DE2154256A1 - Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat

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DE2154256A1 DE19712154256 DE2154256A DE2154256A1 DE 2154256 A1 DE2154256 A1 DE 2154256A1 DE 19712154256 DE19712154256 DE 19712154256 DE 2154256 A DE2154256 A DE 2154256A DE 2154256 A1 DE2154256 A1 DE 2154256A1
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Description

Andrejewski, Honke & Gesthuysen Patentanwälte Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-lng. Manfred Honke Diplom-Ingenieur Hans Dieter Gesthuysen Anwaltsakte: 37
-th
4300 Essen, den Theaferplatz 3
29.IO.I97I
Patentanmeldung
KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI No. 6-1, 1-ehome, Ohte-machi, Chiyoda-ku, Tokyo-to, Japan
Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat.
Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat bekannt, wobei einmal Mikroorganismen, beispielsweise eine Bakterienart wie Escherichia coli usw., in einem Medium gezüchtet werden, welches eine geringe Menge an Glukose enthält. Bei einem anderen bekannten Verfahren wird zunächst reine Adenylcyclase hergestellt und aus dieser in einem zellfreien Reaktionssystern zyklisches Adenosinmonophosphat aus Adenosintriphosphat erzeugt. Derartige Verfahren sind wohl laboratoriumsmäßig durchführbar, jedoch für die industrielle Ausnutzung unbrauchbar, da
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die Ausbeute an zyklischem Adenosinmonophosphat äußerst gering ist und sich beim letztgenannten Verfahren Schwierigkeiten in der Reinigung von Adenylcyclase ergeben.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu schaffen, mittels welchem ohne vorhergehende Reinigung von Adenylcyclase eine industriell vertretbare hohe Ausbeute an zyklischem Adenosinmonophosphat (nachstehend bezeichnet als cyc-AMP) erzeugbar ist.
Die Erfindung geht dabei aus von der Peststellung, daß das Umwandlungsverhältnis und damit die Ausbeute bedeutend verbessert werden kann, wenn ein Chelat-Wirkstoff zugesetzt wird, wobei cyc-AMP in großer Menge aufgefangen werden kann, wenn die Reaktion von Mikrobenstoffen als Enzymquelle mit einem Adenosinphosphat, wie beispielsweise Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinminophosphat usw. in Gegenwart von wenigstens einem Chelat-Wirkstoff durchgeführt wird.
Gekennzeichnet ist das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen dadurch, daß aus einem in einem Nährmedium eine Adenylcyclase-Aktivität entwickelnden Mikroorganismus ein Adenylcyclasesubstrat gezüchtet wird und dieses in Gegenwart eines Chelat-Wirkstoffes mit einem Adenosinphosphat zur Reaktion gebracht wird.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können alle Mikroorganismen verwendet werden, welche eine Adenylcyclase-Aktivität besitzen. Als derartige Mikroorganismen eignen sich beispielsweise
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besonders gut Escherichia coll (ATCC 8759), Escherlchia coil K-12 (ATCC IO798), Brevibakterium llquefaolens (ATCC 14929), Brevibakterium ammoniagenes (ATCC 6872) usw. Bei all diesen Mikroorganismen handelt es sich um frei verkäufliches Material, welches von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA hergestellt und vertrieben wird.
Verwendbar sind ferner alle natürlichen und synthetischen Medien, welche geeignete Mengen einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und verschiedene andere, zur Zucht der Mikroorganismen erforderliche Nährstoffe enthalten, sodaß eine spezielle Einschränkung bezüglich der Bestandteile dieser Medien nicht erforderlich erscheint.
Zur Zucht der Mikroorganismen können alle assimilierbaren Kohlenstoffquellen verwendet werden. Als Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind zu nennen verschiedene Kohlenstoffhydrate wie Glukose, Fruktose, Sukrose, Maltose, Manose, Glyzerol, Stärke, Stärkehydrolisat, Melasse usw., ferner Polyalkohole, verschiedene organische Säuren wie Pyruvinsäure, Fumarinsäure, Milchsäure, Essigsäure usw., außerdem Kohlenwasserstoffe und Alkohole.
Als Stickstoffquellen lassen sich verwenden Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumkarbonat, Ammoniumazetat usw., Stickstoffbildonde organische Stoffe wie Pepton, Fleischextrakt, Hährhefe, Getreidemaische usw.
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Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz
Als anorganische Substanzen können weiterhin verschiedene Metallione, beispielsweise Phosphate wie Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, sowie Sulfate wie Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensulfat usw. verwendet werden.
Die Züchtung wird unter aerobischen Bedingungen durchgeführt, und zwar beispielsweise unter Schütteln, Unterwasserkultur mit ■} Rühren und Belüften usw. bei einer Temperatur von vorzugsweise 20-40°C. Der pH-Wert des Mediums während der Züchtung wird vorzugsweise etwa neutral gehalten, um Mikrobenzellen mit einer hohen Adenylcvclase-Aktivität zu erhalten. Allerdings sind diese Temperatur- und pH-Bedingungen nicht ausschlaggebend. Die Züchtzeit liegt vorzugsweise zwischen 8 und 90 Std.
Adenylcyclase wird in den auf diese Weise gezüchteten Zellen erzeugt. Der pH-Wert der Zuchtbrühe wird auf 5-7 eingestellt, um Zellen anzuhäufen, welche dann in Wasser suspendiert werden. Dieser Suspension wird wenigstens ein Phosphat der Gruppe Adenosintriphosphat (nachstehend als ATP bezeichnet), Adenosindiphosphat (nachstehend als ADP bezeichnet) und Adenosinmono- W phosphat (nachstehend als AMP bezeichnet) als Substrat und wenigstens ein Chelat-Wirkstoff zugesetzt. Es können verschiedene herkömmliche Chelat-Wirkstoffe verwendet werden, wie beispielsweise Äthylendiamintetraessigsäure (nachstehend als EDTA bezeichnet), Cyklohexandiamintetraessigsäure (nachstehend als Cy DTA bezeichnet) Nitriltriessigsäure (nachstehend als NTA bezeichnet), Hydroxyäthyläthylendiamintriessigsäure (nachstehend als EDTA-OH bezeichnet). Im allgemeinen sind alle Chelat-Wirkstoff e brauchbar, welche ein Chelat mit Magnesiumionen (Mg )
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bilden können, wobei dieses einer Reaktionslösung augesetzt wird, um eine abschließende Konzentration von 2-30 mM zu erreichen.
Die Reaktion wird bei einem pH von 4,0-8,0 (vorzugsweise 6,0-7,5) und bei einer Temperatur von 35-45 C (vorzugsweise
430C) während einer Zeitdauer von 1-24 Std. durchgeführt. Im allgemeinen werden etwa 1-10 mg/ml, vorzugsweise 3-7 mg/ml an Adenosinphosphat ausgehend von der Suspension der Mikrobenzellen verwendet.
Nach Abschluß der Reaktion wird das zyklische Adenosinmonophosphat (cyc-AMp) von der Reaktionslösung durch kombinierte Verwendung eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes und eines stark basischen Ionenaustauscherharzes isoliert. Allerdings lassen sich zur Isolierung des cyc-AMP auch andere Maßnahmen flurchfuhren.
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung mögen nachstehende Beispiele dienen:
Deisr)iel
Escherichia coil K-12 (ATCC IO798) wird unter Rühren (300 U/m) in einem Medium gezüchtet, welches Glukose (3>»), Nährhefe (0,6$), Kalimonophorsphat (0,85$), JCagidiphosphat (1,1$) und Magnesiumsulfat (ü,l'/o), und ~war 8 Std. lang bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 37 C.
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Durch Zusatz einer Mineralsäure wie Salzsäure, Schwefelsäure usw. wird das pH der Zuchtbrühe auf 4 eingestellt. Bei diesem Beispiel wurde Salzsäure zugesetzt und die Zuchtbrühe zentrifugiert, um Mikrobenzellen abzutrennen, welche dann in entionisiertem Wasser in einer Konzentration von etwa 20 mg/ml (bezogen auf das Trockenzellgewicht) suspendiert wurden.
Dieser Suspension wurde ATP bei einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt. Die Suspension wurde dann in mehrere Teilmengen aufgeteilt, denen verschiedene Chelat-Wirkstoffe der nachstehenden Tabelle zugesetzt wurden, sodaß sich eine Endkonzentration von 10 mM an Chelat-Wirkstoff ergab. Einzelne Teilmengen wurden dann bei einem pH von 7,0 und einer Temperatur von 40°C 3 Std. lang zur Reaktion gebracht und es ergaben sich die in nachstehender Tabelle 1 angegebenen Mengen an zyklischem Adenosinm onophosphat.
Tabelle 1 Ausbeute an zykL.Adenosin-
Chelat-Wirkstoff monophosphat (eye-AMP)
0,13 mg/ml
ohne 2,35
EDTA 1,85
Cy DTA 1,75
EDTA-OH 0,70
NTA
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Andrejewski, Honke & Oesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3 Beispiel 2:
Escherichia coil K-12 (ATCC IO798) wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet und die erhaltenen Zellen in entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von etwa 20 mg/ml (berechnet als TrockenzellengewiGht) suspendiert. Diese Suspension wurde wiederum in Teilmengen unterteilt. Diesen Teilmengen wurden verschiedene in nachstehender Tabelle angegebene Substrate bei einer Konzentration von 5 mg/ml (berechnet auf die Suspension) zugesetzt, woraufhin jeder Teilmenge EDTA zugesetzt wurde, sodaß sich eine Endkonzentration von .10 mM ergab. Mit allen Teilmengen wurde dann bei einem pH von 7*0 und einer Temperatur von 40°C 3 Std. lang die Reaktion durchgeführt. Zur Kontrolle wurde anschließend die Reaktion mit den gleichen Teilmengen, jedoch ohne Zusatz EDTA durchgeführt, wobei sich die in nachstehender Tabelle 2 angegebenen Resultate ergaben.
Tabelle 2 ohne Zusatz von EDTA
Substrate Ausbeute an eye-AMP 0,11 mg/ml
0,10
0,12
mit Zusatz von EDTA
ATP
ADP
AMP		 2,40 mg/ml
1,29
1,20
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Beispiel J)ι
Escherichia coli K-12 (ATCC IO798) wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet und die so erhaltenen Zellen in entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von etwa 20 mg/ml (bezogen auf das Trockenzellgewicht) suspendiert. Dieser Suspension wurde ATP bei einer Konzentration von 5 mg/ml und sodann Cy DTA zugesetzt, sodaß sich eine Endkonzentration von 5 raM ergab. Die Reaktion wurde bei einem pH von 6,5 und einer Temperatur von 1IO C 6 Std. lang durchgeführt und es ergab sich eine Ausbeute von 2,4 mg/ml an cyc-AMP in der ReaktionsflUssigkeit. Als Kontrolle wurde die gleiche Reaktionsbehandlung durchgeführt, wobei jedoch der Suspension kein Cy DTA zugesetzt worden war. Es ergab sich hier lediglich eine Ausbeute von 0,09 mg/ml an cyc-AMP.
Beispiel 4:
Escherichia coli K-12 (ATCC 10 798) wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet und die so erhaltenen Zellen in entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von etwa 20 mg/ml (berechnet als Trockenzellgewicht) suspendiert. Dieser Suspension wurde AMP bei einer Konzentration von 5 mg/ml und alsdann NTA zur Erzielung einer Konzentration von 2 mM zugesetzt. Die Reaktion wurde dann bei einem pH von 6,5 und einer Temperatur von 40 C 6 3td. lang durchgeführt und es ergab sich eine Ausbeute von 0,80 mg/ml an cyc-AMP in der Reaktionslösung. Als Kontrolle wurde die gleiche Behandlung durchgeführt, ohne daß
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der Suspension NTA zugesetzt worden war. Die Ausbeute an cyc-AMP betrug in diesem Fall lediglich 0,02 mg/ml.
Beispiel 5?
Brevibacteriura liquefaciens (ATCC 14929) wurde unter Rühren (500 U/m) in einem Medium bei einem pH von 6,8 und einer Tempe- { ratur von 27°C 88 Std. lang gezüchtet, welches DL-Alanin (2%), L-Glutaminsäure (1$), Magnesiumsulfat (0,10$), Kalimonophosphat (0,85$) und Kalidiphosphat (1,1$) enthielt. Die Zuchtbrühe wurde auf ein pH von h mittels einer Mineralsäure wie Schwefelsäure, Salzsäure oder dergl. eingestellt und zur Abtrennung der Mikrobenzellen zentrifugiert. Diese Zellen wurden in entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von etwa 20 mg/ml (berechnet als Trockenzellgewicht) suspendiert. Dieser Suspension wurde ATP bei einer Konzentration von 5 mg/ml und alsdann EDTA zur Erzielung einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Die Reaktion wurde bei einem pH von 6,5 und einer Temperatur von 40 C 6 Std. lang durchgeführt, wobei sich eine Ausbeute von 0,18 rag/ml an , cyc-ΛΜΓ in der Reaktionslösung ergab. Als Kontrolle wurde die gleiche Reaktion durchgeführt, wobei jedoch EDTA fortgelassen wurde, wobei sich eine Ausbeute von lediglich 0,01 mg/ml an cyc-AMP ergab.
Ansprüche:
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Claims (1)

  1. Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
    Ansprüche .
    Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß euS einem in einem Nährmedium eine Adenylcycläse-Aktivität entwickelnden Mikroorganismus ein Adenylcyelasesubstrat gezüchtet und dieses in Gegenwart eines Chelat-Wirkstoffes mit einem Adenosinphosphat zur Reaktion gebracht wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein solcher der Gruppe Brevibacterium und Escherichia verwendet wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium liquefaciens (ATCC 1^929) verwendet wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 6872) verwendet wird.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Escherichia coil (ATCC IO798 oder ATCC 8739) verwendet wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Chelat-Wirkstoff verwendet wird, mittels welchem ein Chelat mit Mg-ionen (Mg ) erzeugbar ist.
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    Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
    7. '/erfahren na ;h Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung aerobiseh bei einer Temperatur zwischen 20 und HO C und einem neutralen pH-Wert durchgeführt wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung 8 bis 90 h durchgeführt wird.
    9. Verfahren na<~>h Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei eir. nn pH zwischen 4,0 und 8,0 sowie bei einer ^ Temperatur zwischen 35 und 45°C durchgeführt wird.
    10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion 1 bis 2Ά h lang durchgeführt wird.
    11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Adenosinphosphat ein Phosphat der Gruppe Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat verwendet wird.
    12. Vorfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelat-Wirkstoff ein Werkstoff der Gruppe Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure, Nitriltriessig- a säure und Hydrox.yäthyläthylendiamintriessigsäure verwendet wird.
    13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenylcyclase-Substrat eine Zellsuspension ist.
    Ik. Vorfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinrnonophosphat, da-iuroh gekennzeichnet, daß aus einem Mikroorganismus mit Adenylu, . laso-Aktivität der Art Drevibacterium oder Escheri-
    209823/1 ISO 8AD
    Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen, Theaterplatz 3
    chia in einem Nährraedium ein Adenylcyclase-Substrat gezüchetet wird und dieses Substrat dann mit einem Adenosinphosphat in Gegenwart von 2-30 mM eines zur Bildung eines Chelats mit Magnesiumionen (Mg ) geeigneten Chelat-Wirkstoffes zur Reaktion gebracht wird.
    15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelat-Wirkstoff ein Wirkstoff der Gruppe Äthylendiamin-
    W tetraessigsäure, CycloheKandiamintetraessigsäure, Nitriltriessigsäure und Hydroxyäthyläthylendiamintriessigsäure verwendet wird.
    16. Verfahren zur Herstellung von zyklischem Adenosinmonophosphat, dadurch gekennzeichnet, daß aus einem Mikroorganismus der Gruppe Brevibacterium liquefaciens ATCC 14929, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Escherichia coil ATCC I0798 und Escherichia coli ATCC 8739 in einem Nährmedium, welches C-Quellen und N-Quellen enthäl.t, bei einer Temperatur von 20-4O0C und einem neutralen pH-Wert unter aerobischen Bedingungen 8-9O h eine Fermentierungsflüssigkeit gezüchtet wird und aus dieser Zellkörper abgetrennt werden, aus denen eine Zellsuspension als Adenylcyclase-Substrat gebildet wird, welches bei einer Temperatur von 35-^5 C und einem pH von 4,0-8,0 während einer Zeitdauer von 1-24 h mit einem Adenosinphosphat in Gegenwart von wenigstens einem Chelat-Wirkstoffzur Reaktion gebracht wird, wobei ein Adenosinphosphat der Gruppe Adenosinphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat sowie wenigstens ein Chelat-Wirkstoff der Gruppe ethylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure, Kitriltriessigsäure und Hydroxyäthyläthylendiamintriessigsäure verwendet wird.
    Patentanwalt.
    209823/1150
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