JPS63112989A - ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）の合成前
駆体として有用な２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造法に関
する。

従来の技術 ビタミンＣ合成前載体として有用な２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸は、ライヒシュタイン法〔ヘルベチカ・キミカ・ア
クタ（Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　　ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ
）第１７巻３１１頁（１９３’４））によって工業的に
生産されてきた。しかし、この方法は工程数が多く、全
体としての収率の向上が期待できないため、もっと有効
な生産方法を見いだすことが必要になってきた。

ライヒシュタイン法に代わる方法として、微生物により
、グルコースから５−ケト−グルコン酸を生成し、これ
を化学的または微生物によりイドン酸とし、更にこれを
微生物的に酸化して２−ケト−Ｌ−グロン酸に導く方法
（米国特許第２．４２１．６１１号）やグルコースから
微生物により２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成し
、化学的または、微生物により２−ケト−Ｌ−グロン酸
に還元する方法（特公昭３９−１４４９３号、特公昭５
３−２５０３３号、特公昭５６−１５８７７号、特公昭
５９−３５９２０号）が検討されてきた。しかしこれら
の方法に用いられる化学的還元工程は、立体特異的でな
く、前者ではＤ−グルコン酸を、後者では、２−ケト−
Ｄ−グルコン酸を副生じ収率の低下をきたす。またこの
工程を微生物により行う場合は、還元エネルギー源とし
て余分の炭素源を供給せねばならない。

また、　Ｌ−ソルボースを出発原料として２−ケト−Ｌ
−グロン酸を製造する方法がしられており、この場合は
、酸化工程のみで、還元工程を含まずに製造できる。こ
の方法の例として今までに、グルコノバクタ−（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、シュードモナス属、セラチ
ア（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ）属、アクロモバクタ−（Ａ
　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、　アルカリゲネス（
Ａ　ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の細菌を用いた方法が知
られている〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ａｎ
ｄ　　Ｂ　ｉｏ　−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）第１４巻
７９９頁（１９７２）、特公昭４１−１５９号、特公昭
４１−１６０号、米国特許第３．０４３，７４９号、特
公昭４９−３９８３８号、中国微生物学報、第２０巻第
２４６頁（１９８０）および第２１巻第１８５頁（１９
８＋）、ソ連特許第５２６，６６０号参照〕。しかしこ
れまでに公表されている菌株によるし一ソルボースから
の２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成収率は極めて低く、到
底工業的に利用し得るものではなかった。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、Ｌ−ソルボースから高収率で２−ケト−
Ｌ−グロン酸を生成する微生物株を得るため、日本国内
で採取した土壌試料から多数の菌株を分離し、検索した
結果、従来の知見を遥かに上回る収率（消費糖当り約８
０％）を示す細菌、分離菌株番号５２Ｇ−２１，５２６
−２２及び５２６−４２の３菌株を見いだした。これら
３菌株について鋭へ研究を行い、今までに知られていな
いシュードモナス属の新菌種であることを見いだし、本
発明を完成した。

即ち、本発明は、シュードモナス・ツルボッキンダンス
に属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸
化する能力を有する微生物、またはその処理物を、Ｌ−
ソルボースと接触させて、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生
成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする２−
ケト−Ｌ−グロン酸の製造法を提供するしのである。ま
た、本発明は、極鞭毛を２本以上有する運動性桿菌で、
グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成せず
、イソプレンユニット数１０のユビキノンを有し、生育
にヂアミン、リボフラビン、およびパントテン酸を必須
に要求するシュードモナス属の新菌種であるシュードモ
ナス・ツルボッキジダンスを提供するものである。

本発明台らが見いだした３菌株の分類学的性状は、次の
通りである。

（ａ）形態 （１）桿菌。０．３〜０．５Ｘ０．７〜１．４μｍ。

（２）多形性は認められない。

（３）運動性があり、２本以上の極鞭毛有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）ダラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状聾 （１）肉汁寒天平板培養：生育中程度。円形、金縁、平
滑、乳白色の集落を形成する。

（２）肉汁寒天斜面培養：生育中程度。糸状、平滑、乳
白色。

（３）肉ｔＦ液体培養：生育中程度。沈澱を生じる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養　上部のみ生育するが、ゼ
ラチンを液化しない。

（５）リドマスミルク：酸性化するか、凝固、分解は認
められない。

（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩のぶ元は微弱。

（２）脱窒反応陰性。

（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは弱陽性。

（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは弱
陽性。

（５）インドールを生成しない。

（６）＠化水素を生成しない。

（７）デンプンの加水分解は陰性。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を窒素源として利用できる。

（１０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼ陽性。

（１２）オキシダーゼ陽性。

（１３）カタラーゼ陽性。

（１４）１５〜３６℃で生育し、至適生育温度は３０℃
付近。ｐＨ５，５〜８．７で生育し、至適生育ｐｌ−［
は６．０〜７．５゜ （１５）好気的。

（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストは酸化的。

（１７）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラ
クトース、麦芽糖、しよ糖、乳糖、トレハロースから微
弱に酸を生成するが、ガスは生成しない。Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デンプ
ンから酸、ガスを生成しない。

（ｄ）その他の性質 （１）ＤＮＡのグアニンとシトシン含量は約６７モル％
である。

（２５イソプレンユニツト数ＩＯのユビキノンを有する
。

（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成しない。

（４）生育にチアミン、リボフラビン、パントテン酸を
必須に要求し、ビオチン、カザミノ酸により生育を促進
される。

以上の分類学的性状を、パーシーズ・マニュアル・□オ
ブ・システマティック・バクテリオロジ−（Ｉ３ｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｒ　　Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃＢ　ａｃｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ）第１巻（１９８
４年）に照合してみると、これら菌株はいずれも、グラ
ム陰性、極鞭毛を有する運動性桿菌で、好気性、オキシ
ダーゼ陽性であることから、シュードモナス属の細菌種
と考えるのが妥当である。生育にビタミン、アミノ酸を
要求すること、ＤＮＡのグアニンとシトシンの含量が６
７モル％であることから、この属のセクション■に分類
される。また、イソプレンユニット数ＩＯのユビキノン
を有することから、このセクションのシュードモナス　
ディミニュータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｉｍｉｎ
ｕｔａ）及びシュードモナスベシキュラリス（Ｐ　ｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に近縁
な種と考えられる。しかしながら、鞭毛の着生数、糖の
資化性等で、前記２菌種と異なり、シュードモナス属の
既知種の中に該当するものを見いだすことができず、こ
の属の新菌種と判断した。

そこでこれら３菌株をシュードモナス・ツルボッキジダ
ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　５ｏｒｂｏｓｏｘｉ
ｄａｎｓ）と命名し、昭和６１年（１９８６年）４月１
１日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、また昭和６１
年（１９８６年）４月２６日に通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究（ＦＲＩ）に寄託した。これらの３ト
条約の下に　寄託した。３菌株の分離番号と菌＾ 株保存機関の受託番号は次の通りである。

分離菌株番号　ＦＲＩ受託番号　　ＩＦＯ受託番号５２
６−２１　　ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５０１Ｆ０１４５０１
５２６−２２　　ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５１１ＦＯ１４５
０２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３３５） ５２６−４２　　ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５２１Ｆ０１４５
０３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３３６） 本発明に用いられる菌株は上記した３菌株は勿論のこと
、３菌株を紫外線やＸ線を照射したり、Ｎ−メチル−Ｎ
ｏ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにトロソグアニジ
ン）、メチルメタンスルホン酸、ナイトロジエンマスタ
ードの様な変異誘起剤で処理して得られる変異株も有利
に用いられる。

その例としてシュードモナス・ツルボッキジダンス５２
６−２１からニトロソグアニジン処理によって誘導され
たＳ［３−１５株を挙げることが出来る。５Ｉ（−１５
株はＬ−ソルボースからシーケト−Ｌ−グロン酸生成能
が増強されている他は、親株である５２６−２１株と同
じ分類学的性質を示した。

また、該５Ｂ−１５株は、昭和６２年４月２３日にＩＦ
Ｏに受託番号ＩＦＯ１４６０４として、昭和６２年５り
！日にＰＲＩに受託番号ＦＥＲＭｎＰ−１３５６とそれ
ぞれ寄託された。

本発明の方法は、前記菌株のいずれかを、Ｌ−ソルボー
スを含有する培地で培養してもよく、またＬ−ソルボー
スに前記菌株の菌体処理物を作用さ仕てもよい。

本発明で用いられる「菌体処理物」とは、前記の菌株の
いずれかを培養して得られる培養物の洗浄菌体、アセト
ンパウダー、ポリアクリルアミドゲルまたは、Ｋ−カラ
ギーナン包括固定菌体等をいう。

原料のＬ−ソルボースは、培養当初から、使用する全量
を培地に加えてもよいし、何回かに分けるかまｆこは、
連続的に培養液に加えてもよい。

Ｌ−ソルボースと前記細菌とを接触させて行う反応では
、Ｌ−ソルボースの濃度は、培地に対して３〜３０％（
Ｗ／Ｖ）、好ましくは、５〜２５％（Ｗ／Ｖ）である。

Ｌ−ソルボースと菌体処理物とを接触さ仕る方法として
は、例えば、菌体処理物にＬ−ソルボース、２−（Ｎ−
モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（０
，５Ｍ５ｐＨ６，５）およびＣａＣＯ５を加え、水で希
釈して三角フラスコ中で振盪させる方法が挙げられる。

Ｌ−ソルボースと前記菌体処理物を接触さＵ・て行う反
応のし一ソルボースの濃度は０．１〜ｌＯ％（Ｗ／Ｖ）
、好ましくは０．３〜３％（Ｗ／Ｖ）であり、菌体処理
物の量は、処理前の乾燥菌体としてｌ〜３０ｍｇ／ｍＱ
、好ましくは３〜２０　ｍ９／　ｍ（ｌである。反応液
のｐｉｆは、５．５〜７．５に調整され、反応温度は約
２０〜４０℃、反応時間は、約１〜１００時間である。

前記細菌株の培養に用いられる培地は、これらが利用し
得る栄養源を含むしのであれば、液状でも固体状態でも
よいが、大量のものを得るときには、液体培地を用いる
のが好ましい。該培地には、通常微生物の培養に用いら
れる炭素源、窒素源、無機塩類、有機酸塩及び微量栄養
素が用いられろ。

炭素源としては、原料であるし一ソルボースを使用でき
るが、補助炭素源として、例えばグルコース、グリセリ
ン、ショ糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜等が使用される。窒素
源としては、例えばアンモニウム塩、コーンスヂープリ
カー、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、綿
実粕、尿素等の無機及び有機の窒素含有物か挙げられる
。また、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜
鉛、銅及び燐酸の塩類が用いられる。微量栄養素として
は、前記細菌株の生育必須或は促進因子である、ピオチ
ン、チアミン、リボフラビン、パントテン酸及びアミノ
酸類、またはこれらを含有する天然物として適宜加えら
れる。

培養の手段は、静置培養でも、振盪培養成は通気撹拌陪
従法等の手段を用いてらよいが、大量の処理は、いわゆ
る深部通気撹拌培養によるのが望ましい。

培養条件は、使用する菌株、培地の組成、その他によっ
ても異なり、要するに目的物が最も効率よく生産される
様に、個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、培
養は２５〜３５°Ｃにおいて行うのがよく、培地のＩ）
　ｌ−１は５〜９程度が望ましい。以上の様な条件下で
、１０〜１２０時間培養することにより、２−ケト−Ｌ
−グロン酸が最高８度に蓄Ｔａされる。なお、この場合
、目的物の生成に伴ってｐＨが低下するのが一般的であ
るので、適当な塩基性物質、例えば苛性ソーダ、苛性カ
リ、アンモニア等を添加して、常に微生物の２−ケト−
Ｌ−グロン酸生成に最も適したｐＨに保持するのらよく
、また培地中に適当な緩衝剤を添加して、最適なｐ　Ｉ
−１が保持されろ様にするのむよい。

この様にして、培養液中、または反応液中に生成、蓄積
された２−ケト−Ｌ−グロン酸は、その性状を利用した
それ自体公知の手段で分離、精製することができる。２
−ケト−Ｌ−グロン酸はω離の酸として分離してもよく
、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニ
ウム等の塩として分離してもよい。

分離の方法としては、目的に反しない限り、いかなるも
のでもよい。例えば、必要に応じて反応生成物から濾過
、遠心沈澱、或は活性炭処理等を行って菌体を除去した
後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結晶を濾取し
、更に再結晶させて目的物を取り出す方法、溶媒抽出法
、クロマトグラフィー法、塩υ上広等を単独または、適
宜組み合仕て、或は反復して利用することらできる。

２−ケト−Ｌ−グロン酸が遊離型で得られる場合は、こ
れを適宜の方法によって、例えばナトリウム、カリウム
、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよく、また
塩として得られる場合は、これを適宜の方法によって遊
離型或は池の塩に変えてもよい。

本発明によって得られる目的物が、２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸であることは、例えば元素分析、融点、旋光度、赤
外線スペクトル等の物理化学的諸性質の測定によって同
定された。

反応液、培養液中に生成した２−ケト−Ｌ−グロン酸の
定ｍは、スルホン化ボリスヂレンゲル充填カラム（島津
製作所製、５ＣＲ−１０１Ｈカラム、７．９ｍｍＸ３０
ＣＩ）を用いる高速液体クロマトグラフィー法（移動…
：ｐＨ２，２の希硫酸、流量：０　、５　ｍ１２／ｍｉ
ｎ、検出器：示差屈折計）で行い、標準品としては、２
−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウムｌ水塩の結晶を使用し
た。また、２−ケト−Ｌ−グロン酸の検出は、薄層クロ
マトグラフィー法で行った。セルロースプレート（メル
ク社製）にサンプルをスポットし、フェノール：水二ギ
酸　（７５：２５：５）の溶媒で室温下３時間展開後、
プレートを乾燥し発色させると、２−ケト−Ｌ−グロン
酸は、硝酸銀試薬では黒褐色の、０−フェニレンジアミ
ン試薬では黄色の、アニリンフタル酸試薬では桃色のス
ポットをＲｆ値０．３付近に与えることにより検出され
た。

衷籠旦 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

尚、培地の％は、重量／容量％を示す。

実施例１ グルコース２％、ポリペプトン（大五栄養化学社製）１
％、酵母エキス０．２％、ＮａＣＱｏ、５％、寒天１．
５％（ｐＨ７、２）から成る試験管斜面培地上に２８℃
２日間培養したシュードモナス　ツルボッキジダンス５
２６−２１（ＩＦＯ１４５０１、ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７
５０）の菌体１白金耳をグルコース２％、ポリペプトン
１％、乾燥酵母０゜５％、ＣａＣＯ５２％から成る培地
２ＯＲ（を２０Ｏｘ（ｌ容の三角フラスコに分注して、
１２１’ＣＩ５分間滅菌したものに接種し、２８℃、２
日間振盪（２０Ｏｒｐｍ）培養して、種培養液を得た。

この種培養液２１を、蒸気滅菌した、ポリペプトン１％
、カザミノ酸０．２％、乾燥酵母０．５％、（ＮＨ４）
＊ＳＯ，０，５％、ＮａｔＳ＊Ｏｓ・５ＨｔＯＯ，０５
％、ＫＨｆｆｉＰｏ、０．０３％、Ｍｇ５Ｏａ争７Ｈ２
００゜０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈｔ０　０．１％、Ｍｎ
５ｏ４・ｎＨ，ＯＯ，０００５％、チアミン塩酸塩０．
０００５％、ＣａＣＯ５６％、濾過除菌したし一ソルボ
ース１５％から成る発酵培地２５村を２００ｍ１２容の
三角フラスコ（滅菌済）に分注したものに接種して、２
８℃、３日間振盪培養した。得られた発酵液を高速液体
クロマトグラフィーにより分析したところ、５４．９ｍ
９／肩Ｑの２−ケト−Ｌ−グロン酸（使用糖当りモル収
率３４．０％）を含んでいた。

この発酵液１０００ａｙＱを遠心沈澱して、菌体等の残
渣を除去して得た上澄約９８０ｚ（をアンバーライトｌ
Ｒ１２０（ローム・アンド・ハース社製、■０型、５０
０ｉＱ）カラムに通し、ついで約３００ｘＱの脱イオン
水で洗浄した。この通過液と洗浄液を合せて、苛性ソー
ダでｐｏ　６　、５に調整した後、５０℃で約５０ｘｆ
ｆ迄減圧下で濃縮した。この濃縮液を５℃に２４時間放
置することにより生じた無色注状の結晶を濾取し、少虫
の冷メタノールで洗浄後、室温、減圧下に五酸化埼玉で
乾燥して３８゜５ｇの２−ケト−Ｌ−グロン酸モノナト
リウム１水塩を得た。得られた結晶の分Ｖ′ｒ値は、融
点：１４７〜１５５℃、元素分析値（Ｃ６Ｈｇ　Ｏ？　
Ｎ　ａ　・１−１　、０　＞　：理論値（Ｃ：３０．７
８％、Ｈ：４．７４％）、測定値（Ｃ；３０．８４％、
Ｈ，４，８９％）、比旋光度＝［α］”−２３，３°（
Ｃ＝１．０、水）で、高速り 液体クロマトグラフィーの保持時間と薄層クロマトグラ
フィーのＲｆ値と試薬により発色した色調は、標準品の
それらと一致した。

実施例２ 前記実施例１と同じ方法で、シュードモナスツルボッキ
シダンス５２Ｇ−２２（ＩＰＯ１４５０２、ＦＩＭ　　
Ｐ−８７５１）の種培養液を得た。この種培養液２ｍＱ
を、前記実施例Ｉで用いた発酵培地の成分の中でＮａｔ
Ｓ　ｔｏｓ　＊　５　Ｈ＊Ｏを０゜１％に変えた培地２
５酎を２００１容三角フラスコに分注したものに接種し
て、３０℃、５日間振盪培養した。得られた発酵液中に
は、７２．９ｍ９／酎の２−ケト−Ｌ−グロン酸が含ま
れていた。

（使用糖当リモル収率４５．１％） 実施例３ 前記実施例１と同じ斜面培地に２８℃、２日間生育させ
たシュードモナス　ツルボッキジダンス５２６−４２（
ＩＦＯ１４５０３，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７５２）の菌体
ｌ白金耳を、グルコース２％、酵母エキス０．３％、コ
ーンスチープリカ−０，３％、カゼイン０．５％、Ｃａ
Ｃ０，２％から成る種培地２０ｙ（ｌを２００＋ｆ２容
三角フラスコに分注して、＋２１６ＣＩ５分間蒸気滅菌
したものに接種し、２８°Ｃにて１日振盪培養して種培
養液を得た。この種培養液２ｙｉ（ｌをコーンスチーブ
リカ−２％、ＮａｔＳ＊Ｏｚ”　５ＨｔＯＯ，０５％、
ＦｅＳＯ４・７ｆ−１，００，１％、　　（ＮＨ４）！
Ｓｏ、　　　　０．３　　％、ＦＭＮ　　Ｏ，０００１
％、ビオチン０．００００５％、ＣａＣ０ａ　９％から
成る培地２０ｆｆ１２を分注した２０（１ｍ（！容マイ
ヤーに分注し蒸気滅菌したものに接種し、濾過除菌した
４０％し一ソルボース液を、接種直後に３吋、１６時間
後に２ｘＱ、２４時間後に３３１１２．４０時間後に２
肩Ｑ、４８時間後に３ｙｒ（ｌ添加しながら３０℃、３
日間振盪培養した。この様にして得られた発酵液を高速
液体クロマトグラフィーにより分析したところ、８５　
、４　ｏ／　ｍ（１の２−ケト−Ｌ−グロン酸（使用糖
当りモル収率５０．３％；消費糖当りモル収率８６．０
％）が含まれていた。

実施例４ 実施例！で得られたシュードモナス　ツルボッキジダン
ス５２６−２１（ＩＦＯ１４５０１，ＦＥＲＭ　　Ｐ−
８７５０）の発酵液１０００酎から遠心沈澱して得た沈
澱物を約１００ｍρの冷生理食塩水（０，８５％）に懸
濁し、１０１０００ｒｐ分間遠心して、主にＣａＣＯ５
から成る沈澱物を除き、上澄を更に９０００ｒｐｍＩＯ
分間遠心沈澱して、洗浄菌体を得た。これを３５ｘＱの
冷生理食塩水に１！！局したちの８１１１１！に、Ｌ−
ソルボース６００Ｒｇ、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタ
ンスルホン酸（ＭＥＳ）Ｗ新液（ｐＨ６，５，０，５Ｍ
）１ｉ１２とＣａＣ０１＋３６０ズ９を加え、水で総量
２０村とし、２００村容三角フラスコ中で３０°Ｃ１２
４時間振盪しながら反応させた。この様にして得られた
反応液中には、２１　、５　；ｐ９／１ｔｔＱの２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸（使用糖当リモル収率６６．５％）が
生成していた。

実施例５ シュードモナス・ツルボッキジダンス５２６−２１１朱
をＤ−ソルピ゛ット２．５％、ペプトン１％、酵母エキ
スＩ％、炭酸カルシウム０．２％、寒天２％からなる斜
面培地に３０℃、３日間培養した。

この菌体１白金耳をペプトン０．５％、酵母エキス０．
５％、ＮａＣ＋２０．２％（ｐ■ｔ　７　、０　）から
なるＰＹ培培地５ｍ合含む試験管に植菌し、２８℃、１
６時間振帰培養した。

得られた培養液２．ｗＱに、ｌπ９のニトロソグアニジ
ンを溶解したＰＹ培地ｌπＱを加え、２８℃で３％分間
保温して変異剤処理した。この処理液を１７０分間遠心
分離（５０００ｒｐｍ）して菌体を集め、これを１０ｘ
Ｑの新鮮なＰＹ培地に懸濁し遠沈分離（５０００ｒｐｍ
、　　１０分間）して、洗浄菌体を得た。

次にこれを５ｘＱのＰＹ培地に懸濁し、２８℃で３時間
振盪培養した。得られた培養液をＰＹ培地で適当に希釈
後、そのＯ、ｌ　ｔｔｔ（ｌをし一ソルボースｌＯ％と
寒天２％を加えたＰＹ培地を含むプレート（直径９　ｃ
ｍ）に撒き、２８℃で７日間培養した。生じたコロニー
３５９個を各々上記斜面培地に移植し２８°Ｃ１３日間
培養した。

各々の斜面培地の菌体１白金耳をし一ソルボース１０％
、コーンスチーブリカ−２％、乾燥酵母０．３％、Ｎａ
ｔＳｔＯｓ”　５ＨｔＯＯ，０２％、ＦｅＳＯ４・７１
−１．００．１％、硫安０．３％、ペプトン０．２％、
ＣａＣＯ３４％（ｐｒ−ｔ　６　、６　）からなる培地
３ｍＱを含む試験管に植菌し、３０℃で５日間振盪培養
した。

得られたこれらの培養液を１２０００　ｒｐｍで５分間
遠心分離し培養液上清を得ろ。この上清を希硫酸（０，
３Ｎ）で５倍に希釈後再度遠心分子Ｉ＆（１２００Ｏｒ
ｐｍ、　５分間）して希釈上清を得た。これらの希釈上
清ｌμＱをセルロースプレート（メルク社製・米国）に
スポットし、フェノール：水：ギ酸（７５：２５：５）
の溶媒系で室温で３時間展開した。

このプレートを風乾後、硝酸銀試薬で発色させた。

ｒｔｒ値３．０付近（２−ケト−Ｌ−グロン酸に相当）
に最も大きな黒褐色のスポットを与えた株を５Ｂ−１５
株（ＩＦＯ−１４６０４，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３５６）
として選択した。

実施例６ 実施例５で得たシュードモナス・ツルボッキジダンスＳ
Ｂ−１５株をＤ−ソルビット２．５％、ペプトン１％、
酵母エキス１％、炭酸カルシウム０．２％、寒天２％（
ｐＨ７，０）からなる斜面培地に３０℃、３日間培養し
た。

この菌体ｌ白金耳を、グルコース２％、ペプトン１％、
酵母エキス１％、炭酸カルシウム２％（ｐＦＩｅ、８）
から成る培地２０ｔｘＱを２００１容の三角フラスコに
接種し、３０℃、２日間振盪培養（２００ｒｐｍ）培養
して、第１種培養液を得た。

第１種培養液１　、５　ｍＱを上記と同じ培地を含む同
じフラスコに移植し、３０℃で２日間振器培養し、第２
種培養を得た。

得られた第２種培養液２酎を蒸気滅菌した。乾燥酵母０
．５％、コーンスチーブリカ−２％、Ｆｅ５０．−７１
−［２００，１％、ＮａｔＳｔｏ３”　５Ｈｔ００．０
５％、炭酸カルシウム４％、別滅菌したＬ−ソルボース
ｌＯ％からなる醗酵培地２５２１２を２００３１７！容
の三角フラスコ（滅菌済）に分注したしのに移植して３
０℃で３日間振盪培養した。得られた醗酵液を高速液体
クロマトグラフィーにより分析したところ、８２．０屑
ｇ／酎の２−ケト−Ｌ−グロン酸を含んでいた。

なお、この時、同じ方法で培養した親株５２６−２１株
の２−ケト−Ｌ−グロン酸生成１は４７゜ｌｘｙ／ａ（
（使用糖当リモル収率７６．１％）であった。

実施例７ シュードモナス・ツルボッキジダンス５Ｂ−１５昧を醗
酵培地中のし一ソルボースとＣａＣＯ５濃度をそれぞれ
１３％と６％にした以外は、実施例６と同じ方法で培養
した。

得られた醗酵液を高速液体クロマトグラフィーにより分
析したところ、８４　、　Ｏｊ！９／１ｔｒＱの２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸を含んでいた。なお、この時、同じ方
法で培養した親株５２６−２１株の２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸蓄積量は６３　、８　ｍ９／　ｘＱｃ使用糖当りモ
ル収率６０．０％）であった。

発明の効果 本発明のシュードモナス　ツルボッキジダンスを用いる
ことにより、し−ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン
酸を収率よく製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス　ソルボソキシダンス（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に属し
   、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸化する
   能力を有する微生物、またはその処理物を、Ｌ−ソルボ
   ースと接触させて、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積
   せしめ、これを採取することを特徴とする２−ケト−Ｌ
   −グロン酸の製造法。
2. （２）極鞭毛を２本以上有する運動性桿菌で、グリセロ
   ールからジハイドロオキシアセトンを生成せず、イソプ
   レンユニット数１０のユビキノンを有し、生育にチアミ
   ン、リボフラビン、およびパントテン酸を必須に要求す
   るシュードモナス　ソルボソキシダンス。