DE2153588C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von in 2-SteUung substituierten Adeninnueleotiden - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von in 2-SteUung substituierten Adeninnueleotiden

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DE2153588C3 DE19712153588 DE2153588A DE2153588C3 DE 2153588 C3 DE2153588 C3 DE 2153588C3 DE 19712153588 DE19712153588 DE 19712153588 DE 2153588 A DE2153588 A DE 2153588A DE 2153588 C3 DE2153588 C3 DE 2153588C3
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Haruo Machida Tokio Tanaka
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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Description

R-,- O—CH
(D
10
15
20
HO OH
in der Rt eine Methylgruppe oder ein Halogenatom und R2 eine der Gruppen
Il
— P —OH
OH
O O
Il Il
— p—o—p—oh
OH OH
O O
Il Il
— ρ—ο—ρ—ο-Ι I
OH OH
Il
P-OH OH
40
45
bedeutet, durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, das außer den üblichen Bestandteilen ein dem Nucleotid entsprechendes Adeninderivat der allgemeinen Formel Il
NH2
50
55
in der R1 die vorstehend angegebene Bedeutung hat oder ein Ribonucleosid eines solchen Adeninderivates enthält, und Isolieren des in der Gärmaische angereicherten Adeninnucleotids, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Arthrobacter sp. ATCC 21085, Corynebacterium sp. ATCC 21084, Micrococcus sodencnsis ATCC 15932 oder b5 Arthrobactercitreus ATCC 11624 einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adeninderivat oder dessen Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von in 2-Stellung substituierten Adeninnucleotiden bekannt; vgL GB-PS 10 62 371, J. Org. Chem, Bd. 33 (1968), 2583 und J. Med. Chem, Bd. 12 (1969), 494. Diese Verfahren sind jedoch nicht wirtschaftlich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Verfahren zur Herstellung von in 2 Stellung substituierten Adeninnucleotiden zur Verfugung zu stellen, das in technischem Maßstab durchführbar ist Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl synthetische als auch komplexe Nährmedien verwendet werden. Das Nährmedium kann eine Kohlenstoffquelle, z. B. Zucker, wie Glucose, Stärkehydrolysat und Melasse, eine Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, und anorganische Verbindungen, wie Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat, enthalten. Ferner kann dem Medium eine stickstoffhaltige Substanz natürlicher Herkunft, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt Fischmehl und Maisquellwasser, zugesetzt werden.
Die als Vorstufen eingesetzten Adeninderivate oder deren Ribonucleoside können dem vorstehend beschriebenen Nährmedium vor oder während der Fermentation zugesetzt werden. Die Adeninderivate können auf einmal oder während der Fermentation portionsweise oder kontinuierlich zugegeben werden. Das Nährmedium kann verschiedene Konzentrationen der Adeninderivate oder deren Ribonucleoside enthalten, wobei der Bereich von 0,5 mg bis 10 mg/ml Kultur bevorzugt ist.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in Schüttelkultur oder in gerührter und belüfteter Submerskultur, durchgeführt. Vorzugsweise wird die Fermentation bei Temperaturen von 20 bis 40° C und pH-Werten von 4,0 bis 9,5 durchgeführt.
Vorzugsweise wird der Mikroorganismus vor dem Beimpfen des Kulturmediums in einem Anzuchtmedium gezüchtet. Das Anzuchtmedium wird unter für das Wachstum des Mikroorganismus günstigen Bedingungen so lange inkubiert, bis eine geeignete Population gewachsen ist, wofür im allgemeinen etwa 24 Stunden ausreichend sind. Das Anzuchtmedium wird dann zum Beimpfen des Kulturmediums verwendet. Die Fermentation wird sodann so lange durchgeführt, bis sich eine beträchtliche Menge von in 2-Stellung substituierten Adeninnucleotiden in der Gärmaische angereichert hat. Hierfür sind im allgemeinen 1 bis 5 Tage ausreichend. Nach beendeter Fermentation werden die vorgenannten Nucleotide nach bekannten Methoden, z. B. durch Adsorption an einem stark basischen Anionenaustauscher, und anschließende Elution, isoliert.
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungeil sind wertvolle Arzneimittel. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. Fluoradenin-9-j?-D-ribofuranosid-5'-phosphat hergestellt werden.
Diese Verbindung ist in vivo die aktive Form der Antitumor-Verbindungen 2-Fluoradenin oder 2-Fluoradenosin. Das vorgenannte Nucleotid hemmt die
Synthese von Ribonucleinsäure (Shigeura et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 111 [1965], Seite 713 bis 719) und ist ferner ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung anderer Ribonucleotide.
Ein weiteres Beispiel einer erfindungsgemäß herstellbaren Verbindung ist 2-Methyladenin-9-j3-D-ribofuranosid-5'-phosphat das nicht nur als sogenanntes Spurennucleotid in der Transfer-Ribonucleinsäure (Holley, RW. etaL, Cold Spring Harbor Symposia ίο on Quantitative Biology, Band 28 [1963], Seite 117 bis 121), von Bedeutung ist, sondern auch ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung anderer Ribonucleotide darstellt
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
15
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wird 24 Stunden bei 30°C in einem Anzuchimedium gezüchtet, das 2 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Hefeextrakt, 0,3 Prozent NaCl und 30 ug/Liter Biotin enthält 20 ml eines Fermentationsmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben werden mit 10 Volumprozent, bezogen auf das Fermentationsmedium, der so hergestellten Anzuchtkultur beimpft Das Fermentationsmedium hat die Zusammensetzung: 100 g Glucose, 6 g Harnstoff, 10 g KH2PO4,10 g K2HPO4,10 g MgSO4 · 7H2O, 0,1 g CaCl2 · 2H2O, 30 ug Biotin und 10 g Hefeextrakt gelöst in Wasser, wobei das Gesamtvolumen 1 Liter beträgt Das Fermentationsmedium jo wird mit NaOH auf Ph 8,0 eingestellt und vor dem Animpfen 10 Minuten bei einem Druck von 1 atü in einem Autoklav sterilisiert
Nach 72stündiger Fermentation wird die Gärmaische mit 2-Fluoradenin versetzt, so daß die Konzentration dieser Verbindung 2 mg/ml beträgt Die Fermentation wird dann weitere 48 Stunden fortgesetzt In der Kulturbrühe sind nach dieser Zeit 0,80 mg/ml 2-FIuoradenin-9-/?-D-ribofuranosid-5'-monophosphat nachstehend als FAMP bezeichnet 1,41 mg/ml 2-Fluoradening-jJ-D-ribofuranosid-S'-diphosphat, nachstehend als FADP bezeichnet und 1,74 mg/ml 2-Fluoradenin-9-/3-D-ribofuranosid-5'-triphosphat nachstehend als FATP bezeichnet, enthalten. Zur Isolierung der 2-FIuoradeninribonucleotide aus der Kulturbrühe werden diese auf einem stark basischen Anionenaustauscher vom Styroltyp, der in der Ameisensäure-Form vorliegt, adsorbiert. Anschließend werden die 2-Fluoradeninribonucleotide mit einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung eluiert und fraktioniert. Jede der so erhaltenen Fraktionen wird zur Isolierung der 2-Fluoradeninribonucleotide zur Trockene eingedampft Aus 1 Liter Kulturbrühe werden 220 mg FAMP, 450 mg FADP und 510 mg FATP erhalten.
Beispiel 2
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, daß 2-Fluoradenosin an Stelle von 2-Fluoradenin eingesetzt wird. In der Kulturbrühe sind dann 0,50 mg/ml FAMP, bo 1,21 mg/ml FADP und 0,82 mg/ml FATP enthalten
Beispiel 3
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter sd. ATCC 21085 als Anzuchtstamm an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird. In der Kulturbrühe sind dann 0,71 mg/ml FAMP, 1,61 mg/ml FADP und 1,32 mg/ml FATP enthalten.
Beispiel 4
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, daß Corynebacterium sp. ATCC 21084 als Anzuchtstamm an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird. In der Kulturbrühe sind dann 1,1 mg/ml FAMP, 0,82 mg/ml FADP und 0,90 mg/ml FATP enthalten.
Beispiel 5
Die Fermentation wild in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Micrococcus sodonensis ATCC 15932 als Anzuchtstamm an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet wird. In der Kulturbrühe sind dann UO mg/ml FAMP, 0,73 mg/ml FADP und 0,53 mg/m! FATP enthalten.
Beispiel 6
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, daß 2-Methyladenin an Stelle von 2-Fluoradenin eingesetzt wird. In der Kulturbrühe sind dann 1,20 mg/ml 2-Methyladenin-9-/?-D-ribofuranosid-5'-monophosphat (nachstehend als MAMP bezeichnet), 1,10 mg/ml 2-Methyladenin-9-/3-D-ribofuranosid-5'-diphosphat (nachstehend als MADP bezeichnet) und 1,80 mg/ml 2-Methyladenin-9-/?-D-ribofuranosid-5'-triphosphat (nachstehend als MATP bezeichnet) enthalten.
1 Liter der Kulturbrühe wird nach Abtrennen der Zellen des Mikroorganismus über einen stark basischen Anionenaustauscher vom Styroltyp in der Ameisensäure-Form gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen aufgetrennt. Jede der so erhaltenen Fraktionen wird zur Isolierung der 2-Methyladeninribonucleotide zur Trockene eingedampft. Es werden 360 mg MAMP, 330 g MADP und 540 mg MATP erhalten.
Beispiel 7
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 2-Methyladenosin an Stelle von 2-Methyladenin eingesetzt wird. In der Kulturbrühe sind dann 0,58 mg/ml MAMP, 1,10 mg/ml MADP und 0,60 mg/ml MATP enthalten.
Beispiel 8
Die Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter citreus ATCC 11624 und Micrococcus sodonensis ATCC 15932 als Anzuchtstämme an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 eingesetzt werden. Die in der Kulturbrühe enthaltenen Mengen an 2-Methyladeninribonucleotiden sind in der Tabelle zusammengestellt.
Tabelle
Stamm
2-Methyladeninribonucleotide, mg/ml
MAMP MADP MATP
Corynebacterium sp.
ATCC 21084 Arthrobacier citreus ATCC 11624
Micrococcus sodonensis ATCC 15932
0,60 1,14 1,32 1,20 0,87 1,64 1,13 0,68 0,72
Aus den Beispielen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von in 2-Stellung substituierten Purinribonucleotiden auf wirtschaftliche Weise und in großem Maßstab ermöglicht

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von in 2-Stellung substituierten Adeninnucleotiden der allgemeinen Formel I
Ribonucleosid in Mengen von 0,5 bis 10 mg/ml Niihrmedium einsetzt
DE19712153588 1971-10-27 1971-10-27 Verfahren zur biotechnischen Herstellung von in 2-SteUung substituierten Adeninnueleotiden Expired DE2153588C3 (de)

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