DE1915854C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Imidazol-Glycerin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotech- wenigstens einer der folgenden Verbindungen zuzu-

nischen Herstellung von Imidezol-Glycerin durch setzen; Biotin, Thiamin,/3-Alanin, Nikotinsäure, Deri-

aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem vate der Nikotinsäure, Hypoxanthin, Adenin, Guanin,

Histidin enthaltenden Nährmedium bei einem pH- Xanthin und andere den Nukleinsäuren verwandte

Wert von etwa 6,0 bis 8,5 und bei einer Temperatur 5 Stoffe und ihre Derivate,

von etwa 23 bis 40⁰C. Der erfindungsgemäße Stamm wird aerob unter

Imidazol-Glycerin ist eine der Komponenten der Schütteln oder Belüftung bei einem pH von etwa^.O Imidazol-GIycerin-Phosphorsäure, welche eine Vor- bis 8,5 gezüchtet. Die Züchtung wird bei 23 bis 40° C, stufe für die Biosynthese von Histidin, eine der unent- vorzugsweise bei 26 bis 35° C durchgeführt. Ein gebehrlichen Aminosäuren ist; ferner ist es als Roh- ίο eignetes Neutralisierungsmittel, wie z. B. Ammoniak, material für Histidin und Nitroimidazol-Verbindungen Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumhydronützlich. xyd u. dgl., kann dem Medium zugesetzt werden, und

Bei einem bekannten Verfahren zur Herstellung von es ist auch möglich, das pH des Mediums zu kontrol-

imidazöl-Glycerin setzt man Mutanten-Stämme vom Heren und durch Zusatz von Ammoniak in Form von

Mikroorganismus des Genus Neurospora oder Peni- 15 Harnstoff das gewünschte pH einzustellei·. Die Züch-

cillium ein (J. Amer. Chem. Soc. 75 [1953], 1015). Es tung wird so lange fortgesetzt, bis eine ausreichende

wurde nur eine kleine Menge an Imidazol-Glycerin Menge an Imidazol-Glycerin im Medium angesammelt

gefunden unter verschiedenen anderen angesammelten ist. Die Zeit hierzu beträgt etwa 3 bis 7 Tage. Nach

Substanzen, wie Imidazol-Acetol, Histidinol u. dgl. Vollendung der Züchtung enthält das Medium oftmals

Zur kommerziellen Gewinnung von Imidazol-Glycerin ao 1 bis 3 Typen von Nebenprodukt-Verbindungen des

ist dieses Verfahren daher ungeeignet. Imidazols. Aber die Mengen dieser Nebenprodukte

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- sind im allgemeinen nicht größer als ^l/io der Menge

fahren zur Gewinnung von Imidazol-Glycerin an- des angesammelten Imidazol-Glycerins, und es ist auch

zugeben, mit welchem diese Substanz in großer Aus- möglich, das Imidazol-Glycerin selektiv und genügend

beute angesammelt werden kann. 35 anzuhäufen, z. B. durch Erhöhung der Konzen-

Ausgehend von der biotechnischen Herstellung von tration der in dem Medium enthaltenen Phosphor-

Imidazol-Glycerin durch aerobes Züchten von Mikro- säure.

Organismen in einem Histidin enthaltenden Nähr- Verschiedene bekannte Methoden zum Konzenmedium bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 und bei trieren und Reinigen des Imidazol-Glycerins können einer Temperatur von 23 bis 40⁰C besteht die Lösung 30 angewendet werden, z. B. durch die Abtrennung des dieser Aufgabe erfindungsgemäß darin, daß man Imidazol-Glycerins als unlösliches Salz (ζ. Β. Queckais Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes silbersalz), durch eine Reinigungsextraktion oder ATCC 21 225 oder Corynebacterium glutamicum durch die Verwendung eines Ionenaustauscherharzes ATCC 21 224 einsetzt und das Nährmedium einen oder durch Kombinationen hiervon:
Gehalt von mehr als 0,05 Mol Phosphorsäure-Ion 35 Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, pro Liter enthält. . I₁

Die angegebenen Mikroorganismen sind der Öffent- Beispiel

lichkeit frei zugänglich und ohne Einschränkung von Zur Herstellung einer Saatkultur von Brevibacte-

der American Type Culture Collection erhältlich. rium ammoniagenes ATCC 21 225 wurde ein Medium

Bevorzugte Kohlenstoff-Quellen für das Züchtungs- 40 der nachfolgenden Zusammensetzung (pH = 7,2) mit medium sind z. B. Glukose, Fruktose, Galaktose, diesem Stamm beimpft und 24 Stunden gezüchtet.
Saccharose, Maltose, Mycose (Trehalose), Cellobiose, Je 20 ml des Produktionsmediums der nachfolgen-Arabinose u. dgl. Bevorzugte Stickstoff-Quellen sind den Zusammensetzung wurden in je einen Sakaguchiz. B. Ammoniak, Harnstoff, Ammonsulfat, Ammon- Kolben (Fassungsvermögen 500 ml) gegeben und chlorid, Ammonacetat, Ammoncitrat und verschiedene 45 sterilisiert. Danach wurde jedes dieser Produktionsandere organische oder anorganische, Stickstoff ent- medien mit der Saatkultur (1 ml) beimpft, und die haltende Verbindungen. Bevorzugte anorganische Züchtung wurde in 5 Tagen bei 28°C ausgeführt. Auf Materialien sind verschiedene Salze des Natriums, diese Weise wurden in dem Medium der Kolben Kaliums, Mangans, Magnesiums, Calciums, Kobalts, durchschnittlich 6,8 mg Imidazol-Glycerin/ml erhalten. Nickels, Kupfers, der Chlorwasserstoffsaure, der 50 ..
Phosphorsäure u. dgl. Um die Ansammlung anderer Zusammensetzung des Saatmediums:
Imidazol-Verbindungen zu verhindern, wird dem Glukose 5 g/dl, KH₁PO₄ 0,1 g/dl, K₁HPO₄ 0,1 g/dl, Medium ein geeignetes Phosphat in einer Menge von MgSO₄ · 7 H₁O 0,05 g/dl, ZnSO₄ · 7 H₁O 0,001 g/dl, mehr als 0,05 Mol (berechnet als Phosphorsäure-lon) FeSO₄ · 7 H₁O 0,001 g/dl, Mn SO₄ · H₁O 0,0004 g/dl, pro Liter zugesetzt. Beispiele sind Kaliumhydrogen- si Biotin 30 y/l, ^-Alanin 0,0005 g/dl, Thiamin-HCl phosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Natrfumdihy 0,0005 g/dl, Pepton 2 g/dl, Fleischextrakt 1 g/dl, Harn· drcgenphosphat, Ammondihydrogenphosphat u. dgl. stoff 0,3 g/dl, HittidhvHCl 0,0001 g/dl und Natrium·

Die erflndungagemäß zum Einsatz kommenden Succinat · 6 H₁O 0,3 g/dl.

haltendes Material können verschiedene organische Glukose 12 g/dl, (NH₄),SO₄ 2 g/dl, Harnstoff 0,3 g/

Substanzen, wie Maisquellwasser, Pepton, Fleisch· dl, KH₁PO₄ 2 g/dl, Na₁HPO₄ · 12 H₁O 2 g/dl, MgSO₄ ·

._ »^ M . _*._ · 1 it.. a ·._... t* · _ L . _ l_ _l_ m ** S* Λ ^t ti Λ * I „(„Λ IMAI -IJI # /*...»*! ,» Λ= ΑΛΛ _fj|

extrakt, Soyabohnenmehlhydrolysat, Kaeeinhydroly- 7 H₁O 2 g/dl, /!«Alanin 0,0005 g/dl, L-Cystin 0,002 g/dl,

sat, ein Hydrolysat von mikrobiellen Zellen, Hefe· Nikotinsiureamid 0,0005 g/dl, FeSO₄ · 7 H₁0.0,001 g/

extrakt u, dgl., verwendet werden, und zwar in einer es dl, ZnSO₄ · 7 H₁O 0,001 g/dl, MnSO₄ · 4 H₁O 0,0004g/

Meng« von vorzugsweise 50 bis 3000 y/ml des Me· dl, Biotin 30 y/l, Thiamln-HCl 0,0005 g/dl, L-HiStIdIn-

diums, berechnet als Histidin. Außerdem ist auch vor· HCl 0,1 g/dl, Fleischextrakt 0,2 g/dl und CaCO,

zuziehen, dem Medium eine nachweisbare Menge 2 g/dl.

i 915

Nach Vollendung der Züchtung wurde das Fermeniationsmedium gesammelt und zu 11 vereinigt. Zwecks Entfernung der Zellen wurden die vereinigten Fermentationsmedien zentrifugiert. Danach wurde der Fermentationsflüssigkeit zur Einstellung auf ein pH von 8,5 eine gesättigte Bariumhydroxydlösung zugesetzt, und diese wurde über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Dem Filtrat wurde eine 25°/_oige Quecksilberchlorid-Äthanollösung zugefügt, um ausgefälltes Imidazol-Glycerin (Quecksilbersalz) zu erhalten, welches durch Filtration abgetrennt und bei Umgebungstemperatur im Vakuum getrocknet wurde. Dem getrockneten Material setzte man 0,5 η-Salzsäure zu, um das Imidazol-Glycerin zu lösen. Nach dem Abfiltrieren der Niederschläge wurde das anfallende Filtrat im Vakuum auf etwa 50 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde durch eine Harzkolonne geschickt, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in seiner freien Form gepackt war. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und mit ao 1,5 η-Salzsäure eluiert. Die Imidazol-Glycerin enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt und konzentriert. Nach dem Auskristallisieren erhielt man Rohkristalle von Imidazol-Glycerin (5,8 g).

35 Beispiel 2

Auf ähnliche Weise ρ wie im Beispiel 1 beschrieben wurde eine SaalLultur bereitet, nur mit dem Unterschied, daß Corynebactermm glufmicum ATCC 21224 an Stelle des im Beispiel 1 aufgeführten Stammes ver- 3c wendet wurde.

Die Zusammensetzung des Produktionsmediums war folgende:

Glukose 12 g/dl, Harnstoff 0,9 g/dl, Fleischextrakt 2,5 g/dl, 0-Alanin 0,0005 g/dl, Thiamin-HCl 0,0005 g/dl, L-Cystin 0,002 g/dl, FeSO₄ · 7 H₁O 0,001 g/dl, ZnSO₁ · 7 H₂O 0,001 g/dl, MnSO₁ · 4 H₄O 0,0004 g/dl, Biolin 30y/l, Hypoxanthin 0,0005 g/dl, KH..PO, 2 g/dl, Na₁₁HPO₄ · 12 H₂O 2 g/dl und MgSO₁ · Ί H₂O 2 g/dl.

Je 20 ml des Produktionsmediums wurden in je einen Sakaguchi-Kolben (Fassungsvermögen 500 ml) gegossen und sterilisiert (der Harnstoff war getrennt sterilisiert und zugefügt). Nach dem Sterilisieren wurde jeder Kolben mit der Saatkultur (1 ml) beimpft. Die Züchtung wurde 6 Tage lang unter Schütteln bei 28° C ausgeführt. Das Fermentationsmediurn enthielt 8,3 mg Imidazol-Glycerin/ml.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !midazol-Glycerin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Histidin enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 und bei einer Temperatur von etwa 23 bis 40⁰C, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 225 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21 224 einsetzt und das Nähr-1 medium einen Gehalt von mehr als 0,05 Mol Phosphorsäure-Ion pro Liter enthält.