DE936412C

DE936412C - Herstellung von Erythromycin

Info

Publication number: DE936412C
Application number: DEU2787A
Authority: DE
Inventors: Herman Hoeksema; Lionel Edward Rhuland
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1953-06-12
Filing date: 1954-05-23
Publication date: 1955-12-15

Description

Herstellung von Erythromycin Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung von Erythromycin bildenden Mikroorganismen, insbesondere auf das Verfahren und die Zusammensetzung der Nährböden zur Erzielung höherer Erythromycinausbeuten, dadurch gekennzeichnet, daB man den Erythromycinnährmedien Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol oder n-Butanol zufügt.
Ziel der Erfindung ist die Entwicklung neuer und verbesserter Verfahren zur Gewinnung von Erythromycin. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Entwicklung neuer und verbesserter Nährböden für die Züchtung von erythromycinbildenden Kulturen. Ferner richtet sich die Erfindung auf Zusatzmittel, die bei Zugabe zu den Erythromycinnährböden die Erythromycinausbeute erhöhen. Weitere Ziele gehen aus der Beschreibung hervor.
Diese Ziele werden bei der Erfindung dadurch erreicht, daB man beim Ansetzen der Erythromycin bildenden Kulturen dem verwendeten Erythromycinnährboden Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol oder n-Butanol in einer solchen Menge zufügt, die ausreicht, um die Bildung von Erythromycin zu fördern. Durch die Zugabe eines solchen Stoffes zu dem Erythromycinnährboden und das Ansetzen von erythromycinbildenden Kulturen in solchen Nährböden wird eine Erythromycinausbeute erhalten, die wesentlich größer ist als die bei Abwesenheit eines dieser Stoffe erhaltene Ausbeute.
Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung züchtet man die Kultur eines erythromycinbildenden Mikroorganismus, wie z. B. Streptomyces erythreus NRRL 2338, in einem erfindungsgemäßen Erythromycinnährboden, wobei bekannte Verfahren und Vorrichtungen angewendet werden (s. hierzu das südafrikanische Patent 16 073 und vAntibiotics and Chemotherapya Nr. 2, S. 281 bis _283 [Juni 1g52]). Die Kulturen werden unter aerobischen Bedingungen und vorteilhafterweise nach submersem Verfahren gezüchtet. Zu Beginn wird der pH-Wert des Nährmediums auf einen zwischen 6 und 7,5 liegenden Wert, am besten auf etwa 6,5 eingestellt. Während des Wachstums der Kulturen steigt der pH-Wert gewöhnlich bis zu etwa 9,5 an. Es ist zweckmäßig, die Temperatur zwischen etwa 25 und 37°, vorzugsweise zwischen 26 und 32°, zu halten. In dieser und in anderer Hinsicht kann man mit Vorteil den Vorschriften des obenerwähnten südafrikanischen Patents 16 073 folgen.
Der Hauptbestandteil der Erythromycinnährmedien sind Kohlehydrate. Bevorzugte Kohlehydratquellen sind Stärke und Dextrose (Glukose). Andere Stoffe, die mit verwendet werden oder an Stelle von Stärke und Dextrose treten können, sind Saccharose, Dextrin, Melasse, brauner Zucker, Maltose u. ä. Die Erythromycinnährmedien enthalten vorteilhafterweise noch zusätzliche Stickstoffquellen besonders organischer Art, wie Malseinquellwasser, Sojabohnenmehl, lösliche Destillationsrückstände, Kasein, Aminosäurengemische, Peptone (sowohl von Fleisch als auch von Sojabohnen), Brauereihefe, Erdnußkerne, Erdnußmehl u. dgl. Man kann auch anorganische Stickstoffquellen, z. B. Nitrate oder Ammoniumsalze, verwenden. Die Substrate können ferner anorganische Nährsalze enthalten, die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- und ähnliche Ionen liefern. Wesentliche Spurenelemente, wie Kobalt, Magnesium, Eisen und Mangan, können zugesetzt werden, obgleich gewöhnlich genügende Mengen dieser Elemente durch die anderen Bestandteile der Nährmedien geliefert werden.
Ein geeignetes Grundnährmedium für Erythromycinkulturen enthält vorteilhafterweise etwa 0,5 bis etwa 1o0/0 Kohlehydratbestandteile, etwa 0,5 bis etwa 5% Stickstoffverbindungen, bis zu etwa i0/, Nährsalze und bis zu etwa 0,5% Calciumcarbonat oder ein ähnliches Puffersalz. Der Rest besteht im wesentlichen aus Wasser. Zu diesem Grundnährmedium wird nach vorliegender Erfindung Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol oder n-Butanol in einer für die Anregung der Erythromycinbildung ausreichenden Menge zugegeben. Gewöhnlich liegt die Menge dieser Zusätze nicht über etwa 1%, aber auch jede kleinere Menge bis hinab zu noch wirksamen Mindestkonzentrationen kann benutzt werden. Meist ist es aber nicht zweckmäßig, weniger als etwa o,10/0 anzuwenden, obgleich eine wirksame Anregung manchmal schon bei Konzentrationen unter etwa 0,o50/0 erreicht wird. (Die hier angegebenen Teile und Prozentsätze sind gewichtsbezogen, sofern nichts anderes vermerkt wird.) Das erfindungsgemäß verwendete Zusatzmittel wird am besten vor oder gleichzeitig mit der Impfung zu dem Erythromycinnährmedium gegeben. Es kann zugefügt werden, bevor das Medium sterilisiert wird oder in sterilem Zustand hinterher, jedoch noch vor der Impfung. Man kann dabei die gewünschte Menge des Zusatzmittels entweder zu Beginn auf einmal oder in Teilmengen nacheinander während des Wachstums zugeben. Es ist manchmal von Vorteil, das Zusatzmittel zuzufügen, nachdem die Kultur gewachsen ist, das heißt etwa 1 bis 3 Tage nach der Impfung.
Geeignete Zusatzmittel, die zur Vergrößerung der Erythromycinproduktion zu einem Grundnährmedium gegeben werden können, sind Propanal, n-Propanol, Methanol, Äthanol und n-Butanol. Diese Stoffe sind eng miteinander verwandt, da diese Alkohole geradkettige 1-Alkanole mit nicht mehr als q. Kohlenstoffatomen sind und Propanal in seiner hydratisierten Form das geradkettige Alkan-1, 1-diol, nämlich das Propan-1, 1-diol ist. Bei allen diesen Stoffen wurde festgestellt, daß sie die Bildung von Erythromycin anregen. Wie sich gezeigt hat, überragt n-Propanol jedoch alle anderen Stoffe.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich, die zur Erläuterung des vorliegenden Verfahrens und der Zusammensetzung der Nährböden dienen, ohne daß jedoch die Erfindung auf diese Ausführungsarten beschränkt sein soll. Beispiel Es wird eine Sporen enthaltende Kultur hergestellt, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, auf einem Schrägnährboden züchtet. Die Sporen werden in wäßriger Suspension gewonnen und zur Impfung eines Nährmediums benutzt, indem das Wachstum der Mikroorganismen weitergeht. Die Sporensuspension wird in einen 500 ccm großen Kolben gegeben, der Zoo ccm einer sterilen Nährflüssigkeit mit folgender Zusammensetzung enthält:

Dextrose (technisch rein) ......... 1o g

Fleischextrakt ................... 1o g

Natriumchlorid .................. 59

Bacto-Pepton.................... 59

Wasser................. ........ looo ccm

Der- Kolben wird dann 3 Tage lang bei 28,5° unter Schütteln bebrütet. Mengen von je 5 ccm der auf diese Weise erhaltenen Kultur werden nun in andere Kolben gegeben, die Zoo ccm Erythromycinnährlösung enthalten, und diese Kolben werden 7 Tage lang bei 28,5° unter Schütteln bebrütet, wobei jeweils am fünften, sechsten und siebenten Tage Proben entnommen wurden.

Die erhaltenen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben, wobei die verschiedenen angegebenen Zusatzmittel in den in der Tabelle angegebenen Mengen zu der aus den folgenden Bestandteilen bestehenden Grundnährflüssigkeit gegeben werden.

Technisch reine Dextrose .......... 25 g

Sojabohnenmehl (teilweise entfettet) 9,59

Brauereihefe (entbittert) .......... 5 g

Natriumchlorid .................. 59

Calciumcarbonat ................. 2 g

Wasser.......................... iooo ccm

Tabelle I

EinfluB der verschiedenen Zusatzmittel auf die

Erythromycinausbeute

Zusatzmittel Konzentration Höchstausbeute

°%

in y/ccm

Keine ............. o 182

Methanol.......... o,6 273

Äthanol .......... o,6 315

n-Propanol........ o,6 392

n-Butanol......... o,6 248

Propanal ......... o,6 298

In der folgenden Tabelle wird der EinfluB der Zusatzmittel gezeigt, wenn diese nach der Sterilisation, jedoch vor der Impfung zugegeben wurden.

Tabelle II

EinfluB der verschiedenen Zusatzmittel auf die

Erythromycinausbeute

Zusatzmittel Konzentration Höchstausbeute

°/o

in y/ccm

Keine ............. 0 340

Äthanol .......... 0,4 455

n-Propanol........ 0,4 938

n-Butanol......... 0,4 468

Propanal ......... 0,4 390

In allen in den Tabellen aufgeführten Fällen betrug der anfängliche p11-Wert etwa 6,6.

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von geradkettigen Z-Alkanolen mit höchstens 4 C-Atomen, wie Methanol, Äthanol, n-Propanol und n-Butanol, oder von Propanal in Mengen von 0,05 bis Z°/° als ausbeutesteigernder Zusatz zu Nährlösungen für die Erythromycingewinnung auf biologischem Wege.