JPH0337918B2

JPH0337918B2 -

Info

Publication number: JPH0337918B2
Application number: JP3545382A
Authority: JP
Inventors: Takayasu Sonoyama; Bunji Kageyama; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1991-06-07
Also published as: JPS58162297A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の生育に関
し殊に、コリネバクテリウム属に属する２−ケト
−Ｌ−グロン酸生産菌株より誘導した５−ケト−
Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株を用いて、２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を得る際、硝酸塩類及び水素供与体となり
得る炭水化物、有機酸を加えることにより、高収
率に生産量を増加させながら２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸を製造する方法を係る。本発明者らは、さきに、２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸より、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成
し得る多くの微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生
産菌株（））を見い出し、之を使用する２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の製造方法を発明した。（特公
昭50−21559号、特公昭53−25033号および特公昭
56−15877号公報参照）。（）は、いずれも原料
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸より主生成物２
−ケト−Ｌ−グロン酸を生成するほか、副生成物
として２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成するが、
この不望所な２−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中
に蓄積させずに、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸を得る方法として
混合培養法（特公昭54−19468号公報参照）や、
５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）
を用いる培養法を発明した。ここで言う５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損
変異株（）とは、２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産するコリ
ネバクテリウム属の属する微生物（２−ケト−Ｌ
−グロン酸生産菌株（）と称する）を変異さ
せ、５−ケト−Ｄ−グルコン酸には生育しない
か、またはほとんど生育せず且つＤ−グルコン酸
によく生育するよう誘導した変異株を意味する。この５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株
（）を生育させ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸と接触させると２−ケト−Ｄ−グルコン酸を実
質的に併産せずに２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成
させうる。（）の例して（）であるコリネバ
クテリウム・スピーシーズFERM−P2770、
ATCCNo.31090）より誘導したた変異株（微工研
条寄FERM−BP108）や（）であるコリネバ
クテリウム・スピーシーズ（FERM−P2687、
ATCCNo.31081）より誘導した変異株（微工研条
寄FERM−BP107）等が挙げられる。上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝能を欠損させることによつて２−ケト−
Ｄ−グルコン酸産生能を欠損あるいは著しく弱化
させ得た事実は、コリネフオーム・グループ（バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー第８版の定義による）に属する
すべての２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌に関して
共通のことである。上記（）を用いて、２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸より２−ケト−Ｄ−グルコン酸を蓄積さ
せずに２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成させる方法
において、本発明者らは（）を生育させる培地
に硝酸塩類を添加するか、さらに２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸との接触時にも硝酸塩類を加え
また２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸添加と同時
に水素供与体を添加することにより２−ケト−Ｌ
−グロン酸の生成量が増加し且つ２−ケト−Ｌ−
グロン酸の生成収率が向上することを見い出し本
発明を完成した。すなわち本発明によれば、コリ
ネバクテリウム属に属する２−ケト−Ｌ−グロン
酸生産菌株（）より誘導した５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸代謝欠損変異株（）を、培地に生育さ
せ、この培地を２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
またはその塩類と接触させ、培地中に２−ケト−
Ｌ−グロン酸を蓄積させ、これを採取する２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の製造方法において、２，５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸またはその塩類との接触
の際、水素供与体を添加するとともに、上記５−
ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）の生
育培地および、これに接触させる２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸またはその塩類のうち少なくと
も一方に硝酸塩類を添加することを特徴とする方
法が提供される。（）の培養にあたり、使用され得る栄養培地
としては、特別な制限はない。たとえば、炭素源
として、Ｄ−グルコース、グリセリン、シユーク
ロース、廃糖蜜などを0.2〜５％の濃度で用い、
窒素源としては、コーン・ステイープ・リカー、
ペプトン、肉エキス、大豆粉末等を0.5〜５％の
濃度で用いる。また、無機塩類（カルシウム、マ
グネシウム、カリウム、亜鉛、マンガン、鉄など
の塩類）や各種ビタミン等を加えることもある。
こうした培地に硝酸塩類を0.1〜0.5％の濃度で添
加し（）を培養すると、培養開始後10〜24時間
で菌の生育は最大となる。また生育が最大に達し
た時相あるいは、この時相から10時間以内にさら
に硝酸塩類を0.05〜0.5％の濃度で添加する。硝
酸塩類としては硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等
のアルカリ金属塩や硝酸ウルシウム、硝酸マグネ
シウム、等アルカリ土類金属塩等が用いられる。
硝酸塩類の添加は（）の培養開始当初の培地に
対して行つてもよく、また２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸添加時に１度にあるいはその後数回に
分けて添加してもよい。このことにより２−ケト
−Ｌ−グロン酸生産量の増加効果が認められる。
硝酸塩類は培養開始時および、２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸添加開始時と同時期に加える事が
望ましい。また硝酸塩類の添加効果は、２，５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸添加と同時に水素供与体
を加えることによりさらに顕著となる。すなわち
２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成量が顕著に増大す
るのである。水素供与体としては、菌が利用し得る炭水化物
および有機酸を用いることができる。水素供与体
は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加と同
時に加える事が望ましく、２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸液に加えて一緒に添加することが望ま
しい。水素供与体の濃度は、２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸の添加条件、使用する菌株や培地条
件などによつても異なるが、普通、添加する２，
５−ジケト−Ｄ−グルコン酸量の５％〜50％の範
囲で加える。原料の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸として
は、エルウイニア属、グルコノバクター属（ここ
で言うグルコノバクター属とは、バージーズ・マ
ニユアル・オブ・デタミナテイブ・バクテリオロ
ジー第８版に準拠するもので、同第７版における
アセトバクター属、アセトモナス属、グルコノバ
クター属を含む。）に属する２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸生産菌株による２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸含有発酵液を過除菌あるいは薬剤
（例えばドデシル硫酸ナトリウムなど）による殺
菌処理を施して用いる。添加する２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の量
は、使用する菌株や培養条件により異なるが、通
常１〜10％の最終濃度になるように２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸液を、１度にあるいは少量ず
つ間欠的に添加する。１回に添加する２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸の量は培養液全体に対し
て、0.05％〜２％になるように調節することが望
ましい。培養は普通２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸添加開始後、24〜96時間行ない、培養液中の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸が、消失する時
点をもつて培養の終点とする。本発明方法における、硝酸塩類の添加効果は、
水素供与体として加えられた炭水化物および有機
酸などの菌体による代謝に関与し、菌体内の２，
５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｌ−
グロン酸への還元系を活性化させ、水素供与体よ
り得られる水素を効率よく還元系に与える役割を
有するものである。水素供与体を加えず硝酸塩類
を加えても、２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成量は
少なく、水素供与体を加えることによりはじめて
顕著に２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成量の増加及
び収率の向上が認められる。上記の如き効果の他
に、硝酸塩類を添加することにより２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸
生成時の培養液のPHを２−ケト−Ｌ−グロン酸生
成に好ましい6.5〜8.0に長時間保つ効果など副次
的な効果もあらわれる。硝酸塩類は窒素源としての効果よりは、水素供
与体の代謝と、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸
の２−ケト−Ｌ−グロン酸への還元系の活性化お
よび安定化に寄与する効果が大きい。窒素源としての効果は、菌量の増加等でみられ
るが、同様な無機塩類のうちでは、アンモニウム
塩の方が、この効果が大きい。すなわち窒素源と
してアンモニウム塩を培養開始時や、２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸添加時に加えると菌量の増
加に対する効果はあるが、２−ケト−Ｌ−グロン
酸生成に対する効果は小さい。これに対して硝酸塩類は菌量の増加効果はアン
モニウム塩に比べると小さいが、２−ケト−Ｌ−
グロン酸生成量は顕著に増加する。以下実施例によつて本発明をより詳細に説明す
る。実施例１ (1) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の調
製培地−ＡＤ−グルコース 1.0％コーン・ステイープ・リカー（CSL） 5.0％第１リン酸カリウム（KH₂PO₄） 0.1％硫酸マグネシウム（MgSO₄・7H₂） 0.02％（PH6.8〜7.に調整、培地50ml／500ml容三角フ
ラスコ、115℃、20分間滅菌）培地−ＢＤ−グルコース 20.0％ CSL 3.0％ KH₂PO₄ 0.1％炭酸カルシウム（CaCO₃） 6.3％消泡剤ポリプロプレングリコール（Ｐ−
2000） 0.01％（PH6.8〜7.0に調整、培地500mlを115℃、20分
間滅菌後、予め空滅菌された１容発酵槽に無
菌的に分注。）エルウイニア・プンクタータ（FERM−
P5452）を培地Ａに１白金耳植菌して、28℃、
８〜11時間振盪培養した。（振幅71mm、回転数
270r.p.m.以下同じ）。光学密度（O.D.）が約８
となる時をもつて、この培養液５mlを培地Ｂに
植菌する。１発酵槽で、28℃、1.2v.v.m、
1740r.p.m、の培養条件下で20−30時間培養し
た。下記(5)で記載する薄層クロマトグラフイー
にて、２−ケト−Ｄ−グルコン酸が消失した時
点をもつて培養の終点とした。この発酵液を遠
心分離（10000r.p.m、15分）後菌体を除去し、
上清を予め滅菌された過器で過除菌した。
（２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸濃度＝
19w／ｖ％）水素供与体として、Ｄ−グルコースを50％溶
液として予め滅菌しておき、最終濃度3.8％に
なるように発酵液に加えた。 (2) 種培地（２−ケト−Ｌ−グロン酸製造用）Ｄ−グルコース 1.0％バクト・イーストエキストラクト（Difco）
0.5％バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％（PH6.8〜7.0に調整、培地50ml／500ml容三角
フラスコ、115℃、20分間滅菌） (3) 本発酵培地（２−ケト−Ｌ−グロン酸製造
用）Ｄ−グルコース 2.0％ CSL 3.0％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％消泡剤ポリプロピレングリコール（Ｐ−
2000） 0.01％（PH7.0〜7.2に調整、培地450mlを115℃、20分
間滅菌後、予め空滅菌された１発酵槽に無菌
的に分注） (4) 添加窒素化合物の調製培養開始時、および２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸添加開始時に培地に加える硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウム、亜硝酸ナトリウム、塩化
アンモニウムは、各々10％の水溶液にし、予め
滅菌された過器で過除菌した。 (5) 分析方法 (i) ２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−
グルコン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸の定量方法ガスクロマトグラフイーカラム：SE52（５％）キヤリアーガス：ヘリウムカラム温度：160℃〜210℃ サンプル：トリエチルシリル化薄層クロマトグラフイー担体：TLCアルミシートセルロース（メ
ルク商品名）展開液：フエノール：ギ酸：水＝75：４：
25 発色：AHF溶液（アニリン0.93ｇとフタ
ール酸1.66ｇを水飽和ｎ−ブタノール100ml
に溶解したもの）を噴霧、105℃、２分間処
理。 (ii) グルコース定量法：グルコース・Ｂテスト
（和光純薬）にて定量。コリネバクテリウム・スピーシーズ（FERM
−Ｐ 2770、AHCCNo.31090）より誘導した５−
ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（FERM
−BP108）を１白金耳種培地(2)に植菌し、28℃で
20〜24時間振盪培養した。この種培養液50mlを本
培地(3)に植菌し(4)で調製した各窒素化合物を最終
濃度0.25％になるように無菌的に添加した後、通
気量1.2v.v.m.、撹拌、1740r.p.m、28℃で10〜16
時間培養した。(5)で記載したグルコース定量法で
グルコースが培養液より消失したことを確認し、
(4)の窒素化合物を各々最終濃度0.1％になるよう
に加え、(1)のグルコース3.8％を含む２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸発酵液を最終濃度0.2％に
なるように加えたた。以後培地中の２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸の減少をみながら１回に添加
する２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の最終濃度
が、約0.2％になるように、15〜120分の間隔で、
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を添加した。
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加は添加開
始後45時間目で停止し、さらに３時間培養を継続
し添加開始後48時間目まで培養した。培養後、培
養液を(5)で記載したガスクロマトグラフイーにて
２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、を定量
した。その結果いずれの培養液中からも２−ケト
−Ｄ−グルコン酸は検出されなかつた。各種窒素
化合物を添加した培養液中の２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸蓄積量を第１表に示した。

【表】第１表からも明らかなように硝酸塩を培養開始
時に加え、さらに２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸添加開始時に硝酸塩を加え且つ２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸添加と同時に水素供与体として
Ｄ−グルコースを添加した場合を、硝酸塩を加え
ず且つ水素供与体を加えない場合と比較すると、
２−ケト−Ｌ−グロン酸の蓄積量は8.2mg／mlよ
り40.2mg／mlと約５倍に増加し、２−ケト−Ｌ−
グロン酸の生成収率（モル比％）は、41％より93
％に向上した。また硝酸塩の窒素源としての効果をみる為、グ
ルコース消失時点での菌量を光学密度（O.D.）
より測定したところ、第２表に示すように硝酸塩
を添加した場合11.6％の菌量の増加にとどまるが
塩化アンモニウムを添加した場合約40％菌量が増
加する。すなわち硝酸塩の窒素源としての効果
は、アンモニウム塩に比べ小さいことを示してい
る。以上の事実から硝酸塩の添加が、培地中の窒素
源として菌の増加に対する効果は小さく、一方２
−ケト−Ｌ−グロン酸の生成量を増加させる効果
および２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−
ケト−Ｌ−グロン酸への生成収率を向上させる効
果が大きいことが確認された。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１コリネバクテリウム属に属する２−ケト−Ｌ
−グロン酸生産菌株（）より誘導した５−ケト
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）を、培地
に生育させ、この培地を２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸またはその塩類と接触させ、培地中に２
−ケト−Ｌ−グロン酸を蓄積させ、これを採取す
る２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法において、
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸またはその塩類
との接触の際、水素供与体を添加するとともに、
上記５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株
（）の生育培地および、これに接触させる２，
５−ジケト−Ｄ−グルコン酸またはその塩類のう
ち少なくとも一方に硝酸塩類を添加することを特
徴とする方法。２前記変異株（）が２−ケト−Ｄ−グルコン
酸を実質上生産しないものであることを特徴とす
る特許請求の範囲１に記載の方法。３前記硝酸塩が硝酸アルカリ金属またはアルカ
リ土類金属であることを特徴とする特許請求の範
囲１に記載の方法。４前記水素供与体が、炭水化物および有機酸よ
り選ばれたものであることを特徴とする特許請求
の範囲１に記載の方法。