terreus）種に属する微生物。９エルウイニア・テリウス（Erwinia
terreus）SHS―2008株（FERM―P5454，ATCC
31628）である特許請求の範囲第８項に記載の微
生物。１０エルウイニア・テリウス・バリ（Erwinia
terreus var.）SHS―2009株（FERM―P5455，
ATCC 31629）である特許請求の範囲第８項に記
載の微生物。１１エルウイニア・テリウス・バリ（Erwinia
terreus var.）SHS―2010株（FERM―P5456，
ATCC 31630）である特許請求の範囲第８項に記
載の微生物。１２エルウイニア・テリウス・バリ（Erwinia
terreus var.）SHS―2011株（FERM―P5457，
ATCC 31631）である特許請求の範囲第８項に記
載の微生物。