DE2000879A1

DE2000879A1 - Verfahren zur Herstellung von Uridin-5'-diphospho-glucose

Info

Publication number: DE2000879A1
Application number: DE19702000879
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hagino; Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-01-17
Filing date: 1970-01-09
Publication date: 1970-08-06
Also published as: GB1239700A; FR2032315A1; US3717547A

Description

" Verfahren zur Herstellung von Uridin-5'-diphospho-glucose "

Priorität: 17. Januar 1969, Japan, Nr. 2932/69

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Uridin-5'-diphospho-glucose (im folgenden als ÜDPG .abgekürzt) auf mikrobiologischem Wege in industriellem Maßstab.

UDPG ist aus der USA.-Patentschrift 3 231 385 als wertvoller Milchzusatz bekannt. Außerdem ist sie ein wertvolles Reagens für biochemische Untersuchungen, z.B. zur Aktivitätsbestimmung von Uridin-S'-diphosphoglucose-dehydrogenase (UDPGDH) und zum Studium der Glycogenbildung. Sie wirkt auch als Coenzym,, im Glucosestoffwechsel. UDPG hat die folgende Formel:

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CH₉OH

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UDPG wurde bisher aus Bäckerhefe (Journal of Biological Chemistry Vol. 184, Seite 333 /Ϊ95Ο/) oder synthetisch (Journal of American Chemical Society 80, 3756 /19587) hergestellt. Jedoch eignen sich diese Verfahren aus Ausbeute-und Kostengründen nicht in zufriedenstellender V/eise zur Herstellung von UDPG in industriellem Maßstab. Deshalb ist UDPG gegenwärtig eine sehr teuere Verbindung.

Es ist ferner bekannt, daß sich UDPG anreichert, wenn Uridinmonophosphat (UMP) oder Uridin-diphosphat (UDP) zusammen mit zellfreien Hefeextrakten inkubiert wird (Archieves of Biochemistry and Biophysics J54, 482 /Ϊ951/). Diese Substrate sind jedoch ebenfalls teuer, so daß dieses spezielle Fermentationsverfahren ebenfalls unwirtschaftlich ist.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß sich UDPG in beträchtlichem Ausmaß in einem wässrigen Nährmedium aus den billigen Ausgangsmaterialien Orotsäure oder Uracil oder ihren Salzen auf mikrobiologischem Wege bildet und anreichert.· Dieses Verfahren ist industriell deshalb von Bedeutung, weil es ohne Verwendung

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von UMF oder UDP als Ausgangsmaterial auskommt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Uridin-S'-disphospho-glucose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattungen Brevibacterium, Arthrobacter, Corynebacterium oder Micrococcus in einem Orotsäure und bzw, oder Uracil enthaltenden wässrigen Nährmedium unter Zusatz von Trockenhefe züchtet und die sich im Nährmedium anreichernde Uridin-5'-disphospho-glucose daraus * gewinnt.

Das wichtigste Merkmal der Erfindung ist, daß Mikroorganismen der Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter oder Micrococcus in einem Orotsäure und bzw. oder Uracil enthaltenden Nährmedium unter Zusatz von Trockenhefe gezüchtet werden.

Als Nährmedium kann im Verfahren der Erfindung jedes Nährmedium g verwendet werden, das eine geeignete Menge eines Kohlenhydrats oder einer anderen Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Stärkehydrolysat oder Melassen, eine Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumsulfat, und natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt» Pepton oder Fischmehl enthält. Bei der Verwendung von Stämmen» die besondere Nährstoffzusätze erforderlich machen, müssen diese /aeKtüe ir» geeigneter Weisw ^eia Nähr; ^diu^ zugesetzt werden»

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Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird ein Mikroorganismus der genannten Gattung in ein geeigne-, tes Nährmedium eingeimpft, wobei während der Züchtung Orotsäure und bzw. oder Uracil oder beide Stoffe zusammen mit Trockenhefe zugesetzt werden. Die Züchtung wird so lange fortgeführt, bis sich eine beträchtliche Menge von UDPG im flüssigen Nährmedium gebildet hat. Die Orotsäure und bzw. oder das Uracil können dem Nährmedium vor dem Animpfen zugesetzt werden. Vorzugsweise verwendet man diese Stoffe in einer.Gesamtkonzentration von 0,1 bis 5Ö g/Liter, insbesondere von 0,5 bis 10 g/Liter. Diese Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer nicht toxischen Salze eingesetzt werden.

Trockenhefe erhält man nach bekannten Verfahren. Es können verschiedene Hefearten verwendet werden, z.B. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces lactis, Torulopsis sphaerica, Candida guillermondii, Kloeckera africana oder Zygosaccharomyces major. Nicht getrocknete, handelsübliche Bäcker- oder Brauereihefen können zum Beispiel durch Acetontrocknung, Gefriertrocknung oder Lufttrocknung getrocknet werden. Andererseits können auch handelsübliche, getrocknete Bäckerhefen direkt ohne jede weitere Behandlung verwendet werden. Die Hefen können in verhältnismässig weiten Mengenbereichen eingesetzt werden. Jedoch ist ein Bereich von 5 bis 200 g/Liter im allgemeinen für eine rasche UDPG-Anreicherung geeignet.

Das Verfahren der Erfindung wird unter aeroben Bedingungen,

z.B. mittels der Schüttelkultivierung oder des Submersverfah-

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rens unter Luftzufuhr durchgeführt. Geeignete und bevorzugte Züchtungsbedingungen sind Temperaturen von 20 bis 40 C und ein . pH-Bereich von 4,0 bis 9,5. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 2 bis 8 Tage. Orotsäure und bzw. oder Uracil können zu Beginn der Züchtung, d.h. vor dem Animpf en", oder während der Züchtung zusammen mit der Trockenhefe zugesetzt werden. Wie aus den Beispielen hervorgeht, erhält man im allgemeinen günstige Ergebnisse, wenn die Orotsäure und bzw. oder das Uracil während der Züchtung unter nachfolgendem Zusatz der Trockenhe- ä fe zugegeben werden, nachdem die Züchtung schon einige Zeit fortgeschritten ist. Anorganisches Phosphat und Zuckernährstoffe können gleichzeitig mit der Trockenhefe zugegeben werden.. Die UDPG wird aus dem Nährmedium gewonnen, wenn die maximale Anreicherung erreicht ist. Die UDPG-Anreicherung kann analytisch verfolgt werden, z.B. durch Papierchromatographie oder Dünnschichtchromatographie.

Die Abtrennung von UDPG aus dem Nährmedium nach dem Abschluß der Züchtung kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden, z.B. durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen oder durch Ad- ■ sorption an Aktivkohle. Zum Beispiel läßt sich ein von H.G. Pontis et al. angegebenes Verfahren (Biochemica Biophysica Acta 26, 146 /Ϊ9577) anwenden.

Beispiel 1

Brevibacterium ammoniagenes A.T.C,C. 6872 wird in einem 2 # Glucose, 1 i» Pepton, 1 # Hefeextrakt, 0,3 & Natriumchlorid "und

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30 ug/Liter Biotin enthaltenden wässrigen Nährmedium 24 Stunden bei 3O⁰C angezüchtet. Das Anzuchtmedium wird in einem Verhältnis von 10 Vol.r-# in ein Nährmedium eingeimpft, das im Liter Wasser folgende Stoffe enthält:

100	g	Glucose
6	g	Harnstoff
10	g	KH₂PO₄
10	g	K₂HPO₄
10	g	MgSO₄.7H₂O
0,1	g	CaCl₂.2H₂O
30 j	Jg	Biotin
10	g	Hefeextrakt

Der pH-Wert des Nährmediums wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Dann wird das Nährmedium in Flaschen abgefüllt und 10 Minuten in einem Autoklaven bei 1 kg/cm sterilisiert. Jeweils 20 ml des Nährmediums werden in 250 ml-Erlenmeyerkolben gefüllt und vor der Verwendung sterilisiert.

Das in den Flaschen befindliche, angeimpfte Nährmedium wird unter aeroben Bedingungen bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Nach 72-stündiger Züchtung werden 2 g/Liter Orotsäure zugesetzt. Man züchtet weitere 48 Stunden. Dann wird Trockenhefe (Saccharomyces cerevisiae) in einer Konzentration von 100 g/Liter zugesetzt und weitere 2 Stunden gezüchtet. Man erhält in der Gärmaische eine UDPG-Anreicherung von 3,6 mg/ml.

Der überstand nach dem Zentrifugieren von einem Liter dieser Gär-

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maische wird auf den pH-Wert 7_fO eingestellt und über eine Säule mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x4 (Cl~Porm) gegeben. Zur Extraktion der UDPG wird eine Natriumchloridlösung in 0,01 η HCl, deren Natriumchloridkonzentration von 0,02 η bis 2 η steigt, über die Säule gegeben. Die UDPG-haltige Fraktion wird nach Adsorption an Aktivkohle mit 50 ?S- · igem Alkohol extrahiert. Der Alkoholextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft, mit Bariumhydroxid auf den pH-Wert 8,0 gebracht und die UDPG wird aus der Lösung .durch Alkoholzusatz auBgefällt. Man zentrifugiert ab und wäscht den Niederschlag mit Alkohol und Äther und trocknet ihn über Calciumchlorid in einem Exsikkator. Man erhält 700 mg Bariumsalz der UDPG.

Verwendet man anstelle von Brevibacterium ammoniagenes A.T.C.C. 6872 Brevibacterium ammoniagenes A.T.C.C. 6871, so werden 21 mg/ ml UDPG in der Gärmaische angereichert.

Beispiel 2 λ

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber anstelle von Orotsäure 2 mg/ml Uracil. Es reichern sich 3,3 mg/ml UDPG in der Gärmaische an.

Beispiel 3

Man verfährt vie in Beispiel 1, setzt aber Trockenhefe gleichzeitig mit der Orotsäure dem Nährmedium zu. Es reichem sich 3,9 mg/ml UDPG in der Gärmaische an.

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Beispiel 4

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber eine acetongetrocknete Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) und gibt ausserdem Glucose in einer Konzentration von 5 $> gleichzeitig mit der Trockenhefe zu. Es reichern sich 3,6 mg/ml UDPG in der Gärmaische an.

Beispiel 5

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber die in Tabelle I aufgeführten Mikroorganismen. Die dabei angereicherten Mengen an UDPG gehen ebenfalls aus der Tabelle hervor.

Tabelle I

Mikroorganismus

Angereicherte UDPG-Menge (mg/ml)

Corynebacterium A.T.C.C. 21084 Arthrobacter A.T.C.C. 21085

Micrococcus sodonensis A.T.C.C. 15932

Arthrobacter citreus A.T.C.C. 11624

Corynebacterium mycetoides A.T.C.C. 21134

3,4 2,8

1,6 1,7 2,1

Beispiel 6

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber acetongetrockne-

te Hefen der in Tabelle II aufgeführten Arten. Die Menge an an-

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gereicherter UDPG geht ebenfalls aus Tabelle.II hervor.

Tabelle II

Mikroorganismus Angereicherte UDPG-Menge

(mg/ml)

Saccharomyces cerevisiae

A.T.C.C. 15248 2,3

Saccharomyces lactis

A.T.C.C. 12425 2,1

Torulopsis sphaerica .

A.T.C.C. 8549 . 2,6

Zygosaccharomyces major

A.T.C.C. 15249 1,2

Kloeckera africana

A.T.C.C. 16512 , 0,9

Candida guillermondii

A.T.C.C. 9058 0,7

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

Patentansprüche

1./ Verfahren zur Herstellung von Uridin-S'-diphospho-glucose, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattungen Brevibacterium, Arthro*bacter, Corynebacterium oder Micrococcus in einem Orotsäure und bzw. oder Uracil enthaltenden wässrigen Nährmedium unter Zusatz von Trockenhefe züchtet und die sich im Nährmedium anreichernde Uridin-5'-diphospho-glucose daraus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Trockenhefe der Gattungen Saccharomyces, Torulopsie, Zygosaccharomyces, Kloeckera oder Candida verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung zwischen 4 und 9,5 hält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß many die Temperatur des Nährmediums zwischen 20 und 4O°C hält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtmenge an Uracil und bzw. oder Orotsäure zwischen 0,5 und 10 g /Liter liegt.

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7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium atamoniagenes verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micrococcus aodonensis verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Arthrobacter citreus verwendet wird.

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