DE2314631B2 - Verfahren zum zuechten von bakterien, pilzen, hefen oder actynomyceten in einem waessrigen naehrmedium - Google Patents

Description

Vprozent zusetzt.

a, 2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man den flüssigen Fluorkohlenstoff in einer Menge von 8 bis 40 Volumprozent zusetzt. j 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Silikonöl mit einer Viskosität von I Centipoise sowie mit einem Molekulargewicht von 316 verwendet.

»5

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Bakterien, Pilzen, Hefen oder Aetynomyeeten in einem wäßrigen Nährmedium.

Es ist bekannt, daß bei der Durchführung der Kultivierung eines aeroben Mikroorganismus in einem flüssigen Medium das Wachstum des aeroben Mikro-Organismus oder die Ansammlung eines fermentativen Produktes durch den Mikroorganismus beeinflußt wird durch die Sauerstoffübertragungsrate in das Medium. Da Sauerstoff in Wasser schwer löslich ist, führt daher der Mangel an in dem Medium gelöstem 4" Sauerstoff oftmals zu einem schwachen Wachstum eines aeroben Mikroorganismus oder zu einer schlechten Ausbeute an einem fermentativen Produkt.

Es sind bereits verschiedene Methoden oder Techniken zur Erhöhung der Sauerstoffüberführungsrate aus der Gasphase in das flüssige Medium bekannt. So kann z. B. die Geschwindigkeit, mit der Sauerstoff in die Lösung eintritt, dadurch erhöht werden, daß die Form des Fermentierungsgefäßes verbessert wird (z. B. durch Ernennung der Seitenwände eines Kolbens) oder daß die Rührgeschwindigkeit oder die Belüftungsmenge gesteigert wird oder daß der Partialdruck des Sauerstoffs in der Gasphase erhöht wird. Die bekannten Methoden sind jedoch nicht geeignet, eine hohe Konzentration an gelöstem Sauerstoff in dem flüssigen Medium aufrecht zu erhalten. Hinzu kommt, daß Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, in einem Medium zu wachsen, das nur Kohlenwasserstoffverbindungen als Kohlenstoffquelle enthält, wie sie zur fermentativen Herstellung von beispielsweise Aminosäuren, Enzymen und Coenzymen verwendet werden, eine große Menge an gelöstem Sauerstoff für ihr Wachstum brauchen, wobei es sich als nachteilig erweist, daß übliche bekannte Belüftungs-Rührtechniken nicht ausreichen, um den Sauerstoffbedarf der- ^6s artiger Mikroorganismen zu decken.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Fermentierungsverfahren anzugeben, das es ermöglicht, die SnuerstoffüberfUhrungÄrnte nus der Gasphase in die flüssige Phase zu erhöhen sowie das Wnchstum oder die Vermehrung eines aeroben Mikroorganismus oder die Ansammlung eines fcrmenttitivcn Produktes in einem Nährmedium zu fördern oder die Ausbeute an Mikroorganismuszellen öder fermentativem Produkt zu erhöhen. Das Fcrmentierungsvcriaiircn soll ferner ermöglichen, den gelösten Sauerstoff in einer ausreichend hohen Konzentration in einem wäßrigen Nährmedium aufrecht zu erhalten sowie die zur Kultivierung eines aeroben Mikroorganismus erforderliche Zeit abzukürzen. ,

Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren.

Die Patentansprüche 2 und 3 beinhalten vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung. Die verwendbaren Fluorkohlenstoffc sind: Perfluortributylamin (chemisehe Formel C₁₂F₂₇N, Fp = 174C spezifisches Gc-V wicht I 87, Sauerstofflöslichkeit 39 ml/100 ml .-lüssig-■* keil bei 25⁰C, Perfluor-2-butyifuran (chemische Formel C₈F₁₈O, Kp = 102¹C, spezifisches Gewicht 1,77, Sauerstofflöslichkeit 49 ml/100 ml Flüssigkeit bei 25 C. Perfluor-n-hcptan (chemische Formel C₇F₁₈, Kp = 115 C spezifisches Gewicht 1,73, Saucrstofflöslichkeii 42 ml/100 ml Flüssigkeit bei 25 C, Perfluornaphthalin (chemische Formel C₁₀F₃, Kp = 142 C, spezifisches Gewicht 1,95, Sauerstofflöslichkeit 45 ml/100 ml Flüssigkeit bei 25 C, Perfluor-1-methylnaphthalin (chemische Formel C_nF₁₀, Kp = 160 C, spezifisches Gewicht 1,97, Sauerstofflöslichkeit 42 ml/100 mi Flüssigkeit bei 25 C, Perfluor-n-methylmorpholin (chemische Formel C₅F₁₁NO, Kp = 50 C, spezifisches Gewicht 1,70, Sauerstofflöslichkeit 42 ml/100 ml Flüssigkeit bei 20 C, 1,2,2,2-Tetrafluoroäthyläther von Perfluor(2,5,8-trimethyl-3,6,9-trioxadodecanol (chemische Formd C₁₁F₂₉O₄H, Kp= 193 C, spezifisches Gewicht 1,763, Perfluor-1-methyldecalin (chemische Formel C_nF₂₀, Kp = 160 C, spezifisches Gewicht 1.972, Sauerstofflöslichkeit 43 ml/100 ml Flüssigkeit bei 37 C).

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbaren Siliconöle sind solche mit einer Viskosität von 0,65 bis 15 Centipoise. So ist z. B. für diesen Zweck ein Siliconöl bestens verwendbar mit einem Molekulargewicht von 316 (Kp = 146 C, spezifisches Gewicht 0,85, Sauerstofflöslichkeit 100 ml/ 100 ml Flüssigkeit bei 25 C). Obwohl zur Durchführung aerober Kultivierungsprozesse Siliconöle mit einer Viskosität von 3000 bis 5000 Centipoise als Antischaummittel bereits verwendet wurden, sind derartige hochviskose öle zur Durchführung des Verfahrens der Eifindung nicht verwendbar.

Die genannte Flüssigkeit wird dem wäßrigen Nährmedium in einer Menge von etwa 5 bis 80% (V/V), insbesondere von 8 bis 40% (V/V), zugesetzt. In der Regel ist die Sauerstoffüberführungsrate umso besser, je größer die Menge an inerter organischer flüssigkeit ist. Es ist jedoch unnötig, den Sauerstoff in einem Überschuß, bezogen auf die Sauerstoffaufnahme des Mikroorganismus, zuzuführen. Die in der Praxis dem Nährmedium zugesetzte Menge an inerter organischer Flüssigkeit hängt daher von der Grund-Sauerstoffaufnahme des Mikroorganismus ab. Die genannte Flüssigkeit kann vor und/oder nach der Sterilisation des Nährmediums zugesetzt werden. Wird die genannte Flüssigkeit nach der Sterilisation des Nährmediums zugesetzt, so muß sie selbstverständlich vor der Zugabe sterilisiert werden.

3 4

Zur Durchführung der Kultivierung aerober Mikro- Wnclistumsrnte dieser Mikroorganismen oder ikr

, _/ jorgiuiisrnen mich der bindung sind Übliche bekannte Produktivität an fermentativen Produkten,

" ... r^ahrsioffque Jen verwendbar. Typische geeignet« Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher

.,•,NßhrstoffqMcllen fur Kohlenstoff sind z. B, die hierfür erläutern
Λ - üblichen Saccharide (τ.. Β. Glucose, Lactose, Galactose 5

„,, und Saccharose), Polysaccharide (z. B, Stärke und Beispiel I

V, " Dextrin), Zuckeralkohole^, ß. Sorbitol und Mannitol), 500 mi eines wäßrigen Nährmediums mit einem Ge-

f, ^Polyalkohole (z. I». Glycerin) und organische Sfturen halt an 20% (G/V) Sorbit, 1 % (G/V) Maisquellwasser

,„, (z. B. Essigsäure, Fumarsäure und Citronensäure), und und 0,3% (G/V) Calciumcarbonat wurden in einen

'/.* geeignete Mickstorrqucllen sind z. B. Pcpion, Fleisch- >o I-I-Fermentcr eingebracht. Eine gewisse Menge an

_;/; extrakt, Hefeextraki, Maisqucllwasser, Bnumwoll· Perfluortributylamin wurde dem Nährmedium zuge-

« Mimentreber, Sojabohnenpulver, Erdnußpulver, Pro- setzt. Das Medium wurde in einem Autoklav sterilisiert

temhydrolysate, anorganische Nitrate und organische und anschließend auf 30" C abgekühlt. Das Nähr-

,, oder anorganische Ammoniumsalze, und anorganische medium wurde so dann mit Acetobacter suboxydans

„/ Elemente sind ebenfalls verwendbar. In einigen Fällen is ATCC 621 beimpft, Danach wurde das Medium bei

_. <*kann dem Nährmedium eine Vorläurerverblndung 30'C unter Belüftung (250 ml/min) und RUhren

-oder andere geringfügige Komponente zugesetzt wer- (SOO UpM) kultiviert, bis die Oxidation von Sorbitol

'ψ'den, die bei der fermentativen Produktion einer zu Sorbose vervollständigt war. Die Ergebnisse der

Ar..nosäure, einer Nucleinsäure oder eines Antibio- Kultivierung sind in Tabelle I aufgeführt,
s licums erforderlich ist. Erforderlichenfalls kann außer- ■">

dem auch ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt Tabelle 1

, werden. -, .

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung Menge an zu*

einzusetzende Flüssigkeit dient dazu, die Sauerstoff- Besetztem

überführung»™ aus der Gasphase in die flüssige *5 iJS* ₍ ^A _{Mol Sorbose/}

Phase zu erhöhen. Die Flüsigkeit dient ferner dazu, %(V/V) „il/h) (h) (h) (%)
Sauerstoff direkt in die flüssige Phase zu liefern, da

der an der einzusetzenden Flüssigkeit adsorbierte 0 5,8 · 10 ⁵ 8 bis 24 27 96

Sauerstoff während der Kultivierung in das Mediuin 10 7,2 · 10 ⁶ 6 bis 18 20 97

freigesetzt wird. Es erweist sich daher als vorteiihaft, 30 20 8,9 · 10 ⁶ 5 bis 14 15 95

das erfindungsgemäße Verfahren unter Belüftung, 40 9,6 · ig ⁶ 5 bis 12 12 96
Rühren und/oder Schütteln durchzuführen. In diesem

Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, daß In der Tabelle bedeuten:

das Verfahren der Erfindung auch ohne Belüftung. α die maximale Fermentationsgeschwindigkeit, d. h.

Rühren und oder Schütteln durchführbar ist. So kann 35 die maximale Geschwindigkeit der Oxidation von

z. B. eine geringe Menge der einzusetzenden Flüssig- Sorbitol zu Sorbose,

keit aus dem Nährmedium nach einer geeigneten β die Dauer der maximalen Fermentierungsge-

Kultivierungszcit entnommen werden und die auf diese schwindigkeit, d. h. die Zeitspanne, während

Weise abgetrennte inerte organische Flüssigkeit wird welcher die maximale Fermentierungsgeschwin-

mit frischer Luft oder Sauerstoffgas in Kontakt ge- *° digkeit zu beobachten ist,

bracht, um deren Sauerstoffgehalt 711 erhöhen, worauf c die zur Vervollständigung der Fermentierung er-

sie erneut dem Fermentationsmedium zugesetzt wird. forderliche Zeit und

Durch Wiederholung dieser Prozedur während der d die Ausbeute an Sorbose, d. h. die Umwandlungs-

Kultivierurig kann die Konzentration an in dem Nähr- _rat_e von Sorbitol in Sorbose,

medium gelöstem Sauerstoff immer hei einem so hohen 45

Niveau gehalten werden, daß die aerobe Kultivierung Beispiel 2

in besonders vorteilhafter Weise durchführbar ist. ,._Λ . . .„ . _v,_, .. . . „, ,,,

Nach Beendigung der Kultivierung kann der Fluor- ^l0° ^ml «nes wäßrigen Nahrmedmms der in Beispiel!

kohlenstoff oder aas Siliconöl von dem flüssigen ^an,^^en«" Zusammensetzung wurden in einen 500

Medium leicht abgetrennt werden auf Grund der So ml-Schuttelkolben eingebracht. 20 ml Per ,uortr.butyl-

Dichteuntr.rschiede zwischen den Komponenten. Au- ^amV! wurden dem Nährmedium zugesetzt Das Nähr-

ßerdem können die auf diese Weise isolierten Fluor- "Jf^d'^un? ,^{wurde s}^nl>siert und anschließend auf 30 C

kohlenstoffe oder Siliconöle erneut verwendet ^abS^ek"^hl · ^{Das Nahrm}f'"" ,^wuf^de. ^s° ^da"^{n m}" . Actiobacter suboxydans ATCC 621 inokuliert. Danach

Das Verfahren der Erfindung kann die Fermentie- 5b wurde das Nährmedium bei 30X unter Schütteln (140 rung oder Kultivierung aerober Mikroorganismen Cyclen/m.n Anschlagsfrequenz 8,5 cm) kul.viert D.e ungewöhnlich stark fördern. So wird z. B. erfindungs- ^maximale Ferment.erungsgeschw.nd.gke.t (5,2! · 10-·

tativen Produkten (z. B. Aminosäuren, Antibiotica, ^dlS^{kelt von 3}·⁸ ' ^{10 Mo1} Sorbose/ml/h.

Enzymen, Coenzymen und Vitaminen) merklich erhöht. ⁶5 . . .

Außerdem kann die zur Fermentierung oder Kultivie- ueisp

rung dieser Mikroorganismen erforderliche Zeit ver- Die Kultivierung von Acetobacter suboxydans

kürzt werden wegen der merklichen Erhöhung der ATCC 621 wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen

Verfahren durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß ICO ml Siiieonöl an Stelle von Perfluortributylamin verwendet, wurden, In diesem Falle war die r-ermentierung in etwa 20 h vollständig bei einer maximalen ,Fermentierungsgeschwindigkeit von 7,45 · IO ^B Mol Sorbose/ml/h.

Beispiel 4

_f 20 g Glucose, 6 g Dfommoniumphosphat, 2,5 g L-Asparaginsäure, 5 g Hefeextrakt, I g Trinatrium-Vcitrat, 0,23 g Magnesiumsulfat -7 Hydrat, 2 mg Zink-'-vsulfat · 7 Hydrat und I mg Eisen(l!)sulfat wurden in 11 • ^Wasser gelöst. 500 ml des wüßrigen Mediums wurden ) luf einen pH-Wert von 5,0 eingewtcllt und in einen I l-hermentcr eingebracht. Eine bf/stimmte Menge an rPeifluortributylamin wurde dem Nährmedium zugc-/ietzt. Das Nährmedium wurde sterilisiert und anschließend auf 30"C gekühlt. Danach wurde das Medium mit Saccharomyces cerevisiae beimpft. Danach wurde das Medium kultiviert bei 30 C tinter Be* {lüftung (250 ml/min) und Rühren (500 UpM), bis das Wachstum der Hefe aufhörte. Die Ergebnisse der Kui-Ovierung sind in der folgenden Tabelle Il aufgeführt.

Tabelle I!

Menge ivn zugesetztem PerfUiortri- ABC bulylamin % (V/V) (h) (l/h) (h)

0	10 bis 30	0,14	48
25	10 bis 17	0,19	40
50	10 bis 20	0,22	30

Tabelle tll

Zugesetzte Menge	A	B	C
in Perfluortributyl-	(Mol Di-
8min%(V/V)	hydroxi-
	acelon/ml/h)	00	(h)

0	3,8 · 10	6	16 bis 65	72
20	5,2-10	S	15 bis 60	64
40	6,3-10	S	!2 bis 50	56
60	7.2 · 10-	S	10 bis 45	56

In der Tabelle bedeuten:

A die Dauer der aktiven Phase der Vermehrung,

B die spezifische Wachstumsrate, d. h. die Wach· stumsrate (g/ml/h) der Hefe in der aktiven Phase der Vermehrung/ Konzentration/ml an Hefezcllen im Medium, und

C die zur Vervollständigung der Kultivierung erforderliche Zeit.

Beispiel 5

500 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 20% (G/V) Glycerin. 1,5% (G/V) Maisquell- « wasser, 0,5% (G/V) Ammoniumfumarat und 1% (G/V) Calciurrxarbonat wurden in einen 1 I-Fermenter eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortributylamin wurde dem Medium zugesetzt. Das Medium wurde sterilisiert und anschließend auf 3O⁰C gekühlt. ^s° Danach wurde das Medium mit Acetobacter suboxydans ATCC 621 beimpft. Anschließend wurde das Medium kultiviert bei 3O⁰C unter Belüftung (250 ml/ min) und Rühren (500 UpM), bis die Umwandlung des Glycerins in Dihydroxiaceton vervollständigt war. ^ss Die Ergebnisse der Kultivierung sind in der folgenden Tabeiie iii aufgeführt.

In der Tiibelle bedeuten:

Λ die maximnle Fermeniierungsgcschwmdigkcii, d. h. die innximnlc Geschwindigkeit der Umwandlung von Glycerin in Dibydroxincelon,
B die PfHicr der maximalen Fermentierungsgeschwindigkeit und

C die zur Vervollständigung der Fcrmcnlicrung erforderliche Zeit,

Beispiel 6

JOO ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 3% (G/V) Stärke, 4% (C/V) Baumwollsament.rebcr, 0,2% (G/V) Hefeexlrakt, 0,5% (G/V)

»5 Natriumchlorid, 0,3% (G/V) Calciumcarbonat und 0,002% (ü/V) KupfcrUDsulfaf 5 Hydrat wurden bei 121 C 20 min lang im Autoktav sterilisiert. Eine öse voll Stroptomyccs humidus var, sp. MCRL 0387 (hinterlegt bei der Agricultural Research Service CuI-

ao lure Collection des United States Department of Agriculture unter der Eingangsnummer NRRL 3885) wurde dem Medium zur Beimpfung zugesetzt, worauf das Nährmedium bei 27'C 72 h lang unter Belüftung und Rübren kultiviert wurde. Auf diese Weise wurde die impfkultui erhalten.

100 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einer.i Gehalt an 20% (G/V) Maltosesirup (Maltoscgehalt 50 bis 60%), 4% (G/V) Baumwollsamentrcber, 1 % (G/V) Natriumchlorid, 0,6% (G/V) Calciumcarbona!

und 0,004%(G/V) Kupfcr(II)sulfat-5 Hydrat wurden in einen 500 mi-Erlenmeyer-Kolben eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortributylamin würde dem Nährmedium zugesetzt. Das Medium wurde so dann bei 121 C 20 min lang im Autoklav sterilisiert und anschließend gekühlt. 3,1 ml der angegebenen Impfkultur wurden dem Medium zugesetzt. Danach wurde das Nährmedium bei 27 C unter Schütteln (140 Cyclen/min) kultiviert. Die Menge (Einheiten/ml) an im Nährmedium angereichertem Antibioticum YA-56 ist in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Menge an zugesetztem Perfluortributylamin % (V/V) 14 Tage

Kuitivicrungszeit

15 Tage

18 Tage

0
10
15
20

7,5(7,0) 15,2(7,4) 33,0(7,3)

10,0(7,1) 17,1(7,3) 36,0(7,1)

14,2(6,9) 23,2(7,0) 43,0(7,0)

15,2(6,9) 22,7(7,1) 46,0(7,1)

In obiger Tabelle ist zu beachten:

1. Die Menge an im Nährmedium angereichertem Antibioticum YA-56 wurde bestimmt mit Hilfe der Zylinderpiattenmethode unter Verwendung von Escherichia coli NIHJ als empfindlicher Mikroorganismus und

2. die in Klammer angegebenen Werte bedeuten die pH-Werte des Mediums.

Beispiel 7

50 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 2,0% (G/V) Polypepton, 0,5% (G/V) Fleischextrakt, I % (G/V) Glucose, 1 % (G/V) Calciumwrbonat und 0,5% (G/V) Natriumchlorid werden im Auto* klav sterilisiert. Das Medium wurde mit einer öse voll

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Streptomyces fradiae ISP-5063 beimpft, worauf das Nährmedium fcsi 25 C 48 h lang unter Schütteln kultiviert wurde. Auf diese Weise wurde die Impf- ; kultur erhalten.

50 ml eines wäßrigen Nährmediums der angegebenen Zusammensetzung wurden in einen 250 <ml-Erlenmeyerkolben eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortributylamin wurde dem Medium zugesetzt. Das Nährmedium wurde so dann bei 121 'C 20 min _. lang im Autoklav sterilisiert, worauf es gekühlt wurde, it» panach wurde 1 inS lmpfkuitur dem Medium zuge- :setzt. Anschließend wurde das Medium bei 25" G unter Schütteln (150 Cyclen/min) kultiviert. Die Menge (mcg/ml) des im Näbrmedium angereicherten Antibioticums Neomycin ist in der folgenden Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

■Menge ψη zugesetztem Perfluortfibutylamin %(V/V) 2Tage'

küttiyisrUQgszeit 3 Tage 5 Tage

!0j852 (W) 1,15p (8,7) 1,142 (9,0)
1,413(8,6) 1,650(8,8) 1,510(9,1)

Jn obiger Tabelle ist zu beachten:

4. Die Menge des an im Ivfährmedium angereicherten Antibioticums Nep.mycin windle bestimmt mit Hilfe der Zyiinderplättenmethode unter Verwendung yon'-StaRhylqcoccus aureus Terashima als empfindlicher Mikroorganismus und

2. die in Klammern angegebenen Werte bedeuten die pH-Werte des Mediums.

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Claims (1)

1. Patentansprüche:

   ' ' I. Verfahren zum Züchten von Bakterien, Pilzen,

   Riefen oder Aetynomyeeten in einem wäßrigen

   ?. ^rthrjiicdium, dadurch gekennzcicIr-

   ,4ΐ) e t, daß man dem Nährmcdium ein Silikonöl mit

   cirrcr Viskosität von 0,65 bis 15 Centipoise oder

   ,Perfluor-tributylamin, Pcrfluor-2-butylfuran, Per-

   i fluor-n-heptan, Pcrfluornaphthnlin, Perfluor-1-

   %iethylnaphthalin, Perfluor-n-mcthylmorpholin,

   ;,_tlil,2,2,2-Tetrafluoräthyläther von Pcrfluor(2,5,8-trir

   "iⁱ'⁽niethyl-3,6,9-trioxadodecanol) oder Perfluor-I-

   'methyldecalin in einer Menge von 5 bis 80 Volum-