DE2151325A1

DE2151325A1 - Verfahren zur Gewinnung von Nikotinsaeureamidadenin-dinukleotid-phosphat

Info

Publication number: DE2151325A1
Application number: DE19712151325
Authority: DE
Inventors: Fumio Kato; Yoshiaki Shimizu; Toshio Tatano; Akira Yamaguchi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1970-10-27
Filing date: 1971-10-15
Publication date: 1972-05-04
Also published as: US3728222A; FR2131242A5; JPS5133191B1; DE2151325B2; GB1369068A; CA974908A

Description

Andrejewski, Honke & Gesthuysen Anwaltsakte: yj 673/Ja-

2151325 Patentanwälte

Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-lng. Manfred Honke Diplom-Ingenieur Hans Dieter Gesthuysen

4300 Essen, den 12.Okt. 1971 Theaterplatz 3

Patentanmeldung KYOWA HAKKO KOGYO KAHJSHIKI KAISHA No. 6-1, 1-chome, Ohte-machi, Chiyoda-ku, Tokyo-to / Japan

Verfahren zur Gewinnung von Nikotinsäureamidadenin-dinukleotid-phosphat

Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat wird durch
Fermentation eines Mikroorganismus bereitet, welcher sein kann: Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter citreus, Corynebacterium rathayi, Micrococous varians, Seratia marcescens, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae u. Streptomyces aureus. Die Fermentation spielt sich in einem Zuchtmedium ab, das wenigstens eine der nach-

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folgenden Verbindungen enthält: Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Niktotinsäure-mononukleotid, Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosid, Nikotinsäureamid-ribosid u. Nikotinsäure-adenin-dinukleotid zusammen mit Adeninderivaten.

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat durch Fermentation»

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Gewinnung von Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotidphosphat durch Fermentation mit geringen Kosten u. im industriellen Maßstab vorzusehen.

Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat, welches oftmals auch "Koenzyra II", "Dehydrierungs-Koenzym II" oder "Triphosphopyridin-nukleotid" genannt wird, ist eine wichtige Verbindung auf biologischem Gebiet und wird durch folgende Formel dargestellt:

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Wir haben nun als Ergebnis intensiver Studien bei der Gewinnung von Nukleotiden durch Fermentation gefunden, daß große Mengen an Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat durch Fermentation produziert und angesammelt werden können, wobei dafür gesorgt ist, daß ein Nikotinsäureamidadenin-dinukleotid-phosphat-produzierender Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, welches wenigstens eine der nachfolgenden Verbindungen: Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Nikotinsäure-mononukleotidr Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosid, Nikotinsäureamid-ribosid und NikotinsUure-adenin-dinukleotid und wenigstens eine der folgenden Verbindungen: Adenin und dessen Derivate, z.B. Adeninribosid, Adenin-ribotid, zuzüglich eines oberflächenaktiven Mittels enthält. Diese Zusatzstoffe sollten während der Züchtung in dem Zuchtmedium vorhanden sein.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bereitung von Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat durch Fermentation vorgesehen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat-produzierender Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, welches wenigstens eine der nachfolgenden Verbindungen: Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Nikotinsäure-mononukleotid, Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosid, Nikotinsäureamid-

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ribosid, Nikotinsäure-adenin-dinukleotid und wenigstens eine der folgenden Verbindungen: Adenin und dessen Derivate zuzüglich eines oberflächenaktiven Mittels enthält. Diese Zusatzstoffe sollten während der Züchtung in dem Zuchtmedium vorhanden sein.

Beispiele für Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphatproduzierende Mikroorganismen, welche für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden können, sind: Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68 71> Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68 72, Arthrobacter ureafaciens ATCC 75 62, Arthrobacter citreus ATCC 11624, Corynebacterium rathayi ATCC 13 659, Micrococcus varians ATCC 399, Serratia marcescens ATCC I9 18O, Candida utilis ATCC 99 50, Saccharomyces cerevisiae ATCC 15 248, Streptomyces aureus ATCC 33 09 u.dgl., obgleich auch jeder andere Mikroorganismus verwendet werden kann, sofern er imstande ist, Nikotinsäure-amid-adenin-dinukleotidphosphat durch Fermentation zu produzieren.

Es ist möglich, als Zuchtmedium jedes beliebige Medium zu verwenden, das eine geeignete Menge an C-Quellen, wie Sacoharin-Materialien, z.B. Glukose, Stärkehydrolysat, Melasse und Kohlenwasserstoffen, an N-Quellen (z.B. Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat), an anorgan. Materialien (z.B. K-JPO^, MgSO^, KCl) und an N-haltigen natürlichen

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Quellen (z.B. Maiswasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl) enthält. In dem Falle, daß der verwendete Stamm eine"spezielle Anforderung an seine Ernährung hat, ist es notwendig, dem Medium die erforderlichen Nährstoffe zuzusetzen.

Wenigstens eines sowohl von Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Nikotinsauremononukleotid, Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosid, Nikotinsäureamid-ribosid, Nikotinsäureadenin-dinukleotid als auch von Adenin oder dessen Derivaten sollten in dem Medium vorhanden sein.Diese Substanzen können dem Medium am Beginn oder nach einiger Zeit während des Züchtungsverlaufs zugesetzt werden. Die Menge dieser vorzugsweise vorhandenen Verbindungen liegt zwischen 50 mg/l und 10 g/l.

Es ist möglich, als oberflächenaktives Mittel verschiedene zu verwenden, wie Cetyl-trimethyl-ammoniumbromid, Cetyl-pyridinchlorid, Trimethyl-okta'decyl — ammoniumchlorid, AlkyldiT methylbenzyl-ammoniumchlorid, Polyoxyäthylen-alkylamin, die Derivate von Hydroxyäthylglyoxalizin, Lauryl-trimethylammoniumchlorid, Polyoxyäthylen-stearylamin u.dgl.; anionische oberflächenaktive Mittel, wie Na^Lumlaurylsulfat, Natriumoleylamidsulfat u.dgl., und nichtionische oberflächenaktive Mittel (Nonioniks), wie Trioxyäthylen-sorbitan-

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monostearat, Trioxyäthylen-sorbitan-monopalmitat u.dgl.. Die Menge an dem Medium zuzusetzendem oberflächenaktiven Mittel kann in Abhängigkeit von den Arten der oberflächenaktiven Mittel und dem Zusatzzeitpunkt variieren. Es ist jedoch vorzuziehen, das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von ca. 0,01 - 0,5 % anzuwenden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen ausgeführt, die durch Schütteln während des Züchtens oder durch Unterwasserkultur mit Belüften und Rühren u.dgl. erzeugt werden. Die Fermentation wird vorzugsweise bei eine r Temperatur von ca. 20-40° C und bei einem p„ von ca. 5*5-9*0 durchgeführt.

Die Züchtung erfordert üblicher Weise 2-8 Tage, um in dem Medium eine greifbare Menge an Nikotinsäureamid-adenindinukleotid-phosphat zu produzieren und anzusammeln.

Nach Vollendung der Züchtung kann das Nikotinsäureamidadenin-dinukleotid-phosphat nach irgendeiner der altbekannten Methoden gewonnen werden, wie durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Adorption u.dgl.. Die nachfolgenden, jedoch nicht einschränkenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68 72 wurde als Saatkultur verwendet. Es wurde ein Medium bereitet, das aus 5 # Glukose, 1 % Fleischextrakt, 1 % Pepton und 0,25 % NaCl bestand und dieses wurde mit Natronlauge auf ein p„ von 7*5 eingestellt. Das Saatzuchtmedium wurde in 500 ml-Portionen unterteilt in konische 21-Kolben gebracht und danach zur Sterilisation gekocht. Getrennt sterilisierter Harnstoff in Mengen von 0,25 Gew.-% wurde dem Medium zugesetzt, welches anschließend mit dem Saatzuchtstamm beimpft wurde. Die beimpfte Saatkultur wurde dann 24 Std. unter Schütteln bei 28° C gezüchtet.

Es wurde ein Fermentationsmedium bereitet, welches aus 14 % Glukose, 0,6 % Fleischextrakt, 1,4 % K₂HPO^ 1,4 #, KH₂PO₁^, 1,4 % MgSO₂^O,01 % CaCl₂, 0,001 % FeSO^, , 0,001 # ZnSOj₁, 20 mg/l 1-Cystin, 5 mg/l ß-Alanin, 50 racg/1 Biotin, 5 mg/l Kiiamin und 100 mcg/l MnSO₁, bestand, und auf ein Pjr von 7*0 eingestellt, um anschließend zur Sterilisation gekocht zu werden. Daraufhin wurden noch 0,2 % an sterilisiertem Harnstoff zugesetzt.

Das so präparierte Fermentationsmedium (Jl) wurde mit der Saatkultur beimpft und in einen 51-Glasfermenter bei einem Impfstoffinhalt von 1/10 des Volumens eingefüllt. Die ge-

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mischten Saat- und Fermentationskulturen wurden dann bei 52° C unter Rühren (650 r.p.m.) und Belüften (31/Min.) gezüchtet, während das ρ_Η mit NH-, auf 7,0 gesteuert wurde. Nach 50 std. Züchten wurden je 3 g/l (Konzentration nach Zusatz) Adenin und Nikotinsäure, die beide getrennt sterilisiert waren, zugesetzt. Außerdem wurden nach weiterem 48 std. Züchten 2 g/l(Konzentration nach Zusatz) eines von Hydroxy- ψ äthyl-gloyoxalizin abgeleiteten oberflächenaktiven Mittels zugesetzt, welches getrennt sterilisiert worden war. Der Stamm wurde noch weitere 96 Std. gezüchtet, um in der Zuchtbrühe 0,8 g/l Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat zu bilden und anzusammeln. Das Nikotinsäureamid-adenindinukleotid-phosphat wurde durch Ionenaustauschbehandlung gewonnen.

Beispiel 2

Das Züchten wurde auf die gleiche Weise - wie im Beispiel 1 beschrieben - ausgeführt, jedoch wurden die Nikotinsäure durch 3 g/l Nikotinsäureamid und das vorhergehende oberfl flächenaktive Mittel durch 2,5 g/l Polyoxyäthylen-alkylamin ersetzt. Es wurden 1,2 g/l Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat gebildet und in der Zuchtbrühe angesammelt.

Beispiel 3

Es wurde auf die gleiche _T im Beispiel 1 beschriebene Weise eine Saatkultur bereitet. Ein Medium, das aus

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3 % Glukose, 1 % Fleischextrakt, 1 % Pepton, 0,1 % 0,10 % KH₂PO₂^, 0,1 % MgSOj^, 0,002 % FeSO₂^, 0,001 % 5 mg/1 ß-Alanin, 5 mcg/1 Biotin, 0,5 mg/1 Thiamin und 100 mcg/l MnSO₂, bestand, wurde in einem 200 1-Fermenter mit Natronlauge auf ein ρ_Η von 7*2 eingestellt und duroh Kochen sterilisiert. Die Saatkultur wurde auf 100 1 des so bereiteten Mediums bei einem Impfstoffinhalt von 1/50 des Volumens geimpft und unter Rühren (25Ο r.p.m.) und Belüften (60 l/Min.) bei 32° C gezüchtet.

Nach 18 std. Züchten wurde die Zuchtbrühe auf 1 Kl eines Fermentationsmediums, das auf die gleiche Weise - wie im Beispiel 1 beschrieben - bereitet war, in einem 2 Kl Fermenter bei einem Impfstoff-Inhalt von l/lO des Volumens geimpft. Nach 24 std. Züchten wurde Glukose zugesetzt, um (nach Zusatz) eine Konzentration von 7*5 % zu ergeben. Die Züchtung wurde auf die gleiche Weise - wie im Beispiel 2 beschrieben weitere 96 Std. fortgesetzt, um nach Vollendung der Züchtung 1,8 g/l Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat in dem Fermentationsmedium zu bilden und anzusammeln.

Die vorhergehende Beschreibung und die Beispiele erläutern das Verfahren der hier beschriebenen Erfindung. Es ist anzuerkennen, daß verschiedene iinderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von dem Sinn der Erfindung abzuweichen. All die Modifikationen und Änderungen sind als Teile der vorliegenden Erfindung bis zu dem Ausmaß anzusehen, als sie unter die anhängenden Ansprüche fallen.

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Claims

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Patentansprüche

Verfahren zur Gewinnung von Nikotinsäureamid-adenindinukleotid-phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein W Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat-produzierender Mikroorganismus in einem Zuehtmedium gezüchtet wird, das wenigstens eine der nachfolgenden Verbindungen: Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Nikotinsäure-mononukleotid, Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosid, Nikotinsäureamid-ribosid, Nikotinsäure-adenin-dinukleotid, zusammen mit wenigstens einer der Verbindungen: Adenin oder einem seiner Derivate, und ein oberflächenaktives Mittel enthält, und anschließend aus dem Zuchtmaterial Nikotinsäureamidadenin-dinukleotid-phosphat abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt wird aus: Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter ureafaciens, Arthrobacter citreus, Corynebacterium rathayi, Micrococcus vrians, Serratia marcescens, Candida utilis, Saceharomyces aerevisiae und Streptomyces aureus.

J>. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68 71 und ATCC 58 72 ist.

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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Arthrobacter ureafaciens ATCC 75 62 ist."

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Arthrobacter citreus ATCC 11 624 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Corynebacterium rathayi ATCC 13 659 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Micrococcus varians ATCC 399 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Serratia marcescens ATCC 19 l80 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Candida utilis ATCC 99 50 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ATCC 15 248 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces aireus ATCC 33 09 ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zuchtmedium C-Quellen, N-Quellen, anorgan. fellen und

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N-haltlge natürliche Quellen enthält.

13* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ca. 20-^0° C und bei einem p^ von ca. 5,9 - 9,0 in b ca. 2 - 8 Tagen durchgeführt wird.

14. Verfahren zur Gewinnung von Nikotlnsäureamid-adenlndlnukleotid-phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus ausVier Gruppe, bestehend aus: Brevibacterium ammonlagenes ATCC 68 71, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68 72, Arthrobacter ureafaciens ATCC 75 62, Arthrobacter citreus ATCC 11 62*1, Corynebacterium rathayi ATCC 13 659, Hlcrococcus varians ATCC 399* Serratia maroescens ATCC 19 l80, Candida utilis ATCC 99 50, Saccharomyces cerevlsiae ATCC 15 248 und Streptomyces aureus ATCC 33 09 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ca. 20 - 40° C und bei einem p„ von ca. 5*5 - 9*0 in ca. 2-8 Tagen in W einem Zuchtmedium gezüchtet wird, das wenigstens eine der nachfolgenden Verbindungen: Nikotinsäure, Nikotinsäureamid, Nikotinsäure-mononukleotid, Nikotinsäureamid-mononukleotid, Nikotinsäure-ribosld, Nikotinsäureamid- ribosid, Nikotinsäure-adenin-dlnukleotid und wenigstens eine der Verbindungen: Adenin oder eines seiner Derivate und ein oberflächenaktives Mittel, sowie C-Quellen, N-Quellen, anorgan.

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Quellen und natürliche N-haltige Quellen enthält, und daß anschließend das Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotidphosphat aus dem gezüchteten Material abgetrennt wird.

ORIGINAL INSPECTED

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