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Herstellung von Erythromycin Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung
von Erythromycin bildenden Mikroorganismen, insbesondere auf das Verfahren und die
Zusammensetzung der Nährböden zur Erzielung höherer Erythromycinausbeuten, dadurch
gekennzeichnet, daB man den Erythromycinnährmedien Propanal, n-Propanol, Methanol,
Äthanol oder n-Butanol zufügt.
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Ziel der Erfindung ist die Entwicklung neuer und verbesserter Verfahren
zur Gewinnung von Erythromycin. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Entwicklung
neuer und verbesserter Nährböden für die Züchtung von erythromycinbildenden Kulturen.
Ferner richtet sich die Erfindung auf Zusatzmittel, die bei Zugabe zu den Erythromycinnährböden
die Erythromycinausbeute erhöhen. Weitere Ziele gehen aus der Beschreibung hervor.
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Diese Ziele werden bei der Erfindung dadurch erreicht, daB man beim
Ansetzen der Erythromycin bildenden Kulturen dem verwendeten Erythromycinnährboden
Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol oder n-Butanol in einer solchen Menge zufügt,
die ausreicht, um die Bildung von Erythromycin zu fördern. Durch die Zugabe eines
solchen Stoffes zu dem Erythromycinnährboden und das Ansetzen von
erythromycinbildenden
Kulturen in solchen Nährböden wird eine Erythromycinausbeute erhalten, die wesentlich
größer ist als die bei Abwesenheit eines dieser Stoffe erhaltene Ausbeute.
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Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung züchtet man
die Kultur eines erythromycinbildenden Mikroorganismus, wie z. B. Streptomyces erythreus
NRRL 2338, in einem erfindungsgemäßen Erythromycinnährboden, wobei bekannte Verfahren
und Vorrichtungen angewendet werden (s. hierzu das südafrikanische Patent 16 073
und vAntibiotics and Chemotherapya Nr. 2, S. 281 bis _283 [Juni 1g52]). Die Kulturen
werden unter aerobischen Bedingungen und vorteilhafterweise nach submersem Verfahren
gezüchtet. Zu Beginn wird der pH-Wert des Nährmediums auf einen zwischen 6 und 7,5
liegenden Wert, am besten auf etwa 6,5 eingestellt. Während des Wachstums der Kulturen
steigt der pH-Wert gewöhnlich bis zu etwa 9,5 an. Es ist zweckmäßig, die
Temperatur zwischen etwa 25 und 37°, vorzugsweise zwischen 26 und 32°, zu halten.
In dieser und in anderer Hinsicht kann man mit Vorteil den Vorschriften des obenerwähnten
südafrikanischen Patents 16 073 folgen.
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Der Hauptbestandteil der Erythromycinnährmedien sind Kohlehydrate.
Bevorzugte Kohlehydratquellen sind Stärke und Dextrose (Glukose). Andere Stoffe,
die mit verwendet werden oder an Stelle von Stärke und Dextrose treten können, sind
Saccharose, Dextrin, Melasse, brauner Zucker, Maltose u. ä. Die Erythromycinnährmedien
enthalten vorteilhafterweise noch zusätzliche Stickstoffquellen besonders organischer
Art, wie Malseinquellwasser, Sojabohnenmehl, lösliche Destillationsrückstände, Kasein,
Aminosäurengemische, Peptone (sowohl von Fleisch als auch von Sojabohnen), Brauereihefe,
Erdnußkerne, Erdnußmehl u. dgl. Man kann auch anorganische Stickstoffquellen, z.
B. Nitrate oder Ammoniumsalze, verwenden. Die Substrate können ferner anorganische
Nährsalze enthalten, die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat-
und ähnliche Ionen liefern. Wesentliche Spurenelemente, wie Kobalt, Magnesium, Eisen
und Mangan, können zugesetzt werden, obgleich gewöhnlich genügende Mengen dieser
Elemente durch die anderen Bestandteile der Nährmedien geliefert werden.
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Ein geeignetes Grundnährmedium für Erythromycinkulturen enthält vorteilhafterweise
etwa 0,5 bis etwa 1o0/0 Kohlehydratbestandteile, etwa 0,5 bis etwa 5% Stickstoffverbindungen,
bis zu etwa i0/, Nährsalze und bis zu etwa 0,5% Calciumcarbonat oder ein ähnliches
Puffersalz. Der Rest besteht im wesentlichen aus Wasser. Zu diesem Grundnährmedium
wird nach vorliegender Erfindung Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol oder n-Butanol
in einer für die Anregung der Erythromycinbildung ausreichenden Menge zugegeben.
Gewöhnlich liegt die Menge dieser Zusätze nicht über etwa 1%, aber auch jede kleinere
Menge bis hinab zu noch wirksamen Mindestkonzentrationen kann benutzt werden. Meist
ist es aber nicht zweckmäßig, weniger als etwa o,10/0 anzuwenden, obgleich eine
wirksame Anregung manchmal schon bei Konzentrationen unter etwa 0,o50/0 erreicht
wird. (Die hier angegebenen Teile und Prozentsätze sind gewichtsbezogen, sofern
nichts anderes vermerkt wird.) Das erfindungsgemäß verwendete Zusatzmittel wird
am besten vor oder gleichzeitig mit der Impfung zu dem Erythromycinnährmedium gegeben.
Es kann zugefügt werden, bevor das Medium sterilisiert wird oder in sterilem Zustand
hinterher, jedoch noch vor der Impfung. Man kann dabei die gewünschte Menge des
Zusatzmittels entweder zu Beginn auf einmal oder in Teilmengen nacheinander während
des Wachstums zugeben. Es ist manchmal von Vorteil, das Zusatzmittel zuzufügen,
nachdem die Kultur gewachsen ist, das heißt etwa 1 bis 3 Tage nach der Impfung.
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Geeignete Zusatzmittel, die zur Vergrößerung der Erythromycinproduktion
zu einem Grundnährmedium gegeben werden können, sind Propanal, n-Propanol, Methanol,
Äthanol und n-Butanol. Diese Stoffe sind eng miteinander verwandt, da diese Alkohole
geradkettige 1-Alkanole mit nicht mehr als q. Kohlenstoffatomen sind und Propanal
in seiner hydratisierten Form das geradkettige Alkan-1, 1-diol, nämlich das Propan-1,
1-diol ist. Bei allen diesen Stoffen wurde festgestellt, daß sie die Bildung von
Erythromycin anregen. Wie sich gezeigt hat, überragt n-Propanol jedoch alle anderen
Stoffe.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich,
die zur Erläuterung des vorliegenden Verfahrens und der Zusammensetzung der Nährböden
dienen, ohne daß jedoch die Erfindung auf diese Ausführungsarten beschränkt sein
soll. Beispiel Es wird eine Sporen enthaltende Kultur hergestellt, indem man Streptomyces
erythreus, Stamm NRRL 2338, auf einem Schrägnährboden züchtet. Die Sporen werden
in wäßriger Suspension gewonnen und zur Impfung eines Nährmediums benutzt, indem
das Wachstum der Mikroorganismen weitergeht. Die Sporensuspension wird in einen
500 ccm großen Kolben gegeben, der Zoo ccm einer sterilen Nährflüssigkeit
mit folgender Zusammensetzung enthält:
| Dextrose (technisch rein) ......... 1o g |
| Fleischextrakt ................... 1o g |
| Natriumchlorid .................. 59 |
| Bacto-Pepton.................... 59 |
| Wasser................. ........ looo ccm |
Der- Kolben wird dann 3 Tage lang bei 28,5° unter Schütteln bebrütet. Mengen von
je 5 ccm der auf diese Weise erhaltenen Kultur werden nun in andere Kolben gegeben,
die Zoo ccm Erythromycinnährlösung enthalten, und diese Kolben werden 7 Tage lang
bei 28,5° unter Schütteln bebrütet, wobei jeweils am fünften, sechsten und siebenten
Tage Proben entnommen wurden.
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Die erhaltenen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben,
wobei die verschiedenen angegebenen Zusatzmittel in den in der Tabelle angegebenen
Mengen zu der aus den folgenden
Bestandteilen bestehenden Grundnährflüssigkeit
gegeben werden.
| Technisch reine Dextrose .......... 25 g |
| Sojabohnenmehl (teilweise entfettet) 9,59 |
| Brauereihefe (entbittert) .......... 5 g |
| Natriumchlorid .................. 59 |
| Calciumcarbonat ................. 2 g |
| Wasser.......................... iooo ccm |
| Tabelle I |
| EinfluB der verschiedenen Zusatzmittel auf die |
| Erythromycinausbeute |
| Zusatzmittel Konzentration Höchstausbeute |
| °% |
| in y/ccm |
| Keine ............. o 182 |
| Methanol.......... o,6 273 |
| Äthanol .......... o,6 315 |
| n-Propanol........ o,6 392 |
| n-Butanol......... o,6 248 |
| Propanal ......... o,6 298 |
In der folgenden Tabelle wird der EinfluB der Zusatzmittel gezeigt, wenn diese nach
der Sterilisation, jedoch vor der Impfung zugegeben wurden.
| Tabelle II |
| EinfluB der verschiedenen Zusatzmittel auf die |
| Erythromycinausbeute |
| Zusatzmittel Konzentration Höchstausbeute |
| °/o |
| in y/ccm |
| Keine ............. 0 340 |
| Äthanol .......... 0,4 455 |
| n-Propanol........ 0,4 938 |
| n-Butanol......... 0,4 468 |
| Propanal ......... 0,4 390 |
In allen in den Tabellen aufgeführten Fällen betrug der anfängliche p11-Wert etwa
6,6.