DE1570018B1

DE1570018B1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid

Info

Publication number: DE1570018B1
Application number: DE1965K0055359
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama; Haruo Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1964-02-24
Filing date: 1965-02-23
Publication date: 1970-04-02
Also published as: FR1425028A; GB1069200A; US3328261A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen herstellung von 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid, hier als AICAR bezeochnet. Diese Verbindung, die der Formel entspricht, ist ein wichtiges Zwischenprodukt in der Biosynthese von Nucleinsäure und deren Derivaten.
Ziel der Erfindung ist ein technisch tragbares Verfahren, d. h ein billiges und hohe Ausbeuten lieferndes Verfahren zur Erzeugung von AICAR. Erreicht wird dieses Ziel dadurch, daß man ein 5-Amino-4-imidazolcarboxamid enthaltendes fermentierbares Nährmedium mittels Brevibacterium ammoniagenes ATCC-6871-, ATCC-6872-, ATCC-15750- oderATCC-15751-Mikroorganismen fermentiert und dadurch die Umwandlung des genannten Carboxamids in das entsprechende Ribotid AICAR bewirkt. Das 5-Amino-4-imidazolcarboxamid kann dem Züchtungsmedium in jedem Stadium des Fermentationsverfahrens, d. h. zu Beginn oder während des Verfahrens zugesetzt werden.
Das Medium selbst entspricht, abgesehen von der Anwesenheit des 5-Amino-4-imidazolcarboxamids, in der Art und Zusammensetzung den normalerweise zur Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes verwendeten Medien. Es kann also aus Medien hergestellt werden, die die üblichen geeigneten Mengen von Kohlehydraten oder anderen Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen usw.), Stickstoffquellen (Harnstoff, Anunoniumchlorid, Ammoniumnitrat usw.), an anorganischen Verbindungen (Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid usw.), natürliche Substanzen mit Stickstoff (Maiseinweichwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl usw.) enthalten. Wenn man sich eines Brevibacterium-ammoniagenes-Stammes mit einer besonderen Nährstoffanforderung bedient, wird der geeignete Nährstoff, der für das Wachstum erforderlich ist, dem Züchtungsmedium zugesetzt. Das 5-Amino-4imidazolcarboxamid, welches verfahrensgemäß in dem Züchtungsmedium vorhanden sein muß, das wie oben geschildert zusammengesetzt ist, kann in einer Gabe zu Beginn oder während der Fermentation zugesetzt werden.
Die Fermentation selbst verläuft in der zur Züchtung von Brevibacterium ammoniagenes üblichen und an sich bekannten Weise, d. h. wird aerob, in einer Bintauch oder in einer Schüttelkultur, bei einer Temperatur von 20 bis 400C und einem pH-Wert von S,5 bis 9,0 durchgelührt, bis sich in der Fermentationsffilssigkeit die größtmögliche Menge AICAR angesamnldt hat, was gewöhnlich 2 bis 8 Tage dauert.
Nach Vervollständigung der fermentativen Umwandlung des 5-Ammo-a-imidazolcarbo% amids in AICAR wird letzteres aus der Fermentationsflüssigkeit nach einem der üblichen und an sich bekannten Verfahren zur Gewinnung fermentativer Umwandlungsprodukte, d. h. nach einem Ionenaustauschharz-Adsorptionsverfahren, nach einem Fällungsverfahren, nach einem Extraktionsverfahren od. dgl. gewonnen.
Die folgenden Beispiele erläutern zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Gewichtsteile verhalten sich zu Volumteilen wie g zu ccm.
Prozentangaben sind Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben.
Beispiel 1 Brevibacterium ammoniagenes (ATCC-6872) wird einem Züchtungsmedium aufgeimpft, das aus Glucose ................ 2% Petpton ................ 1% hefeextrakt ............ 1% NaCl .................. 0,3% Biotin ................ 30 µg (gamma) Rest Wasser bis zu einem Liter bestand, wobei man die Bebrütung bei 300 C 24 Stunden dauern ließ.
10 Volumprozent des so erhaltenen Inoculums werden dem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung: Glucose .............. 100 g harnstoff ............ 6 g K2HPO4 . 10 g KH2PO4 ....... 10 g MgSO4 # 7H2O ......... 10 g CaCl2 # 2H2O ......... 0,1 g Hefeextrakt ........... 10 g Biotin ............... 30 µg (gamma) je Liter Wasser aufgeimpft. Der pH-Wert des Mediums wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt (Anmerkung: Die Sterilisation des Fermentationsmediums wird zuvor 10 Minuten in einer Sterilisiervorrichtung unter einem Druck von 1 kg/cm2 durchgeführt).
Die aerobe Züchtung unter Wasser wird bei 30°C durchgeführt.
Das kann gegebenenfalls in 25Sccm-Kolben erfolgen, von denen jeder 20 ccm des Fermentationsmediums enthält, das wie oben beschrieben beimpft worden ist. In der gleichen Weise kann man das Ganze in großem Maßstab durchführen, wobei man z*-B. 11 oder mehr des beimpften Fermentationsmediums der aeroben Behandlung unter Wasser in einem entsprechend größeren Gefäß unterwirft, welches mit Rühr- und Erhitzungsvorrichtungen usw. ausgerüstet ist.
Nach einer 72-Stunden-Züchtung wird 5-Amino-4-imidazolcarbonamid der Fermentationsflüssigkeit in solcher Menge zugesetzt, daß es in einer Konzentration von 1 mg/ccm (1 g/l) vorliegt. Die Züchtung wird dann weitere 24 oder mehr Stunden fortesetzt.
Als Ergebnis werden in der Fermentationsflüssigkeit 0,68 mg/ccm (0,68 g/l) AICAR akkumuliert.
Das so erzeugte AICAR wird aus dem Reaktionsgemisch nach einer geeigneten und an sich üblichen Verfahrensweise isoliert, die besondere Art der Isolierung stellt an sich keinen Bestandteil der vorliegenden Erfindung dar. AICAR ist eine bekannte Verbindung, die aus Reaktionsgemischen schon vielfach gewonnen worden ist.

Beispiel 2 Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, nur wird statt des Brevibacterium ammoniagenes ATCC-6872 von Beispiel 1 Brevibacterium ammoniagenes ATCC-6871, 15750, 15751 benutzt. Die jeweils nach 96stündiger Züchtung akkumulierte Menge AICAR geht aus der folgenden Tabelle hervor.

AICAR

akkumulien

mgsml

Brevibacterium ammoniagens

ATCC-6871 ....................... 0,67

Brevibacterium ammoniagenes

ATCC-15750 ....................... 0,70

Brevibacterium ammoniagenes

ATCC-15751 ......................... 0,65

Patentansprüche: 1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid, d a- d u r c h gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC-6871, ATCC-6872, ATCC-15750 oder ATCC-15751 unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,d in einem wäßrigen, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid enthaltenden Medium, das die üblichen Nährstoffe aufweist, züchtet und daß man die Züchtung fortführt, bis sich erhebliche Mengen des Ribotids im Medium angesammelt haben.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung nach dem Submersverfahren erfolgt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 5-Amino-4-imidazolcarboxamid dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung zugesetzt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 5-Amino-4-imidazolcarboxamid dem Nährmedium zugesetzt wird, nachdem die Züchtung schon eine beträchtliche Zeit in Abwesenheit von 5-Amino-4-imidazolcarboxamid erfolgt ist.