SK278555B6

SK278555B6 - Method of producing l-lactic acid

Info

Publication number: SK278555B6
Application number: SK61492A
Authority: SK
Inventors: Michal Rosenberg; Ludmila Kristofikova
Original assignee: Michal Rosenberg; Ludmila Kristofikova
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1997-09-10
Also published as: SK61492A3

Abstract

The production of L-lactic acid is based on that principles, that the micro-organism related to the family called Rhizopus is cultivated with the use of the sub-mersous procedure, while the micro-organism strain closed to the Rhizopus arrhizus CCM 8109 is suitable for these purposes and the above mentioned cultivation is provided at the temperature of 28 up to 48 Celsius degrees, in the environment with pH value of 3,0 up to 7,0 containing 6 up to 25 weight percent of saccharide substrate, however an increase and a decrease of the temperature and pH value closed to the fermentation medium can be provided based on the step by step principle.

Description

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka spôsobu výroby kyseliny L-mliečnej.The invention relates to a process for the production of L-lactic acid.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kyselinu mliečnu (t. j. kyselinu 2-hydroxypropánovú) produkuje široká paleta mikroorganizmov. Na priemyselnú produkciu sa používajú predovšetkým baktérie rodu Lactobacillus, ktoré môžu vytvárať okrem L(+)-formy tiež D(-) a DL-ťormu tejto kyseliny. Výhodou bakteriálnej fermentácie je anaeróbny režim procesu a s ním spojená jednoduchosť kultivačného zariadenia. Nevýhoda bakteriálneho producenta spočíva v potrebe komplexného, na výživové faktory bohatého produkčného média a tiež v produkcii vedľajších metabolitov (organické kyseliny, polyoly a pod.) [Vickroy, T. B.: In Comprehensive Biotechnology, Vol. 3., str. 761-776, Pergamon Press, 1985],Lactic acid (i.e., 2-hydroxypropanoic acid) is produced by a wide variety of microorganisms. For industrial production, mainly bacteria of the genus Lactobacillus are used, which in addition to the L (+) - form can also form the D (-) and DL-form of this acid. The advantage of bacterial fermentation is the anaerobic mode of the process and the associated simplicity of the cultivation equipment. The disadvantage of a bacterial producer lies in the need for a complex, nutrient-rich production medium, as well as in the production of side metabolites (organic acids, polyols, etc.) [Vickroy, T. B .: In Comprehensive Biotechnology, Vol. 3, p. 761-776, Pergamon Press 1985]

Z vláknitých húb patrí medzi producentov kyseliny mliečnej predovšetkým rod Rhizopus, druhy arrhizus a oryzae. Producenti sú menej nároční na výživové faktory a navyše vykazujú vysokú stereošpecifitu (produkujú výhradne L(+)-formu kyseliny mliečnej). Tento fakt je veľmi významný z hľadiska fermentačnej prípravy vápenatej soli kyseliny mliečnej, pretože pri použití laktobacilov, vďaka minimálnej aerácii a minimálnemu miešaniu, je neutralizácia uhličitanom vápenatým problematická a významne predlžuje čas fermentácie, ovplyvňuje výťažky, hladinu zvyškových sacharidov a pod.Of the filamentous fungi, the lactic acid producers are mainly Rhizopus, arrhizus and oryzae. Producers are less demanding on nutritional factors and, moreover, show a high stereospecificity (they produce exclusively the L (+) - form of lactic acid). This fact is very important in the fermentation preparation of the lactic acid calcium salt, because with the use of lactobacilli, due to minimal aeration and minimal mixing, calcium carbonate neutralization is problematic and significantly prolongs the fermentation time, affects yields, residual carbohydrate levels and the like.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatou spôsobu prípravy kyseliny L-mliečnej podľa vynálezu je, že sa submerzne kultivuje vláknitá huba rodu Rhizopus vo vodnom živnom médiu pri teplote 28-48 °C, hodnote pH 3,5 až 7,0 s obsahom 8-25 % hmotn. sacharidického substrátu. Ako produkčné mikroorganizmy je možné použiť druhy Rhizopus arrhizus alebo Rhizopus oryzae, výhodne mutanty kmeňa Rhizopus arrhizus R-41 (CCM 8109) vykazujúce vysokú selektivitu a rýchlosť konverzie. Výhodné je fermentovať pri vyššom obsahu sacharidického substrátu tak, že v priebehu fermentácie je postupne zvyšovaná teplota a znižovaná hodnota pH fermentačného média. Tento režim zabezpečí prípravu vyšších koncentrácii kyseliny L-mliečnej a zároveň zamedzí možnej precipitácii vznikajúcich solí kyseliny L-mliečnej, predovšetkým vápenatých . Navyše umožňuje pripraviť zmes voľnej kyseliny L-mliečnej a jej príslušnej soli, čo podstatne zlepší efektivitu izolácie čistej kyseliny L-mliečnej i celého procesu.It is an object of the process for preparing L-lactic acid according to the invention that a filamentous fungus of the genus Rhizopus is submerged in an aqueous nutrient medium at a temperature of 28-48 ° C, a pH of 3.5 to 7.0 with a content of 8-25% by weight. a saccharide substrate. Rhizopus arrhizus or Rhizopus oryzae species, preferably Rhizopus arrhizus R-41 (CCM 8109) mutants showing high selectivity and conversion rate, can be used as production microorganisms. It is advantageous to ferment at a higher content of the saccharide substrate such that the temperature and the pH of the fermentation medium are gradually increased during fermentation. This regime ensures the preparation of higher concentrations of L-lactic acid while avoiding the possible precipitation of the resulting salts of L-lactic acid, especially calcium. Moreover, it makes it possible to prepare a mixture of free L-lactic acid and its corresponding salt, which substantially improves the efficiency of the isolation of pure L-lactic acid and of the entire process.

V priebehu kultivácie sa hodnota pH udržiava prídavkom alkalický reagujúcich roztokov, hlavne NaOH, KOH, NH₄OH, CaCO₃, Ca(OH)₂ výhodne vápenatých iónov, ktoré umožňujú jednoduchú prípravu voľnej kyseliny L-mliečnej z vyfermentovaného média po prídavku kyseliny sírovej a seperácii vzniknutého síranu vápenatého. Kyselina L-mliečna sa bude nachádzať v kultivačnom médiu i vo forme zodpovedajúcich solí, ktoré spadajú taktiež v tomto texte do výrazu „kyselina L-mliečna“.During cultivation, the pH is maintained by the addition of alkaline reacting solutions, in particular NaOH, KOH, NH ₄ OH, CaCO ₃ , Ca (OH) _2, preferably calcium ions, which allow easy preparation of free L-lactic acid from fermented medium after addition of sulfuric acid; separation of the resulting calcium sulfate. L-lactic acid will be present both in the culture medium and in the form of the corresponding salts, which also fall within the term "L-lactic acid".

Fermentačné médium sa intenzívne mieša a prevzdušňuje výhodne 0,2-1,0 objemu vzduchu na objem fermentačného média. Na zaočkovanie produkčného fermentora je výhodné použiť vegetatívne inokulum, ktoré sa získa 18 až 28-hodinovou submerznou kultiváciou spór producenta a dávkuje sa do produkčného fermentora v množstve od 5 do 25 % celkového objemu.The fermentation medium is vigorously stirred and aerated preferably 0.2-1.0 volume of air per volume of fermentation medium. To inoculate the production fermenter, it is preferable to use a vegetative inoculum which is obtained by 18 to 28-hour submerged culture of the producer spores and is metered into the production fermenter in an amount of 5 to 25% of the total volume.

Fermentačné médium obsahuje sacharidický substrát v množstve 6-25 % hmotn. Pod sacharidickým substrá5 tom sa rozumie glukóza, kyslé a enzýmové hydrolyzáty škrobu, sacharóza, medziprodukty a odpady pri výrobe sacharózy, predovšetkým afinády, rafinády, ľahké a ťažké šťavy, kléry i ďalšie substráty obsahujúce voľnú glukózu, resp. sacharózu.The fermentation medium contains a carbohydrate substrate in an amount of 6-25 wt. Carbohydrate substrates are understood to be glucose, acidic and enzymatic hydrolysates of starch, sucrose, intermediates and wastes in the production of sucrose, in particular affinades, raffinates, light and heavy juices, clergy and other substrates containing free glucose, respectively. sucrose.

Fermentácia sa robí až do vyčerpania substrátu.Fermentation is carried out until the substrate is depleted.

Napr. za 48 hod. kultivácie možno konvertovať 15 % roztoky glukózy, resp. sacharózy na kyselinu L-mliečnu s výťažkom 90-95 % teoreticekj hodnoty (zo 100 g glukózy, resp. sacharózy vzniká teoreticky 75 g, resp. 78 g kyseliny L-mlicčncj). Obsah ostatných organických kyselín neprekročí 0,5 % hmotn. Treba počítať s určitými odchýlkami v reakčných časoch i vo výťažkoch v závislosti od použitého zariadenia a podmienok kultivácie.E.g. in 48 hours 15% glucose solutions, respectively. sucrose to L-lactic acid with a yield of 90-95% of the theoretical value (from 100 g of glucose and sucrose, respectively, 75 g and 78 g of L-lactic acid, respectively) are formed. The content of other organic acids shall not exceed 0,5% by weight. Some variations in reaction times and yields should be considered depending on the equipment used and the culture conditions.

Kyselinu L-mliečnu je možné pripraviť z vyfermen20 tovaného média po seperácii biomasy pôsobením minerálnej kyseliny alebo inými bežnými priemyselnými postupmi (katexy, reverzná osmóza a pod.).L-lactic acid can be prepared from the fermented medium after separation of the biomass by treatment with mineral acid or other conventional industrial processes (cation exchangers, reverse osmosis, etc.).

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Pripraví sa inokulačné médium, ktoré obsahuje v 1 dm³ vodovodnej vody 15 g glukózy, 10 g melasy, 20 g 30 kukuričného škrobu, 4,0 g (NH^SO,,, 1,6 g KH₂PO₄, 0,25 g MgSO₄.7H₂O, 0,066 g ZnSO₄.7H₂O, 0,01 g Fe₂(SO₄)₃.9H₂O a 3,0 g kukuričného výluhu.An inoculation medium containing in 1 ^dm3 of tap water 15 g of glucose, 10 g of molasses, 20 g corn starch 30, 4.0 g (NH ^ SO ,,, 1.6 g KH ₂ PO _4, 0.25 g MgSO ₄ .7H ₂ O, 0.066 g ZnSO ₄ .7H ₂ O, 0.01 g Fe ₂ (SO ₄ ) ₃ .9H ₂ O and 3.0 g corn steep liquor.

0,1 dm³ inokulačného média v 0,5 dm³ kultivačných bankách sa zaočkuje spórami produkčného mikroorga35 nizmu Rhizopus arrhizus CCM 8109 (koncentrácia spór v rozmedzí l-3.10⁶/ml média), ktoré boli pripravené 14-týždňovou kultiváciou na pevnom kultivačnom médiu. Po 24-hodinovej kultivácii na rotačnej trepačke pri 30 °C sa submerzná kultúra produkčného mikroorga40 nizmu použije na inokuláciu 4,5 dm³ produkčného média vo fermentore s objemom 7 dm³ v množstve 7 % obj. Produkčné médium obsahuje v 1 dm³ vodovodnej vody: 120 g glukózy, 2,0 g (NH4)2SO4, 0,3 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4.7H2O, 0,01 g Fe2(SO4)3.9H2O, 0,044 g 45 ZnSO4.7H2O, 0,5 g kukuričného výluhu. Samotná fermentácia sa uskutočňuje pri teplote 28 °C, vzdušnení 3 dm³/min, miešaní 420 ot/min. a pretlaku 0,0ΙΌ,03 MPa. Hodnota pH fermentačného média sa udržuje prídavkom CaCO3 alebo Ca(OH)₂ na hodnote 5,550 -6,0. Po dosiahnutí koncentrácie kyseliny L-mliečnej g/1 sa vo fermentore postupne zvyšuje teplota (2 °C na každých naprodukovaných 5 g/1 kyseliny L-mliečnej) a znižuje pH (na každých 5 g/1 naprodukovanej kyseliny L-mliečnej sa hodnota pH zníži o 0,25). Po 42 hodinách 55 kultivácie obsahuje fermentačné médium 86 g/1 kyseliny L-mliečnej t. j. 95,5 % teoretickej hodnoty. Zvyšková koncentrácia glukózy je menšia ako 0,1 g/1.0.1 dm ³ inoculum medium in 0.5 dm ³ culture flasks were inoculated with spores of Rhizopus arrhizus CCM 8109 producing micro-organism35 (spore concentration ranging from 1-3.10 ⁶ / ml medium), which were prepared by 14-week culture on solid culture medium. . After cultivation on a rotary shaker at 30 ° C for 24 hours, a submerged culture of production micro-organism 40 is used to inoculate 4.5 dm ³ production medium in a 7 dm ³ fermenter at 7% v / v. Production medium contains in 1 dm ³ tap water: 120 g glucose, 2.0 g (NH4) 2SO4, 0.3 g KH2PO4, 0.4 g MgSO4.7H2O, 0.01 g Fe2 (SO4) 3.9H2O, 0.044 g 45 ZnSO4.7H2O, 0.5 g corn steep liquor. The fermentation itself is performed at 28 ° C, aeration of 3 dm ³ / min, stirring 420 rpm. and overpressure 0,0ΙΌ, 03 MPa. The pH of the fermentation broth is maintained at 5.550 -6.0 by the addition of CaCO3 or Ca (OH) ₂ . After reaching the L-lactic acid concentration g / l, the temperature in the fermenter is gradually raised (2 ° C for each 5 g / l of L-lactic acid produced) and the pH decreases (for every 5 g / l of L-lactic acid produced) by 0.25). After 42 hours of cultivation, the fermentation medium contains 86 g / L of L-lactic acid, i.e. 95.5% of the theoretical value. The residual glucose concentration is less than 0.1 g / L.

Príklad 2Example 2

Pripraví sa enzýmový hydrolyzát kukuričného škrobu s obsahom 98 % D-glukózy. Príprava inokula, zloženie médií a podmienky fermentácie sú analogické ako v príklade 1, len hodnota pH média je udržiavaná prídavkom 20 % NH₄OH. Čas fermentácie a výťažky sú analo65 gické ako v príklade 1.An enzyme cornstarch hydrolyzate containing 98% D-glucose is prepared. Inoculum preparation, media composition and fermentation conditions are analogous to Example 1 except that the pH of the medium is maintained by the addition of 20% NH ₄ OH. The fermentation time and yields are analogous to Example 1.

SK 278555 Β6SK 278555-6

Príklad 3Example 3

Pripraví sa 4,2 dm³ inokulačného média v 7 dm³ fermentačnej nádobe a zaočkuje sa spórovým inokulom analogicky ako v príklade 1. Zloženie inokulačného média je analogické ako v príklade 1, len miesto glukózy je po- 5 užité analogické množstvo sacharózy. Po 24 hodinovej kultivácii (teplota 30 °C, vzdušnenie 2 dm³/min, miešanie 300 ot/min, pretlak 0,02 MPa) sa takto pripravená submerzná kultúra použije na inokuláciu produkčného fermentora v množstve 7 % obj. Produkčné médium obsa- 10 huje namiesto glukózy sacharózu v koncentrácii 180 g/1. Samotná fermentácia sa uskutočňuje v 20 dm³ fermentačnej nádobe s 14 dm³ fermentačného média. Fermentácia prebieha spočiatku pri teplote 33 °C, vzdušnení 8 1/min, miešaní 400 ot/min. a pretlaku 0,02 MPa. Hodnota pH je 15 udržiavaná prídavkom CaCO₃ alebo Ca(OH)₂ v rozsahu 5,5-6,0. Po dosiahnutí koncentrácie kyseliny L-mliečnej 70 g/1 sa zvyšuje na každých 10 g/1 kyseliny, teplota o 2 °C a pH sa znižuje o hodnotu 0,3 jednotky pH. Pri zostatkovej koncentrácii sacharózy 0,2 g/1 sú dosahované 20 výťažky kyseliny mliečnej v rozsahu 92-96 % teoretickej hodnoty.4.2 dm ³ inoculum medium is prepared in a 7 dm ³ fermentation vessel and inoculated with a spore inoculum analogously to Example 1. The composition of the inoculum medium is analogous to Example 1 except that an analogous amount of sucrose is used instead of glucose. After 24 hours cultivation (temperature 30 ° C, aeration of 2 dm ³ / min, stirring 300 rpm, overpressure 0.02 MPa), the submerged culture thus prepared is used to inoculate the production fermenter in an amount of 7% by volume. The production medium contains sucrose at a concentration of 180 g / l instead of glucose. The fermentation itself is carried out in a 20 dm ³ fermentation vessel with a 14 dm ³ fermentation medium. The fermentation is initially carried out at a temperature of 33 ° C, aeration of 8 l / min, stirring at 400 rpm. and overpressure of 0.02 MPa. The pH is maintained by the addition of CaCO ₃ or Ca (OH) ₂ in the range of 5.5-6.0. After reaching a L-lactic acid concentration of 70 g / l, it is increased for every 10 g / l of acid, the temperature is 2 ° C and the pH is lowered by 0.3 pH unit. At a residual sucrose concentration of 0.2 g / l, 20 yields of lactic acid in the range of 92-96% of the theoretical value are achieved.

Priemyselná využiteľnosť 25Industrial applicability

Vynález je využiteľný pri výrobe kyseliny L-mliečnej, prípadne jej solí, ktoré majú široké použitie v potravinárstve, farmácii, chemickom priemysle a ďalších oblastiach. 50The invention is useful in the production of L-lactic acid or its salts, which are widely used in the food, pharmaceutical, chemical and other fields. 50

Claims

Process for the production of L-lactic acid or its salts, characterized in that a microorganism of the genus Rhizopus, preferably the strain Rhizopus arrhizus CCM 8109, is submerged in an aqueous nutrient medium at a temperature of 28-48 ° C, a pH of 3.0 to 7 % With a content of 6 to 25 wt. a saccharide substrate.

Production method according to claim 1, characterized in that during the cultivation the temperature is gradually raised and the pH of the fermentation medium is lowered.