DE2330426A1 - Verfahren zur herstellung von d-ribose - Google Patents
Verfahren zur herstellung von d-riboseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur
Gattung Bacillus gehörenden, D-Ribose bildenden Mikroorganismus, dessen Transketolaseaktivitat Null ist, in einem Kultur-'
medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie die zum Wachstum des Stammes notwendigen
Paktoren enthält, und hierdurch den Stamm veranlaßt, sich zu entwickeln und D-Ribose anzuhäufen, und die hierbei angehäufte
D-Ribose aus dem erhaltenen Kulturmedium isoliert.
Als Bestandteil von Nucleinsäuren kommt D-Ribose in allen Organismen
vor. Ribitol, ein Reduktionsprodukt von D-Ribose, ist in Vitamin Bk und Ribitol-Teichonsäure, einem Bestandteil der '
Zellmembranen, vorhanden. Sie ist sora^t eine physiologisch
sehr wichtige Substanz. Ferner haben D-Ribose und ihre Derivate bisher starke Aufmerksamkeit als Ausgangsmaterialien für
die Synthese von Vitamin Bp und die sogenannten Nucleinsäure- ·
würzen auf sich gezogen, so daß die Entwicklung eines großtechnischen
Verfahrens zur Herstellung von D-Ribose sehr erwünscht ist.
309881/094« f
Zu den üblichen Verfahren zur Herstellung von D-Ribose gehören
Methoden, bei denen die D-Ribose aus Naturprodukten extrahiert wird, und Syntheseverfahren unter Verwendung von
Furan, D-Glukose usw. als Ausgangsniaterialien. Es wurde ferner
über die fermentative Erzeugung von D-Ribose berichtet, aber die Ausbeuten der Fermentation sind äußerst niedrig.
Diese Verfahren sind somit nicht völlig befriedigend für die
Großherstellung von· D-Ribose.
Von der Anmelderin wurden bereits Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung
Bacillus vorgeschlagen. Bei diesen Verfahren wird ein D-Ribose bildender Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der L-Tyrosin,
L-Tryptophan'und L-Phenylalanin zum'Wachstum benötigt, (diese
Mikroorganismen werden nachstehend als "Aminosäuren benötigende Mikroorganismen" bezeichnet) oder dem Transketolaseaktivität
fehlt (nachstehend werden diese Mikroorganismen als "Kikroorganismen
mit fehlender Transketolaseaktivität" bezeichnet), verwendet.
Das erstgenannte Verfahren, bei dem Aminosäuren benötigende
Organismen verwendet werden, wird in der britischen Patentschrift 1.255*25^ und das letztgenannte Verfahren, bei dem
Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität verwendet werden, in "Agricultural and Biological Chemistry", Band
35, Nr. 4, Seite 509 (1971), beschrieben.
Die bei diesen Verfahren erhaltene Ausbeute an D-Ribose liegt zwischen etwa 20 und J>0 mg/ml Kulturmedium.
Sowohl die Mikroorganismen, die Aminosäuren benötigen, als
auch die Mikroorganismen, denen Transketolase fehlt, haben eine äußerst geringe Transketolaseaktivität. Insbesondere
würde bei den letztgenannten Mikroorganismen aufgrund von •,Versuchen, in denen die Aktivität nach der nachstehend beschriebenen
Methode von B.L. Horecker und Mitarbeitern
309881/0949
(Journal of Biological Chemistry, Band 225, Seite 1009
gemessen wurde, angenommen, daß sie. keine Transketolase enthalten.
Die Schrägkultur eines Stammes, dessen Transketolaseaktivität
bestimmt werden soll, wird in 200 ml eines modifizierten Spizizen-Mediums (Agricultural and Biological Chemistry,
Band 34, Nr. 3, Seite 38I (1970)) überführt, das 0,4 %
(NH4^SO4, 1,4 % K2HPO4, 0,6 % KH2PO4, 0,02 % MgSO4-TH3O,
0,0004 % Biotin, 0,0068 % Adenin, 0,014 % Guanosin, 0,5 %>
Sorbit und 0,5 ^ Natrium-L-glutamat als Kohlenstoffquellen
enthält und. in einem. 1 1-Kolben enthalten ist, und bei 37 C.
auf einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. Nach einer Kultivierungsdauer von 16 Stunden werden die Zellen durch
Zentrifugieren isoliert, mit einer 0,01-molaren Tris-(hydroxymethyl)aminoiTiethan-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5), die 0,001 Mol Mercaptoäthanol enthält, gewaschen und in der gleichen Pufferlösung
so suspendiert, daß die Extinktion der Zellsuspension bei 650 mn 10 beträgt. Dann wird Lysozym der Zellsuspension
in einer Konzentration von 5Qfcß/ml zugesetzt. Die Suspension
wird 90 Minuten bei 37°C bebrütet. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (1,2x10 g) entfernt. Die klare
Lösung wird als Enzymlösung verwendet.
Reaktionslösung A:
20 /U-MoI D-Ribose-5-phosphat, 0,5 η-Mol NADH, D-Ribose-5-phosphatisomerase,
D-Ribose-5-phosphatepimerase, 0,66 Einheiten a-Glycerophosphatdehydrogenase, die Triosephosphatisomerase
enthält, und 60 u-Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl Pufferlösung (pH 7,5).
309881/0949**
Reaktionslösung_B:
2Oa-MoI MgCl2, 0,4^ u-Mol Thiaminpyrophosphat, 40 Ai-Tris(hydroxymethyi)aminomethan-HCl-Pufferlösung
(pH 7*5) und eine gegebene ivlenge der Enzymlösung.
Jede Reaktionslösung wird 10 Minuten bei J>0°0 bebrütet. Die
Reaktionslösungen werden dann gemischt (Gesamtvolumen 2 ml), worauf ihre Extinktion bei J>hQ nyi im Laufe der Zeit gemessen wird. Die Transketolaseaktivität (u-Mol/Min./mg Protein)
in der Enzymlösung wird durch die folgende Formel ausgedrückt:
AE x
x vx d χ Ε χ ρ
Hierin ist -Δε,^/». die Geschwindigkeit der Abnahme der
reinen Absorption der gemischten Reaktionslösung bei ^40 mu
für 1 Minute, V das Gesamtvolumen des Gemisches der Reaktions lösungen (2 ml), 2H der molare Extinktionskoeffizient von NADH
bei 340 mu (6,22 cm2/u-Mol),. d der Lichtweg (1 cm), E das Volumen
der Enzymlösung (0,1 ml) und ρ das Gewicht des Proteins in der Enzymlösung (mg/ml).
Als Testmikroorganismen wurden bekannte Stämme von Aminosäuren
benötigende Mikroorganismen, nämlich Bacillus pumilus
Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtil is Nr. 429 (britische
Patentschrift 1.255.254) sowie Mikroorganismen mit fehlender
Transketolaseaktivität, nämlich die Bacillus species Shi 5 und Shi 7 (Agricultural and Biological Chemistry, Band
35, Nr. 4, Seite 509 (1971)), verwendet. Zum Vergleich wurden
Wildstämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis verwendet.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
3Q9881/0949
Mikroorganismus
Protein optische Transke tolaseakt ivi tat,
(mc/ml) Dichte (u-Mol/
(-AEVn/ 4-Un./mg
Min?)
Bacillus | pumilus |
(wild | strain) |
Bacilliis | pumilus |
No. W5 | |
Bacillxis | pumi-luH |
No«557 | |
Bacillus | subtilis |
(wild | strain) |
Bacillus | subtilis |
No.429 | |
Bacillus | species |
Shi 5 | |
Bacillus | species |
2.2
1*8
2*0
0.165
1.9 < 0.005
0i005
0.24
0.00
0.00
OtOOO 0*15
Shi 7
1.7 < 0.005 0.00 1.8 < 0.005 0.00 1.9 < 0.005 0.00
Bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung dor Transketolaseaktivität
wurde als Enzymlösung die klare Lösung als solche verwendet, und die Aktivität wurde zumindest bis hinab
zur zweiten Dezimalstelle mit Null ermittelt. Bei dieser Methode wurde jedoch keine wesentliche Zahl an der dritten Dezimalstelle
gefunden.
V/eitere Untersuchungen über die Bestimmung der Transketolaseaktivität
führten zur Entwicklung einer Methode, bei der die Berechnung der TransketolaseaktivitäV richtig bis hinab zur
dritten Dezimalstelle an einer konzentrierten Lösung, die durch Ultrafiltration der Enzymlösung bei der vorstehend beschriebenen
Bestimmungsmethode erhalten wird, vorgenommen werden kann. Hierbei wird die Enzymlösung durch Ultrafiltration
unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, z.B. der DIAFLO-Membran.PM 10 (Hersteller: Amicon Corporation, USA),
konzentriert, bis sie etwa 1/10 ihres ursprünglichen VoIu-
309881/0949
mens hat. Von der Anmelderin wurde die in dieser Weise konzentrierte
Lösung als Enzymlösung verwendet.
Bei dieser Methode zeigte es sieh, daß die Transketolaseaktivität der Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen und der
Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität an der dritten Dezimalstelle nicht Mull betrug. Weitere Untersuchungen
der Stämme und Kultivierungsmethoden führten zu der
Peststellung, daß Stämme, deren Transketolaseaktivität wenigstens
bis zur dritten Dezimalstelle Null ist, D-Ribose in größerer Menge als die Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen
und die Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität anzuhäufen vermögen, und daß die angehäufte Menge
•etwa 40 bis 50 mg/ml Kulturmedium, das nach den bekannten
Verfahren erhalten wird, betragen kann. Es wurde ferner gefunden, daß die Stämme, deren Transketolaseaktivität bis
wenigstens zur dritten Dezimalstelle Null beträgt (nachstehend einfach als "die Mikroorganismen" bezeichnet), eine
wesentlich größere D-Ribosemenge anhäufen, wenn sie in Gegenwart einer zweibasischen organischen Säure kultiviert
werden. Die vorstehend genannten Feststellungen, liegen der Erfindung zugrunde.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mikroorganismen
können unter Verwendung von WiIdstammen, wie Bacillus puir.jlus,
Bacillus subtilis usw. als Ausgangsstämme und Bestrahlung dieser Stämme beispielsweise mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen
oder γ-Strahlen oder durch Behandlung mit einem Mutagen, z.B. Nitrosoguanidin, erhalten werden. Für die
Zwecke der Erfindung eignen sich beispielsweise die Stämrre Bacillus pumilus Nr. 716, Nr. 755 und Nr. 783 und Bacillus
subtilis Nr. 608 und Nr. 632. In Tabelle 2 ist die Transketolaseaktivität
dieser Stämme im Vergleich zu Bacillus pumilus Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtilis -Nr. 429, Bacillus
species Shi 5 und Shi 7 angegeben. Diese Werte wurden unter
Verwendung der Enzymlösung als solche (Methode I) und der konzentrierten Enzymlösung (Methode II) ermittelt.
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. BAD ORIGINAL
Relative Transketoiaseaktivitäten
Methode I Methode II
Mikroorganismus mg/ml
3acillu3 pusiilus
(ViId strainT
Bacillus pumilus No:503
Bacillus pumilus No.537
Bacillus pumilus No.716
Bacillus pumilus No.735
Bacillus pumilus No.783
Protein Extinktion Transketoiase-
Bacillus subtilis (wild strain)
Bacillus subtilis ϊίο.4^9
2.2 1.9 1.8 2.0 2.0 2.2
2.0 1.7
"ΔΕ"54Ο/Μ1η aktivität
y*j/win. „.
Protein Extinktion Transketolasemg/ml
0.165
< 0.005
< 0.005
< 0.005
< 0.005
< 0.005
0.080 < 0.005
'Protein
0.24
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.13
0.00 (< 0.01) 100
100
Il-
19 ~L
19.0
20.3
19.8
23.0
20*0
0.030
0.045
< 0.005
< 0.005
< 0*005
0.025
0.005 0.008
JlCO1 2 3
0.000« 0.001)
0.000(< 0.001)
0.000(< 0.001)
0.004
100 3
Methode I Methode II
Protein Extinktion Transketolase-Mikroorganismus mg/ml -δΕ,ι,λλ»- aktivität
Bacillus subtilis
No.608
No.608
ο Bacillus subtilis
co No. 6^2
oo
oo Bacillus species
-· 3hi 5
-· 3hi 5
Bacillus species
Shi 7
Shi 7
yU-Mol/Min./mg
'Protein Protein Extinktion Trar.sketolasemg/ml
-AE, n Q//Mln>
aktivität
yU-Mol/Min./^S
/Proteln .
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
0.00 (< 0.01)
< 0.005
! 19.8
0.000(. < 0.001)
0.000(< 0.001)
0.007
0.007
0.007
NJ CJ CO
In Tabelle 3 ist die Fähigkeit der vorstehend genannten Stamme
zur Bildung von Ribose nach der nachstehend genannten Methode angegeben:
(platindraht)
Eine Imprnade^nenge der Schrägkultur des Testmikroorganistius wurde in 20 ml eines Mediums geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliurnhydrogenphosphat, 0,1 % Kaliur.1.-dihydrogenphosphat, 100 γ/ml L-Tryptophan, 100 γ/ml L-Phenylal.anin und 100 γ/ml L-Tyrosin enthielt und in einem 200 rr.l-Kolben enthalten war.. Eine Impfkultur wurde hergestellt, indem 16 Stunden bei.37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 200 Upm bebrütet wurde.
Eine Imprnade^nenge der Schrägkultur des Testmikroorganistius wurde in 20 ml eines Mediums geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliurnhydrogenphosphat, 0,1 % Kaliur.1.-dihydrogenphosphat, 100 γ/ml L-Tryptophan, 100 γ/ml L-Phenylal.anin und 100 γ/ml L-Tyrosin enthielt und in einem 200 rr.l-Kolben enthalten war.. Eine Impfkultur wurde hergestellt, indem 16 Stunden bei.37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 200 Upm bebrütet wurde.
•2 ml· eier Impfkultür 'wurden in 20 ml eines Kauptkulturnediur.s
(nachstehend als Medium A bezeichnet) überführt, das 15 %
D-Glukose, 1,5 % Trockenhefe, 0,5 % Arr.moniurr,sulfat, 2 % CaI-ciumcarbonat,
100 7/ml L-Tryptophan, 100 γ/ml L-Phenylalanin
und 100 γ/ml L-Tyrosin enthielt und in einem 200 ml-Kolben
enthalten war. Die Bebrütung wurde 6 Tage bei /7°C auf einerrotierenden
Schüttelvorrichtung bei 200 Upm vorgenommen.
Die in den Kulturmedien angehäufte Menge der D-Ribose wurde
nach der Methode bestimmt, die in "Agricultural and Biological Chemistry", Band 35, Seite 509 (1971), beschrieben ist.
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■- Io -
Tabelle 5 ' Fähigkeit zur Ribose-Bildung
Mikroorganismus angehäufte D-Ribose . t mg/ml ]
Bacillus pumilus (V/ildstamm) 0
Bacillus pumilus Nr. 505 29
Bacillus pumilus Nr. 537 28
Bacillus pumilus Ur. 716 45
Bacillus pumilus Hr. 735 49
Bacillus punilus Nr. 783 47
Bacillus subtilis (V/ildstamm) 0
Bacillus subtilis Nr. 429 ' ' 26 '
Bacillus subtilis Nr. βθ8 4-5
Bacillus subtilis Nr. 63 48
Bacillus species Shi 5 31
Bacillus species Shi 7 27
Die Mikroorganismen haben die genetischen Merkmale, daß sie nicht auf Kohlehydraten, wie D-Glukonsäure, L-Arabinose und
D-Ribose als ausschließliche Kohlenstoffquellen wachsen können und daß sie zum Wachstum Shikimisäure oder gleichwertige
Substanzen, wie L-Tyrosin, L-Tryptophan oder L-Phenylalanin
benötigen.
Weitere genetische und biochemische Merkmale, in denen diese Stämme sich von den ursprünglichen Mikroorganismen und den
bekannten Stämmen unterscheiden, bestehen darin, daß ihre Transketolaseaktivität unter der zur Zeit bekannten Grenze
der Nachweisbarkeit liegt und ihre Entwicklung und die Anhäufung von D-Ribose sehr hoch sind.
Zur Kultivierung der Mikroorganismen können als Kohlenstoff-309831/09 49
- ii -
quellen D-Glukose, D-Fruktose, D-iiannose, Sorbit, D-Mannit,
Saccharose, Maltose, Dextrin, lösliche Stärke, ausgebrauohte Melasse usw. und als Stickstoffquellen verschiedene anorganische
und organische Stickstoffverbindungen und diese ent- ' haltende Substanzen, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Harnstoff, Maisquellwasser, Trockenhefe, Fleischextrakt, Pepton und Kaseinhydrolysat, verwendet vierden. Außer diesen
Bestandteilen müssen als zum Wachstum notwendige Faktoren Shikimisäure oder ihre Derivate (z.B. der Methylester und
Äthylester) dem Medium zugesetzt werden.
Natürlich können als Ersatz für Shikimisäure oder ihre Derivate auch aromatische Säuren, z.3. L-Tyrosin, L-Tryptophan,
L-Phenylalanin und deren Derivate (z.B. die Γ-'e.t.hyl ester,.
Äthylester, Äcetylate und Benzoylate) verwendet werden.
Die vorstehend genannten aromatischen Aminosäuren müssen nicht unbedingt reine Produkte sein. Beispielsweise können
ebenso gut Trockenhefe, Polypepton, Fleischextrakt, Kaseinhydrolysate
usw., die aromatische Aminosäuren enthalten, verwendet vierden. Bei Verwendung der vorstehend genannten aromatischen
Aminosäuren als Stickstoffquelle können sie daher in einem leichten Überschuß über den Bedarf als Stickstoffquelle
verwendet werden. Die Anhäufung von D-Ribose kann weiter gesteigert werden, indem dem Nährmedium eine zweibasische organische
Säure mit 2 bis 5 C-Atomen, z.B. Apfelsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Malonsäui-e
oder Glutarsäure oder ein Alkalisalz dieser Säuren, zugesetzt wird. Im allgemeinen liegt der Anteil dieser Säure vorzugsweise
im Bereich von 0,002 bis 0,2 Mol, insbesondere etwa 0,005 bis. 0,05 Mol.
Der Einfluß der Zugabe dieser zweibasischen Säuren auf die Anhäufung von D-Ribose bei Verwendung von Bacillus pumilus
Nr. 735 ergibt sich aus der folgenden Tabelle 4.
309881/0949 BADORtGfKAL
- 1
2 -
Anhäufung von D-Ribose, mg/ml
Zweibasische Zugesetzte Menge, g/l
organische Säure 6 0.1 0.3 0.5 1.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 10.0
Oxalsäure (C2O4H2) |
49 48 | 56 | 55 | 53 | 55 | 54 | 40 | 30 | 18 | 15 |
Malonsäure | - 50 | 54 | 56 | 58 | 57 | 56 | 53 | 50 | 50 | 45 |
Bernsteinsäure | - 48 | 53 | 57 | 56 | 58 | 57 | 56 | 52 | 52 | 40 |
Maleinsäure (C4O4H4) |
'- 50 | 55 | 60 | 58 | 59 | 59 | 57 | 55 | .45 | 37 |
Fumarsäure (C* f\ T-T N ν / ί Λ |
- 49 | 56 | 60 | 57 | 59 | 58 | 57 | 55 | 50 | 45 |
Glutarsäure (CsO4H8) |
- 50 | 52 | 54 | 55 | 54 | 55 | 55 | 54 | 45 | 38 |
Adipinsäure | - 48 | 50 | 48 | 30 | 32 | 15 | 10 | 10 | ||
Korksäure | - 51 | 35 | 28 | 15 | 17 | 10 | 12 | 8 | ||
Sebacinsäure <C10°4H18> |
- 38 | 20 | 15 | 10 | 12 | 15 | 5 | 5 |
Der typische Einfluß der Zugabe dieser zweibasischen organischen Säuren bei Verwendung von Bacillus pumilus Nr. 716 und
Bacillus subtilis Nr. βθ8 und Nr. 6j2 ergibt sich aus Tabelle
5.
309881/0949
Einfluß der Zugabe von zweibasischen organischen Säuren auf die Anhäufung von D-Ribose
Zweibasische
sehe Säure
Anhäufung von D-Ribose, mg/ml Bacillus Bacillus Bacillus
purnil us ■ subtil is '. subtil is
Verbindung
Menge Nr. 716 Nr. 6O8
Mr.
Oxalsäure | 0 | 42 | 45 | 48 |
500 | 56 | 55 | 56 | |
Malonsäure | 100 | 45 | 45 | 47 |
(C3H4O4) | 500 | 55 | 53 | 55 |
Maleinsäure | 100 | 45 | 46 | 48 |
(C1-H4O4.) | ■ 500 | . 59 | 57 | . 55 |
Fumarsäure | 500 | 58 | 55 | 54 |
Bernsteinsäure | 100 | 46 | 43 | 49 |
\ \J λ + *■£ vJ / / τ* O *4" |
500 | 55 | 52 | 53 |
Glutarsäure | 100 | 43 | 46 | 45 |
(C5H8O4) | 500 | 58 | 55 | 54 |
Adipinsäure | 500 | 45 | 44 | 37 |
Korksäure | 500 | 27 | 35 | 39 |
(C8O4H14) | ||||
Sebacinsäure | 500 | 8 | 21 | 29 |
(C10O4H18) |
Die Ergebnisse in Tabelle 4 und 5 wurden nach der gleichen
Kultivierungsmethode und der gleichen Bestimmungsmethode wie bei dem Versuch in Tabelle j5 erhalten*mit dem Unterschied,
daß die genannten Mengen der zweibasisehen organischen Säuren
dem Medium A zugesetzt wurden.
303881/0949
Wie die vorstehenden typischen Ergebnisse zeigen, bewirken zweibaslsohe organische Säuren eine Steigerung der Ausbeuten
an D-Ribose, wobei Maleinsäure besonders wirksam ist. Auf'er
den vorstehend genannten Bestandteilen können Magnesiumsulfat,
Calciurnphosphat, Calciumcarbonat usw. zugesetzt werden.
Die Mikroorganismen können nach Verfahren, die für die Kultivierung
von Mikroorganismen allgemein üblich sind, kultiviert werden, jedoch ist die Subtnerskultur am
Die Kultivierungstemperatur, der p„-V,Tert und die Kultivierungsdauer
sind weitgehend freigestellt, jedoch wird eine genügend große Menge D-Ribose gebildet und angehäuft, wenn der
Stamm 24 bis 120 Stunden bei 25 bis 45°C und einem p„-;.Tert
von 4,5 bis 8,5 kultiviert wird. - ' ■■·■".
Für die in dieser V/eise angehäufte D-Ribose aus dem Kulturmedium
wird ein Verfahren empfohlen, bei dem die Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt werden, das erhaltene
Filtrat oder der Überstand mit Aktivkohle und Ioneneustauscherharzen
zur Entfärbung bzw. Entsalzung behandelt, eingeengt und anschließend ein organisches Lösungsmittel, z.3.
A'thanol, zum Konzentrat gegeben und hierdurch die Kristallisation
der gewünschten Verbindung bevjirkt wird. Wenn das Fermentationsprodukt
durch andere Kohlenhydrate als die gev:üncchte
D-Ribose verunreinigt ist, können diese Kohlenhydrate durch Behandlung des Produkts mit Glukose, Oxydase oder -mit
einem Stamm eines Mikroorganismus, der D-Ribose nicht verwertet, aber die jevieiligen Kohlenhydrate verwertet, entfernt
werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Hierbei bedeutet die Abkürzung IFO "Institute for Fermentation Osaka", Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen
(g/100 ml), falls nicht anders angegeben.
309881/0949
Bacillus pumllus Nr. 716 (IPO 13522), der erhalten worden
war, indem der Ursprungestamm mehreren Dosen von UV-Strahlung
ausgesetzt worden war, wurde in 10 1 eines Mediums geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat
und 0,1 %> Monokal i umpho spha t enthielt. Das geimpfte
Medium wurde. 24 Stunden bei 36°C bebrütet, wobei eine Impfkultur
erhalten wurde. Mit dieser Impfkultür wurden 100 1
eines Mediums geimpft, das 15 % D-Glukose, 1,0 % Trockenhefe,
0,5 % Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCO^ und 100 mg L-Tryptophan
pro Liter enthielt, worauf 72 Stunden bei 36°C unter Belüftung
und Bewegung kultiviert wurde. Hierbei wurde D-Ribose in einer Menge von 45 g/l im Medium angehäuft. Diese D-Ribo-'se-Fermentationsbrühie
wurde zur Entfernung der Zellen filtriert. Das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte des ursprünglichen
Volumens eingeengt und dann mit Äthanol in einer Menge von etwa 1/4 seines Volumens versetzt. Die Fällung wurde verworfen
und die Losung mit einem Kationenaustauscherharz und einem Anionenaustauscherharz entsalzt und dann an einer Aktivkohlesäule
entfärbt. Die entfärbte Lösung wurde eingeengt und dann mit etwa dem 4-fachen Volumen Äthanol versetzt.
Hierbei wurden 3» 5^g kristalline D-Ribose erhalten.
Bacillus subtilis Nr. 6o8 (IFO 13323), der durch Behandlung
des Ursprungsstamms mit UV-Strahlung und anschließende Behandlung mit Nitrosoguanidin erhalten worden war, wurde in
10 1 eines Impfmediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung
geimpft. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 360C unter Belüftung und Bewegung bebrütet. Mit der erhaltenen
Impfkultür wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das
15 % D-Glukose, 1,2 % Trockenhefe, 0,3 # Ammoniumsulfat,
2,0 % CaHO-, und pro Liter 100 mg L-Phenylalanin, 50 mg
L-Tyroßin, 50 mg L-Tryptophan und 10 mg Shikimisäure enthielt,
geimpft. Das geimpfte Medium wurde 84 Stunden bei
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0C unter Belüftung und Rühren bebrütet, wobei 45,5 g D-Ribose
pro Liter im Medium angehäuft wurden.
Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium entfernt und das FiI-trat
auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Hierbei wurden 3,5 kg kristalline D-Ribose erhalten.
Mit dem in Beispiel 1 verwendeten Stamm Bacillus pumilus
Nr. 716 (IFO I3322) wurden 10 1 eines Mediums geimpft, das '
2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat und
0,1 % Monokaliumphosphat enthielt. Das geimpfte Medium wurde
24 Stunden bei 37°C kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15 % D-Glukose, 1,0 ','
Trockenhefe, 0,5 % Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCO, und pro Liter
50 mg L-Tryptophan, 50 mg L-Tyrosin, 50 mg L-Phenylalanin und
500 mg Maleinsäure enthielt. Das geimpfte Medium wurde unter Belüftung und Bewegung 90 Stunden bei 37°C bebrütet. Nach
dieser Zeit betrug die angehäufte Menge D-Ribose 60 mg/ml. Das Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene
V/eise aufgearbeitet, wobei 4,5 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden.
Der in Beispiel 2 verwendete Mutant von Bacillus subtil is Nr. 608 (IFO I3323) wurde in 10 1 eines Medium geimpft, das
2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat und
0,1 % Monokaliumphosphat enthielt, und 24 Stunden bei 360C
kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15$ D-Glukose, 2,0 % Trockenhefe, 0,5 56
Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCOv und 750 mg. Maleinsäure/l enthielt.
Das geimpfte Medium wurde 72 Stunden bei 37°C unter Belüftung und Bewegung bebrütet, wobei D-Ribose "in einer Menge von
55*5 g/l im Medium angehäuft wurde.
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Das Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Hierbei wurden 4,3 kg kristalline D-Riböse
erhalten.
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Claims (13)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, dessen Transitetolaseaktivitat Null beträgt, so kultiviert, daß er D-Ribose bildet und anhäuft und die hierbei angehäufte D-Ribose aus dem erhaltenen Kulturmedium isoliert.
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, dessen nach der in der Beschreibung beschriebenen Methode bestimmte Transketolaseaktlvität wenigstens bis zur dritten Dezimalstelle Null beträgt.
- 3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem Nänrmediuin kultiviert wird, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und für das Wachstum des Mikroorganismus notwendige Paktoren enthält.
- 4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis J, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium als Faktoren, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, L-Tyrosin oder sein Derivat und L-Tryptophan oder sein Derivat und L-Phenylalanin oder sein Derivat enthält.
- 5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Medium als Faktor, der für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig ist, Shikimisäure oder ein Shikimisäurederivat enthält.
- 6) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5*"dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus im Kulturmedium bei einer Temperatur_von 25 bis 45°C unter aeroben Bedingungen kultiviert wird.
- 7) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dem Medium für die Kultivierung des Mikroorganismus eine zweibasische organische Säure zugesetzt wird, um den Mikroorganismus zu veranlassen, D-Ribose zu bilden und anzuhäufen.
- 8) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Mutant von Bacillus pumilus verwendet wird.
- 9) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 716 (IPO 1^522) verwendet wird.
- 10) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7* dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet wird.
- 11) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7 und 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus subtilis Nr. 608 (IFO I3325) verwendet wird.
- 12) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als zweibasische Säure eine aliphatische zweibasische Säure mit 2 bis 5 C-Atomen verwendet wird.
- 13) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als aliphatische zweibasische Säuren Apfelsäure. Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Glutarsäure oder Alkali sal ze dieser Säuren verwendet werden.309681/0949
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