DE2050983C3

DE2050983C3 - Verfahren zur Herstellung von alpha-Amino benzylpenicillin

Info

Publication number: DE2050983C3
Application number: DE19702050983
Authority: DE
Inventors: Yoshinobu Hofu; Kato Fumio Shizuoka; Okachi Ryo Machida Tokio; Miyamura (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-10-16
Filing date: 1970-10-16
Publication date: 1977-06-02

Description

In der OE-PS 2 34 273 ist ein Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäure durch ;o Umsetzen von 6-Aminopenicillansäure (nachstehend mit 6-APS bezeichnet) und einer Carbonsäure in Gegenwart eines von Bakterien gebildeten Enzyms beschrieben. Als geeignete Bakterien sind 17 Arten, einschließlich 3 Pseudomonas-Arten, genannt. Diese is Bakterien können dadurch ausgewählt werden, daß man ihre Aktivität bei der Bildung von Penicillin G aus 6-APS und einer Phenylessigsäure untersucht.

In der OE-PS 2 43 986 ist ein Spezialfall des in der OE-PS 2 34 273 beschriebenen Verfahrens beschrieben, bei dem 6-Aminobenzylpenicillin (Ampicillin) aus 6-APS und Λ-Aminophenylessigessigsäure hergestellt wird.

Eine der Schwierigkeiten bei dem bekannten Verfahren besteht darin, daß die bekannten Enzyme hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Bildung von «.-Aminobenzylpenicillin aus 6-APS und a-Aminophenylessigsäure zu fördern, nicht sehr spezifisch sind.

Bei der bekannten Herstellung von a-Amipobenzylpenicillin wird die als Ausgangsmaterial verwendete 6-APS gewöhnlich durch enzymatische Hydrolyse von Penicillin G erhalten. Im Hydrolysat findet sich außer 6-APS auch Phenylessigsäure, die bei der Hydrolysegebildet wird. Wegen der unspezifischen Wirkung der bekannten Enzyme wirft der Versuch, a-Aminobenzylpenicillin aus ungereinigter 6-APS herzustellen, der a-Aminophenylessigsäure zugesetzt worden war, jedoch eine Reihe von Schwierigkeiten auf. Zum Beispiel wird das unerwünschte Penicillin G aus Phenylessigsäure und 6-APS zurückgebildet, während gleichzeitig auch a-Aminobenzylpenicillin aus a-Aminophenylessigsäure und 6-APS gebildet wird. Wenn man daher a-Aminobenzylpenicillin aus -vAminophenylessigsäure und 6-APS in Gegenwart von Phenylessigsäure herstellt, wird immer Penicillin G als Nebenprodukt erhalten, weshalb als Substrat eine große Menge 6-APS benötigt wird. Außerdem ist die Abtrennung des a-Aminobenzylpenicillins von Penicillin G schwierig. Es wurde daher bei den bekannten Verfahren als vorteilhaft angesehen, gereinigte 6-APS zu verwenden und damit die genannten Schwierigkeiten zu umgehen. Es wäre jedoch erwünscht, Mikroorganismen verfügbar zu haben, die lediglich a-Aminobenzylpenicillin aus Phenylessigsäure enthaltender 6-APS als Substrat synthetisieren, damit die Reinigungsstufe für 6-APS entfallen kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin mittels eines von Mikroorganismen gebildeten Enzyms zu schaffen, bei dem keine 6-APS aus Penicillin G gebildet und das Enzym auch nicht durch in der Reaktionslösung enthaltene Phenylessigsäure beeinflußt wird und schließlich kein Penicillin G als Nebenprodukt aus Phenylessigsäure und 6-APS entsteht Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Die Erfindung betrifft somit den im Patentanspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die unmittelbare Verwendung von 6-APS ohne Reinigung aus einem Gemisch von 6-APS und Phenylessigsäure in Lösung, das durch Hydrolyse von Penicillin G mittels Penicillin-Acylase nach bekannten Verfahren erhalten wurde. Das erfindungsgemäß hergestellte a-Aminobenzylpenicillin kann weiterhin leicht gereinigt werden und ergibt ein Produkt, das mit geringerem Aufwand in hoher Ausbeute und in großem Maßstab gewonnen

wird.

Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Zellkörper der Mikroorganismen als solche, eine Kulturflüssigkeit, die bei der Züchtung der Mikroorganismen anfällt, oder das freie isolierte Enzym zu verwenden, wie im folgenden erläutert wird. Um die Zellkörper, die Kulturflüssigkeit oder das freie Enzym zu erhalten, werden die Mikroorganismen in einem Nährmedium kultiviert, in dem das gewünschte Enzym gebildet wird. Die Züchtung wird vorzugsweise ausreichend lange durchgeführt, so daß sich das Enzym extrazellulär ansammelt.

Als Züchtungsmedium für die Mikroorganismen werden Nährboden verwendet, die eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Saccharose. Stärke, Melassen. Glycerin, Sorbit oder diese Substanzen enthaltende Naturprodukte enthalten. Das Medium enthält außerdem eine Stickstoffquelle, z. B. eine natürliche Stickstoffquelle, wie Pepton. Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl-Säurehydroiysat oder Glutaminsäure, oder anorganische Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumnitrat. Außerdem sind vorzugsweise geeignete Mengen von anorganischen Salzen, wie Phosphate (prim. Kaliumphosphat und sek. Kaliumphosphat), Magnesiumsalze, wie Magnesiumsulfat, Metallionen, wie Eisen-, Natrium-, Kalium-, Mangan-, Zink- oder Calciumionen und Anionen, wie Chlorid- und Nitrationen, vorhanden. Andere Nährstoffe für das Wachstum dieser Mikroorganismenstämme können nach Bedarf dem Medium zugesetzt werden.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie durch Schüttelkultur oder Submerskultur mit Belüftung und Rühren. Die Züchtungstemperatur beträgt 20 bis 50⁰C. vorzugsweise 28 bis 37° C und der pH-Wert der Kultur .beträgt 5,0 bis 10,0, vorzugsweise 7,0 bis 8,0. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 6 bis 48 Stunden. Auf diese Weise wird das für die Synthese verwendete Enzym in den Zellkörpern der Kultur und in der Kulturflüssigkeit bebildet.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym kann, wie bereits erwähnt, in Form der Kulturflüssigkeit selbst, der Zellkörper oder des freien Enzyms, das aus einer Lösung der zerstörten Zellkörper, z. B. durch Aussalzen mit Ammoniumchlorid, durch ein Fällungsverfahren unter Zugabe von Aceton oder Äthanoi oder durch Säu'enchtomatographie in gereinigtem Zustand isoliert werden kann, eingesetzt werden. Wenn die Zellkörper als Enzymquelle verwendet werden, wird eine Suspension der Zellkörper in einer Lösung oder werden die mittels Aceton getrockneten Zellkörper verwendet. Wird die Kulturflüssigkeit aus

solche verwendet, dann werden die als Substrat dienenden Reaktionsteilnehmer zur Kühlflüssigkeit zugefügt, nachdem der pH-Wert in der nachstehend angegebenen Weise zur Erzielung günstiger Reaktionsbedingungen eingestellt worden ist

Die 6-Aminopenicillansäure kann als Substrat in Form roher kristalliner 6-APS, die aus dem Hydrolysat von Penicillin G erhalten wurde, oder als Lösung von 6-APS, die Phenylessigsäure enthält, eingesetzt werden. Gewöhnlich liegt die Verbindung in Form des Ammonium-, Natrium- oder Kaliumsalzes vor.

Die als Substrat verwendete a-Aminophenylessigsäure kann als freie Säure oder als Amid, Alkylester, wie dem Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Octylester, oder als Alkalimetall- oder Erdkalimetallsalz, wie dem Natrium , Kalium oder Calciumsalz, eingesetzt werden. Zusätzlich kann einer der Rfiaktionsteilnehmer oder beide in Form eines Additionssalzes mit einer Säure, insbesondere einer Mineralsäure, wie dem Hydrochlorid, Hydrobromid oder Hydrojodid. dem Hydrogenphosphat oder Hydrogensulfat, verwendet werden.

Die Reaktion zwischen den als Substrat eingesetzten Verbindungen wird in Lösung durchgeführt, die durch Zugabe der Substrate und einer geeigneten Menge und Form des Enzyms, vorzugsweise zu einer Pufferlösung mit konstantem pH-Wert oder durch Zugabe der beiden Substrate zur Kulturflüssigkeit selbst in der genannten Weise erhalten wird. Geeignete pH-Werte für die Umsetzung liegen in einem weiten Bereich von 3 bis 8, jedoch liegt ein besonders geeigneter pH-Wert für die erfindungsgemäße Umsetzung bei 5.5 bis 6,5. Die Umsetzungstemperatur betragt 25 bis 50'C. vorzugsweise 30 bis 37" C. Die Umsetzung wird vorzugsweise 1 bis 24 Stunden lang durchgeführt.

Nach vollständiger Umsetzung kann /x-Aminobenzylpenicillin leicht in an sich bekannter Weise, wie durch Extraktion oder Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, durch Ionenaustauscher oder durch Säulenchromatographie isoliert werden. Es kann auch die Ausfällung am isoelektrischen Punkt durchgeführt werden.

Beispiel 1

Als Mikroorganismus wurde Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 verwendet. Das Einsaatmedium enthielt 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid. Eine Platinöse des Stammes wurde in 300 ml des Kulturmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft, und die Züchtung wurde 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Mit der erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden danach 3 Liter des nachstehend beschriebenen Hauptfermentationsmediums in einem 5 Liter fassenden Gärbehälter beimpft.

Das Hauptfermentationsmedium enthielt 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,5% Fleischextrakt, 0,5 % Natriumglutamat und 0,25% Natriumchlorid. Der pH-Wert betrug vor dem Sterilisieren 7,3 (eingestellt mit 5n-NaOH). Es wurde mit 300 Upm gerührt, mit 3 Liter Luft je Minute belüftet und bei 3O⁰C gezüchtet.

Die Züchtung wurde 24 Stunden durchgeführt, wobei der pH-Wert der Kulturflüssigkeit mit einer Lösung aus einem Gemisch von 10% Glutaminsäure und 6% Schwefelsäure auf 7,5 eingestellt wurde. Nach dem Abtrennen der Zellkörper aus der Gärmaische und Zentrifugieren wurden diese in einer 1/30 m Phosphorsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 suspendiert, so daß die Zellkörper eine Konzentration von etwa 5 mg/ml auf Basis des Trockengewichts hatten. Es wurde keine Bindung von 6-Aminopenicillansäure beobachtet, selbst in Gegenwart von Penicillin G.
Es wurden zur Zellkörpersuspension Phenylessigsäure enthaltende 6-Aminopenicillansäure und oc-Aminophenylessigsäureamid zugesetzt, so daß die Konzentration von 6-APS 10 mg/ml und von et-Aminophenylessigsäure 25 mg/ml betrug. Die erhaltene Reaktionslösung wurde 3 Stunden bei 35° C umgesetzt Die in der Lösung

ίο gebildete Menge «-Aminobenzylpenicillin betrug 8,5 mg/ml. Es wurde keine Bildung von Penicillin G beobachtet.

Die erhaltene Reaktionslösung wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert 4,0 eingestellt und zentrifugiert Ein Liter der überstehenden Flüssigkeit wurde durch eine Säule gegeben, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz gefüllt war, wobei ot-Aminobenzylpenicillin absorbiert wurde. Das Harz wurde mit einer 0,2 m-Citratpufferlösung vom pH-Wert 4,25 und danach mit einer 0,03 m-Citrat-Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7.0 eluiert. Die aktive Fraktion wurde eingeengt und mit einem Dextranpräparat entsalzt. Das entsalz'e Konzentrat wurde an Aktivkohle adsorbiert und mi; 50%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde gefriergetrocknet und ergab ein rohes Pulver von (X-Aminobenzylpenicillin. Nach dem Umkristallisieren aus Wass- r (pH-Wert 4,0) wurden 4,2 g reines Λ-Aminobenzylpenicillin erhalten.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wurde der Stamm Pseudomonas melanogenum ATCC 14535 auf ein Einsaatmedium geimpft, und 1,8 Liter des Ansatzes wurden auf 100 Liter sterilisiertes Nährmedium in einen 200 Liter fassenden Tank übertragen. Die Züchtung wurde 24 Stunden unter Rühren mit 250 Upm mit einer Belüftung von 60 Liter/min bei einer Temperatur von 3O⁰C durchgeführt. Danach wurden 1000 Liter Nährmedium in einem 2000 Liter fassenden Tank gemäß Beispiel 1 sterilisiert und mit 100 Liter der Kulturfiüssigkeit der vorhergehenden Passage beimpft.

Die Züchtung wurde 12 Stunden unter Rühren mit 100 Upm und bei einer Belüftung von 200 Liter/min bei einer Temperatur von 3O⁰C durchgeführt während der pH-Wert auf 7,5 eingestellt wurde.

Es wurde keine Bildung von 6-Aminopenicillansäure beobachtet, selbst wenn Penicillin G auf die erhaltene Kulturflüssigkeit einwirken gelassen wurde. Es wurde 1 Volumteil der durch Spaltung von Penicillin G durch Penicillin-Acylase (Gehalt an 6-APS 20 mg/ml) erhaltenen Lösung, die in bekannter Weise erhalten worden war, zu 1 Volumteil der Kulturflüssigkeit der Hauptkultur gegeben, und hierzu wurden 25 mg/ml des Hydrochlorids von Λ-Aminophenylessigsäuremethylester ?:ugegeben. Die Umsetzung wurde 3 Stunden unter Rühren mit 100 Upm und bei einer Temperatur von 35°C durchgeführt, ohne daß belüftet wurde, während der pH-Wert mit Ammoniak auf 6,0 eingestellt

(₎₀ wurde. Die in der Reaktionslösung gebildete Menge von Λ-Amiriobenzylpenicillin betrug 8,9 mg/ml. Es wurde keine Bildung von Penicillin G als Nebenprodukt beobachtet.

Beispiel 3

Es wurde ein Stamm Pseudomonas ovalis ATCC 15175 gemäß Beispiel 1 eingeimpft und gezüchtet. In einem 30 Liter fassenden Gärbehälter wurden 15 Liter

IS

des Nährmediums mit 1,5 Liter der Einsaatkuitur beimpft

Das Nährmedium enthielt 2,5% Sojabohnenmehl-Säurehydrolysat, 1,0% Pepton, 0,5% Natriumglutamat, 0,02% prim. Kaliumphosphat und 0,02% Magnesiumsulfat, und der pH-Wert vor der Sterilisierung betrug 7,2.

Die Züchtung wurde 24 Stunden unter Rühren mit 250 Upm bei einer Belüftung von 10 Liter/min und einer Temperatur von 30⁰C durchgeführt, während der pH-Wert der Kulturflüssigkeit auf 7,5 eingestellt wurde, ι ο Es wurde keine Bildung von 6-Aminopenicillansäure beobachtet, selbst wenn Penicillin G auf die erhaltene Kulturflüssigkeit einwirken gelassen wurde. Die Umsetzung der Substrate wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei die Kulturflüssigkeit als Enzymquelle benutzt wurde.

Die in der Reaktionslösung gebildete Menge Λ-Aminobenzylpenicillin betrug 7,4 mg/ml. Es wurde keine Bildung von Penicillin G als Nebenprodukt beobachtet.

Beispiel 4

Es wurden folgende Stämme verwendet: Escherichia coli ATCC 11105
Pseudomonas melanogenum ATCC 14535 Pseudomonas melanogenum ATCC 17808 Pseudomonas ovalis ATCC 15175

Herstellung der Zellen:

Escherichia coli ATCC 11105 gemäß Beispiel 1 der OE-PS 2 34 273: Pseudomonas melanogenum ATCC 14535 und 17808 sowie Pseudomonas ovalis ATCC 15175 nach den vorstehend in Beispiel 1 bis 3 beschriebenen Methoden.

1. Versuch I unter Verwendung reiner 6-APS

A) Die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Mikrobenzellen werden in einem 1/15molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 bei einer Konzentration von 5 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht, suspendiert. Die Suspension wird mit 1,25 mg/ml (0,125%) reiner 6-APS, 1% Phenylglycylamid und 0,2% Toluol versetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

B) Das Verfahren gemäß (A) wird wiederholt, anstelle von Phenylglycylamid wird jedoch Phenylglycinäthylester-hydrochlorid verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

5°

Stämme	11105 (OE-PS 2 34 273)	Ausbeute an	B
	14535 (Erfindung)	Ampicillin	530
	17808 (Erfindung)	(Einheit/ml)	1250
	15175 (Erfindung)	A	1130
ATCC	480	1200
ATCC	1210
ATCC	1080
ATCC	1121

30

2. Versuch 11 unter Verwendung von roher 6-APS

A) Die Mikrobenzellen werden in einem 1/15molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 bei einer Konzentration von 5 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht, suspendiert. Die Suspension wird mit 1,25 mg/ml (berechnet als 6-APS) roher 6-APS (eine (.5 Kulturbrühe der enzymatischen Spaltung von Penicillin G), 1% Phenylglycylamid und 0,2% Toluol versetzt und eine Stunde bei 37⁰C inkubiert.

B) Das Verfahren gemäß (A) wird wiederholt, anstelle von Phenylglycylamid wird jedoch Phenylglycinäthylester-hydrochlorid verwendet

Die Ergebnisse sind in Tabelle Π zusammengefaßt.

Tabelle Π

Stämme	Ausbeute an	25	B	40
	Ampicillin	973	1020
	(Einheit/ml)	1030	1150
	A	890	970
ATCC 11105 (OE-PS 2 34 273)
ATCC 14535 (Erfindung)
ATCC 17808 (Erfindung)
ATCC 15175 (Erfindung)

Aus den Versuchsergebnissen ist ersichtlich, daß die Ausbeute an a-Aminobenzylpenicillin mit den erfindungsgemäß verwendeten Stämmen höher ist als mit E. coli ATCC 11105, unabhängig davon, ob die eingesetzte 6-APS rein oder durch Phenylessigsäure verunreinigt war.

Bei Verwendung reiner 6-APS wurden von den Stämmen ATCC H535. 17808. 15175 1080 bis 1250 Einheiten/ml Λ-Aminobenzylpenicillin gebildet, während von dem Stamm ATCC 11105 nur 480 bis 530 Einheiten/im entstanden. Bei Verwendung von roher 6-APS bildeten sich mit Hilfe der erfindungsgemäß verwendeten Stämme 890 bis M 50 Einheiten/ml Λ-Aminobeiizylpenicillin. während die Ausbeute mit ATCC 11105 nur 25 bis 40 Einheiten/ml betrug. Daraus ist ersichtlich, daß bei Verwendung roher 6-APS die Ausbeute an \ Aminobenzylpenicillin bei Verwendung von ATCC 11105 um etwa 1/10 des Wertes geringer war, der bei Verwendung reiner 6-APS erhalten wurde, während mil den erfindungsgemäß verwendeten Stämmen ungefähr die gleiche hohe Ausbeute erhalten werden konnte.

Diese hohe Ausbeute, unabhängig von der Reinheit der eingesetzten 6-APS. hängt von der spezifischen Eigenschaft des Enzyms ab das die erfindungsgemäß verwendeten Stämme bilden, d. h. der Eigenschaft, aus 6-APS und Phenylessigsäure kein Penicillin G zu bilden. D^: ?se Eigenschaft besitzt das Enzym nicht, das sich von den in der OE-PS verwendeten Stämme ableitet.

Um diese Unterschiede in den Eigenschaften der Enzyme zu zeigen, wurden Versuche zur Bildung von Penicillin G aus 6-APS und dem Kaliumsalz der Phenylessigsäure gemäß Beispiel 1 der OE-PS 2 43 986 unter Verwendung von ATCC 11105 und der drei vorgenannten, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Stämme durchgeführt. Durch den Stamm ATCC 11105 wurden 375 Einheiten/ml (225y/ml) Penicillin G gebildet, während die erfindungsgemäß verwendeten Stämme kein Penicillin G bildeten.

Auf Grund der speziellen Eigenschaft des Enzyms der erfindungsgemäß verwendeten Stämme läßt sich Λ-Aminobenzylpenicillin aus roher 6-APS und oc-Aminophenylessigsäure in hoher Ausbeute ohne Bildung des unerwünschten Penicillin G herstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit technisch fortschrittlich gegenüber dem Verfahren der OE-PS 2 43 986.

Aber auch gegenüber chemischen Verfahren zur Herstellung von Ampicillin ist das erfindungsgemäße Verfahren aus den gleichen Gründen technisch fortschrittlich. Zur Herstellung von Ampicillin aus 6-APS auf chemischen Wege muß reine, von Phenylessigsäure befreite 6-APS eingesetzt werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin durch Umsetzen von 6-Aminopenicillansäure mit a-Aminophenylessigsäure oder deren Amid, Alkylester oder Alkali- oder Erdalkalisalz in Gegenwart eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart eines Enzyms von Pseudomonas melanogenum ι ο ATCC 1780S, ATCC 14535 oder Pseudomonas ovaiis ATCC 15175 und Phenylessigsäure als Verunreinigung enthaltender 6-Aminopenicillansäure durchführt.