DE1417582C

DE1417582C - Verfahren zur fermentation Inosin produktion

Info

Publication number: DE1417582C
Application number: DE19601417582
Authority: DE
Inventors: Shinichi Tokio Tsunoda Toshinao Zushi Apki Ryohei Tokio Okumura Shinji Yokohama Kondo Yasu hjro Kawasaki Muramatsu Nobutoshi Momose Haruo Tamagawa Joshio Tokio Motozaki
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1959-10-19
Filing date: 1960-10-19
Publication date: 1973-07-05

Description

Es ist bereits bekannt, Inosin aus tierischen Körpern und Mikroorganismenzellen, in denen es in freier oder gebundener Form vorliegt, zu isolieren.

Aus der deutschen Patentschrift 819 084 ist es bereits bekannt, daß man die Zusammensetzung der üblicherweise in den Hefen enthaltenen Nucleinsäuren verändern und deren Gehalt in bezug auf das Purin, Adenin oder Guanin, erhöhen kann, wenn man die Hefen in einem Nährmedium züchtet, das als Stickstofflieferant außer Ammoniumsalz oder Aminosäuren entweder bestimmte Substanzen, wie Adenin enthält, oder dem ein Hemmstoff, z. B. Natriumazid, zugesetzt wird. Jedoch, aus den so erhaltenen Nucleinsäuren muß dann das Purin Adenin isoliert, über die Nitritreaktion in das Hypoxanthin übergeführt und schließlich mit 1,2,3,5-Tetraacetylribose kondensiert werden. Beide Reaktionen sind kompliziert. .

Die Erfindung betrifft dagegen ein im großtechnischen Maßstab durchführbares Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Inosin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bacillus subtilis ATCC 13 952, -13 953, -13954, -13 955 oder -13 956 in einem üblichen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium, das gleichzeitig als essentielle Nährstoffe für diese Mikroorganismen Adenin oder dessen Analoga sowie Aminosäuren, insbesondere Histidin und Asparaginsäure, aufweist, bei aeroben Bedingungen, wobei man den pH-Wert des Kulturmediums bei 4 bis 9 und die Temperatur während der Gärung bei 25 bis 40⁰C hält, züchtet, daß man nach Abtrennung der Mikroorganismenzellen von dem Fermentationsmedium die Inosin enthaltende Lösung in hierfür üblicher Weise mit Ionenaustauscherharzen oder Aktiykohle konzentriert und daß man das Inosin aus der eingeengten Lösung durch Zusatz eines hydrophilen und Inosin nicht lösenden Lösungsmittels ausfällt. ' ■ Bei den gemäß Erfindung eingesetzten Bacillus subtilis-Stämmen handelt es sich um Poly-auxotrophiemutanten von Bacillus subtilis, von denen Stamm ATCC 13 954 einen Adenin- und Histidin-, ATCC 13 955 einen Adenin-, Histidin- und Asparaginsäurebedarf und die Stämme der ATCC-Nummern 13 956,13 953 und 13 952 einen Bedarf an Adenin und Aminosäuren haben. Diese Substanzen müssen daher im Kulturmedium neben den Lieferanten für Kohlenstoff und Stickstoff sowie neben den anorganischen Salzen vorliegen.

Als Adenin oder dessen Analoga sowie Aminosäuren liefernde natürliche Substanzen werden trockene Hefe, Hefeextrakt, Preßhefe, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Polypepton, Maisquellwasser und Natriumribonucleat verwendet.

Als Kohlenstofflieferanten können alle Substanzen, die von den Mikroorganismen gemäß Erfindung verwertet werden können, allein oder in Mischung verwendet werden.

Die Beziehung zwischen den verscheidenen Kohlenstofflieferanten und der Inosinbildung wird in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 1

Kohlenstofflieferant

Glucose

Fructose

Mannose

Galactose

Xylose

Arabinose ......

Saccharose

Stärkehydrolysat
lösliche Stärke ..

Melassen

Glycerin

Sorbit

Mannit

Äthylenglycol...

Angereicherte Menge von Inosin (g/100 ecm)

ATCC 13 954

■0,52 0,49 0,33 0,15 0,19 0,22 0,54 0,59 0,33 0,23 0,34 .0,03 0,30 0,05

ATCC 13 955

0,47 0,34 0,34 0,09 0,27 0,28 0,20 0,48 0,29 0,25 0,33 0,04 0,32 0,04

Zur Durchführung der Versuche wurde ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung benutzt, wobei der Kohlenstofflieferant in der angegebenen Menge durch die speziellen Kohlenstofflieferanten der Tabelle 1 ersetzt wurde.

Kulturmedium

Kohlenstofflieferant 10 g/100 ecm

Ammoniumchlorid .......... 2,0 g/100 ecm

trockene Hefe 1,4 g/100 ecm

Lösung von Aminosäuren, Mischung hergestellt durch Säurehydrolyse von Sojabohnenmehl (Gesamtstickstoff 2,4 g/ 100 ecm) 0,4 g/100 ecm

KH₂PO₄ 0,8 g/100 ecm

MgSO₄-7H₂O .· 0,04 g/100 ecm

Fe-Ion 2 Teile/Million

Mn-Ion 2 Teile/Million

pH 7,0

CaCO₃ ^Og/lOOccm

. (getrennt
sterilisiert) Die Beziehung zwischen den Stickstofflieferanten und der Inosinproduktivität ist in Tabelle 3 gezeigt. Die Stickstofflieferanten können allein oder in Mischung verwendet werden. '

Tabelle 3

Die Kultur
schüttelt.

wurde 3 Tage lang bei 30° C ge- ίο

Tabelle 2

Inosinbildung aus Pentosen

	Zusatz zum	Medium	Mais- einweich- Wässer	Angereicherte Menge von Inosin	ATCC 13 953
	(ccm/100 ecm)		(g/l 00 ecm).
	Lösung von
Saccharide	Aminosäure
	mischungen, hergestellt durch Säure	0	ATCC 13 952	0,33
	hydrolyse	0,2		0,37
	von Soja	0		0,22
	bohnenmehl	0,2		0,26
Xylose	1,2	0,29
Xylose	1,2	0,28
Arabinose ..	. 0,4	0,28
Arabinose ..	0,4	0,31

Das benutzte Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung :

Kohlenstofflieferant .. 10 g/100 ecm

KH₂PO₄ 0,8 g/100 ecm

MgSO₄- 7H₂O 0,04 g/100 ecm

Fe-Ion 2 Teile/Million

Mn-Ion 2 Teile/Million

Ammoniumchlorid 2 g/100 ecm

trockene Hefe 1,4 g/100 ecm

pH .....· 7,0

CaCO₃ ,···.··· 2 g/100 ecm

(getrennt
. sterilisiert)

Die Kultur wurde 3 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt.

Als Stickstofflieferanten können anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoffe, Nitrate, Ammoniak usw. verwendet werden. Man kann dem Medium zu Beginn der Kultivierung die Gesamtmenge des Stickstofflieferanten zusetzen; man kann aber auch einen Teil des Stickstofflieferanten erst während der Kultivierung zugeben. Ammoniak wird bei Regelung des pH-Wertes während der Kultivierung zugesetzt. Die Menge der Stickstofflieferanten hängt ferner •von der Art des Stickstofflieferanten und der Art und Konzentration des Kohlenstofflieferanten ab. Billigere anorganische Ammoniumsalze, wie Ämmoniumchlorid, -sulfat, -nitrat, -phosphat, Harnstoff usw., werden gewöhnlich in Mengen von etwa 0,5 g/ 100 ecm bis 2,5 g/100 ecm eingesetzt.

Stickstofflieferant
(g/100 ecm)

Ammoniumchlorid, 1,5 .....

Ammoniumnitrat, 1,5

Ammoniumsulfat, 1,5

Ammoniumphosphat, 1,5 ...

Kaliumnitrat, 1,5

Natriumnitrat, 1,5

Harnstoff, 0,75

Mischung von
Ammoniumchlorid, 0,75
und Harnstoff, 0,38 ......

Angereicherte Menge von Inosin (g/l 00 ecm)

ATCC 13954 ATCC 13955

0,46 0,46 0,49 0,39 0,18 0,12 0,43

0,53

0,29 0,38 0,38 0,38 0,41 0,36 0,37

0,59

Die Versuche wurden in einem Kulturmedium folgender Zusammensetzung durchgeführt:

30

35

40

45

Hefehydrolysat 10 g/100 ecm

Stickstofflieferant wie oben beschrieben

Hefeextrakt 1,0 g/100 ecm

Maiseinweichwasser 0,3 g/100 ecm

Caseinhydrolysat 0,1 g/100 ecm

Natriumribonucleat ..... 0,01 g/100 ecm

KH₂PO₄ 0,8 g/100 ecm

MgSO₄-7H₂O 0,04 g/100 ecm

Fe-Ionen 2 Teile/Million

Mn-Ionen ... 2 Teile/Million

pH 7,0

CaCO₃ 2 g/100 ecm

(getrennt sterilisiert)

Die Kultur wurde 3 Tage lang bei 30⁰C geschüttelt.

Tabelle 4 veranschaulicht den Einfluß der Menge

des Stickstofflieferanten auf die Inosinbildung und zeigt, daß die Inosinproduktion nicht in großem Maßstab erfolgt, wenn nicht beträchtliche Mengen Ammoniak im Medium vorliegen.

Tabelle 4

60

65

Ammoniumchlorid	Angereicherte Menge von Inosin (g/100 ecm)	ATCC 13 955
(g/100 ecm)	ATCC 13 954	0,04
0,02	0,05	0,07
0,20	0,11	0,24
0,50 '	0,32	o;33
2,00	0,42

Die Zusammensetzung des Kulturmediums, das bei den Versuchen benutzt wurde, stimmt — abgesehen von dem Stickstofdieferanten — mit dem ■ zu den Versuchen zu Tabelle 3 überein.

Um eine hohe Anreicherung und Abgabe des produzierten Inosins an das Fermentationsmedium zu erreichen, muß die Aktivität der Mikroorganismen während der Fermentation durch Zugabe spezieller Nährstoffe gesteigert werden. Die Ergebnisse der Tabelle 5 zeigen, daß von den untersuchten Nährstoffen Trockenhefe und Hefeextrakt die stärksten Wirkungen zeigen und das Inosin nur bei Zusatz optimaler Nährstoffmengen in beträchtlicher Menge produziert und angereichert wird.

Außer diesen Nährstoffen können hilfsweise Fleischextrakte, Caseinhydrolysat, Polypepton, NZ-Amin und Maiseinweichwasser zugesetzt werden, die jedoch als komplexe Substanzen verschiedene wirksame Nährstoffe enthalten.

Für die Herstellung synthetischer Medien war es daher wichtig zu wissen, welche einfachen wesentlichen Nährstoffe für das Mikroorganismenwachstum und die Inosinanreicherung wesentlich sind. Untersuchungen ergaben, daß Adenin und Aminosäure solche wesentlichen Nährstoffe sind. .

Diese Versuchsergebnisse sind in Tabellen 5 und 6 zusammengestellt.

Tabelle 5 Beziehung zwischen Nährstoffen und Inosinbildung

Nährstoff
(g/100 ecm)

kein Zusatz ,

Trockenhefe

0,01

0,10

1,80

Hefeextrakt

0,01

0,10

0,60

1,00

Fleischextrakt

0,10

1,00

Caseinhydrolysat

0,10

1,00

Angereicherte Menge von Inosin ' (g/100 ecm)

ATCC 13

0,00

0,00 0,05 0,57

0,02 0,03 0,23 0,42

0,02 0,05

0,00 0,01

ATCC 13

0,00

0,00 0,01 0,48

0,01 0,01 0,22 0,34

0,00 0,03

0,01 0,00

Tabelle 6
Beziehung zwischen Adenin und Aminosäuren und Inosinbildung

	Aminosäure	Wachstum	Angereicherte	Menge von Inosin durch Bacillussubtilis-Stämme	Wachstum	ATCC 13 955 pH	Inosin (g/100 ecm)
Adenin	zusatz	±			±	7,2	0,00
(mg/100 ecm)		±	ATCC 13 954 pH	Inosin (g/l 00 ecm)	±	7,2	0,00
0	+		7,8	0,00	±	7,2	0,00
0	+	+	7,8	0,00	+	7,0	0,02
0,15	+	*+ +*	7,5	0,00	+ + .	6,5	0,09
1,5	+	+ +	7,3	0,02	+ +	5,4	0,21
5,0	+	+ + +	5,2 .	0,17	+ + +.	5,3	0,13
15,0	+	±	5,0	0,15	±	7,0	0,03
45,0	—	5,0	0,12
15,0		7,5	0,04

Bemerkung ■■.· Aminosäuren (mg/100 ecm)

1. Bei Stamm ATCC13 954

Histidin _k

Glycin

Lysin ·

Glutaminsäure

Methionin

Cystin :

Valin

2. Bei Stamm ATCC 13 955

Histidin

Asparaginsäure

Glycin

Lysin

Phenylalanin

Tyrosin

Leucin Isoleucin

Threonin

Valin

Alanin Prolin

.10 55 Arginin

30 Obwohl derartige Kombinationen von Aminosäuren für die Inosinproduktion in großem Maßstab günstig sind, sind die essentiellen Aminosäuren für 60 das Wachstum von Stamm ATCC 13 954 Histidin und für das Wachstum von Stamm ATCC 13 955 Histidin und Asparaginsäure.

Bezüglich der zugesetzten Adeninmenge gibt es ein Optimum. Bei überschüssigem Adenin wachsen die 65 Mikroorganismen nutzlos, die Produktion und An-

.30 reicherung von Inosin wird herabgesetzt; bei unzu-

. reichender Adeninmenge ist die Inosinbildung ebenfalls reduziert.

Als Lieferanten für Adenin und Aminosäuren werden Hefeextrakte und Trockenhefe verwendet, die für die Inosinbildung günstiger sind als Adenin und Aminosäuren. Daher wird bei der industriellen Produktion Adenin, Aminosäuren oder deren Analogen oder natürliche Stoffe, die sie enthalten, wie Hefeextrakte, Trockenhefe oder Zellen anderer Mikroorganismen allein oder in Mischung, der Vorzug gegeben.

Wird nach dem Beimpfen eines Kulturmediums mit einem der Bacillus-subtilis-Stämme die Kultivierung in einem Kolben statisch, d. h. ohne Sauerstoffzufuhr, d. h. ohne Belüftung, durchgeführt, treten zwar die charakteristischen Wachstumserscheinungen auf, jedoch das Inosin reichert sich nur in Mengen an, die zu vernachlässigen sind.

Wird dagegen der Kolben, um eine wirksame Luftzufuhr zu erreichen, während der Fermentation auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, erhöht sich die produzierte Inosinmenge merklich. Es wurde festgestellt, daß ein enger Zusammenhang zwischen der Belüftung und der Produktion von Inosin besteht und daß eine ziemlich starke Belüftung für die Inosinproduktion wesentlich ist.

Die Beziehung zwischen Belüftung und Inosinproduktion wurde in Modellversuchen untersucht, wobei das Volumen des Kulturmediums im Schüttelkolben verändert wurde. ■ Das Ergebnis zeigt Tabelle 7.

Tabelle 7

Sauerstoff-Absorptions
koeffizient (kd)

7 · 1(T⁶
5,8 · 10~⁶
4,3 · 1(T⁶
3,3 · ΙΟ"⁶

Volumen des
Kulturmediums

in einem

500 ccm-Kolben

(ecm)

160

Belüftung

stark

schwach

Produzierte
Inosinmenge

(g/100 ecm)

0,65
0,66
0,59
0,16

Die Kultivierung wurde bei 30° C durchgeführt.

Wird mit einem der Bacillus subtilis-St'ämme das Glucose, Ammoniumchlorid, Hefeextrakt und anorganische Salze enthaltende Medium beimpft, dann ist auch bei aerober Kultivierung ohne pH-Regelung des Mediums die Inosinproduktion nur gering. Die Bildung und Anreicherung von Inosin verläuft nur dann glatt, wenn der pH-Wert des Kulturmediums während der Fermentation im optimalen Bereich, der bei der Produktion von Inosin zwischen 4 und 9 liegt, gehalten wird. Außerhalb dieses Bereichs wird überhaupt kein Inosin gebildet. Bei pH-Werten zwisehen 5 und 7 ist die Produktion und Anreicherung von Inosin besonders hoch. Als Neutralisationsmittel zur Regelung des pH-Wertes sind Calciumcarbonat, Ammoniak, Kaliumhydroxyd, Natriumhydroxyd oder andere Alkalien oder Säuren geeignet. .

Die Ergebnisse dieser Versuche zeigt Tabelle 8. Bei diesen Versuchen wurde dem Kulturmedium zu Beginn ein Neutralisationsmittel, z. B. Valciumcarbonat, in einer Menge von 2 g/100 ecm zugesetzt und mit gelegentlichen Zugaben von konzentrierter Phosphorsäure oder Ammoniaklösung zum Kulturmedium dessen pH-Wert so geregelt, daß er bei 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9 gehalten wurde.

Der pH-Wert wird ohne Regelung während der Kultivierung durch die Anwesenheit von Calciumcarbonat im Bereich von 6,7 bis 5,0, dem optimalen pH-Bereich für die Inosinbildung, gehalten.

Tabelle 8
Beziehung zwischen pH-Wert und Inosinproduktion

	pH	Menge an
		angereichertem
		Inosin
	2,5 bis 3,4	(g/l 00 ecm)
Durch Phosphor	3,5 bis 4,5	0,05
säure und Ammo	-4,9 bis 5,1 5,8 bis 6,2	0,12
niak geregelte pH-Bereiche	6,8 bis 7,2	0,51 0,51 -
	7,8 bis 8,2	0,55
	8,9 bis 9,1	0,13
	6,7 bis 5,0	0,17
nicht geregelte		0,49
pH-Bereiche

30

35

40 Zur Isolierung von Inosin, das sich in beträchtlichen Mengen in der Fermentationsflüssigkeit angereichert hat, trennt man die Zellen aus der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit ab, sammelt die verhältnismäßig reine, Inosin enthaltende Lösung aus der erhaltenen klaren Fermentationsflüssigkeit z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauschharz und einem Adsorbens und Einengen der erhaltenen Lösung im Vakuum, aus der man kristallines Inosin mit hydrophilen Lösungsmitteln, die wie Aceton Inosin nicht lösen, aus der konzentrierten Flüssigkeit ausfällt.

Beispiel 1
Je 3 ecm des Kulturmediums, das aus

5 g/100 ecm Glucose
0,4 g/100 ecm Ammoniumchlorid
0,4 g/100 ecm Harnstoff
0,1 g/100 ecm KH₂PO₄
0,02 g/100 ecm MgSO₄ · 7H₂O
, 2 Teile/Million Mn⁺⁺
2 Teile/Million Fe⁺⁺
0,2 g/100 ecm Caseinhydrolysat
0,2 g/100 ecm Hefeextrakt
0,2 ecm/100 ecm Maisein weich wasser
0,1 g/100 ecm Polypepton
0,1 g/100 ecm Fleischextrakt und
10 mg/100 ecm Natriumribonucleat

besteht, werden in Versuchsgläser gegossen und jedes Reagenzglas bei 115°C 10 Minuten sterilisiert; danach wird getrennt sterilisiertes Calciumcarbonat in einer Menge von 2 g/100 ecm zugesetzt. Das erhaltene Kulturmedium wird mit Zellen von Bacillus subtilis ATCC 13 956 beimpft, und unter Schütteln bei 30⁰C 20 Stunden wird die Kultivierung durchgeführt.

Die entstehenden Kulturflüssigkeiten werden als Saatkultur verwendet. Je 20 ecm des Mediums der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben beschrieben ist, werden in 500-ccm-Schüttelkolben gegossen und bei 115° C 10 Minuten sterilisiert, mit 5 Tropfen der Saatkultur versetzt und dann unter Schütteln bei 30° C 65 Stunden kultiviert; danach haben sich 0,15 g/ 100 ecm Inosin angereichert.

309 627/106

Die Inosin enthaltende Lösung, die durch Abtrennen der Zellen aus der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit gewonnen wird, wird mit Entfärbungsharzen und Anionenaustauscherharzen in üblicher Weise behandelt und dann durch Acetonzusatz die Inosinkristallisation herbeigeführt. Man erhält 1,47 g rohes kristallines Inosin aus 3,5 1 Kulturflüssigkeit, die 1 g Inosin pro Liter enthält.

Beispiel 2

Die Saatkultur von Bacillus subtilis ATCC 13 953 wird bei 37° C 20 Stunden auf einem festen Medium kultiviert, das

1 g/100 ecm Fleischextrakt

1 g/100 ecm Polypepton

0,5 g/100 ecm Natriumchlorid
0,1 g/100 ecm Hefeextrakt
0,1 g/100 ecm Caseinhydrolysat
50 mg/100 ecm Natriumbonucleat und

2 g/100 ecm Agar

in einem Roux-Kolben enthält.

Zur Herstellung des Hauptkulturmediums werden je 20 ecm des Mediums, das

10 g/100 ecm Xylose

0,8 g/100 ecm KH₂PO₄

0,04 g/100 ecm MgSO₄ · 7H₂O

2 Teile/Million Mn-Ionen

2 Teile/Million Fe-Ionen

2 g/100 ecm Ammoniumchlorid

1,4 g/100 ecm Trockenhefe
12 ccm/100 ecm einer Lösung von gemischten
Aminosäuren und

0,2 ccm/100 ecm Maiseinweichwasser

enthält, bei 110° C 10 Minuten in 500-ccm-Schüttelkolben sterilisiert, und dem Medium werden dann 2% getrennt sterilisiertes Calciumcarbonat zugesetzt. Die Fermentation wird 3 Tage unter aeroben Bedingungen bei 30⁰C durchgeführt. Auf diese Weise werden 3,5 g/l Inosin angereichert.

Nach Entfernung der Mikroorganismenzellen aus 1 1 der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit, Behandlung der Inosin enthaltenden Fraktionen mit Ionenaustauscherharz Dowex-I (Ameisensäuretyp) und mit "Aktivkohle als Adsorbens, Konzentrieren der erhaltenen Inosin !enthaltenden Fraktionen und Zusatz eines Lösungsmittels, in dem Inosin unlöslich ist, z. B. Aceton, zur erhaltenen konzentrierten Lösung erhält man 1,8 g rohes kristallines Inosin.

B e i s ρ i e 1 3

1 1 des Mediums Für die Hauptkultur wird durch Zusatz von

1,4 g/100 ecm Trockenhefe

0,4 ccm/100 ecm einer Lösung gemischter
Aminosäuren

0,8 g/100 ecm KH₂PO₄

0,04 g/100 ecm MgSO₄ ■ 7H₂O

2 Teile/Million Fe-Ionen

2 Teile/Million Mn-Ionen und

2,2 g/100 ecm Ammoniumchlorid zu

5 g/100 ecm Holzhydrolysat, das Pentose und
Hexose im Verhältnis von etwa
30:70 als reduzierende Zucker
enthält,

hergestellt. Die in der im Beispiel 2 angegebenen Weise erhaltene Saatkultur wird dem erhaltenen Medium zugesetzt und unter aeroben Bedingungen bei 30° C kultiviert. Nach 3 Tagen haben sich 3 g/l Inosin angereichert. Nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhält man 1,4 g Inosin aus der Fermentationsflüssigkeit.

Beispiel 4

Es wird nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gearbeitet mit der Ausnahme, daß gereinigte Pulpenabfallflüssigkeit (Verhältnis von Pentose zu Hexose etwa 75:25) an Stelle des Holzhydrolysats als Kohlenstoffquelle verwendet wird.

Nach 3 Tagen haben sich 2,5 g Inosin pro Liter angereichert. Daraus erhält man 1,2 g Inosin.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Inosin, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus subtilis ATCC 13 952, -13 953, -13 954, -13 955 oder -13 956 in einem üblichen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium, das gleichzeitig als essentielle Nährstoffe für diese Mikroorganismen Adenin oder dessen Analoga sowie Aminosäuren, insbesondere Histidin und Asparaginsäure, aufweist, bei aeroben Bedingungen, wobei man den pH-Wert des Kulturmediums bei 4 bis 9 und die Temperatur während der Gärung bei 25 bis 4O⁰C hält, züchtet, daß man nach Abtrennung der Mikroorganismenzellen von dem Fermentationsmedium die Inosin enthaltende Lösung in hierfür üblicher Weise mit Ionenaustauscherharzen oder Aktivkohle konzentriert und daß man das Inosin aus der eingeengten Lösung durch Zusatz eines hydrophilen und Inosin nicht lösenden Lösungsmittels ausfällt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adenin oder dessen Analoga sowie Aminosäuren liefernde natürliche Substanzen trockene Hefe, Hefeextrakt, Preßhefe, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Polypepton, Maisquellwasser und Natriumribonucleat verwendet.