DE2330426A1

DE2330426A1 - Verfahren zur herstellung von d-ribose

Info

Publication number: DE2330426A1
Application number: DE19732330426
Authority: DE
Inventors: Ken-Ichi Sasajima; Masahiko Yoneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-06-17
Filing date: 1973-06-15
Publication date: 1974-01-03
Also published as: FR2189513A1; FR2189513B1; NL175735C; NL175735B; DE2330426C2; NL7308369A; CA996483A; IT986911B; JPS5016878B2; GB1406182A; DK134569B; CH585790A5; JPS4920388A; DK134569C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Bacillus gehörenden, D-Ribose bildenden Mikroorganismus, dessen Transketolaseaktivitat Null ist, in einem Kultur-' medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie die zum Wachstum des Stammes notwendigen Paktoren enthält, und hierdurch den Stamm veranlaßt, sich zu entwickeln und D-Ribose anzuhäufen, und die hierbei angehäufte D-Ribose aus dem erhaltenen Kulturmedium isoliert.

Als Bestandteil von Nucleinsäuren kommt D-Ribose in allen Organismen vor. Ribitol, ein Reduktionsprodukt von D-Ribose, ist in Vitamin Bk und Ribitol-Teichonsäure, einem Bestandteil der ' Zellmembranen, vorhanden. Sie ist sora^t eine physiologisch sehr wichtige Substanz. Ferner haben D-Ribose und ihre Derivate bisher starke Aufmerksamkeit als Ausgangsmaterialien für die Synthese von Vitamin Bp und die sogenannten Nucleinsäure- · würzen auf sich gezogen, so daß die Entwicklung eines großtechnischen Verfahrens zur Herstellung von D-Ribose sehr erwünscht ist.

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Zu den üblichen Verfahren zur Herstellung von D-Ribose gehören Methoden, bei denen die D-Ribose aus Naturprodukten extrahiert wird, und Syntheseverfahren unter Verwendung von Furan, D-Glukose usw. als Ausgangsniaterialien. Es wurde ferner über die fermentative Erzeugung von D-Ribose berichtet, aber die Ausbeuten der Fermentation sind äußerst niedrig. Diese Verfahren sind somit nicht völlig befriedigend für die Großherstellung von· D-Ribose.

Von der Anmelderin wurden bereits Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus vorgeschlagen. Bei diesen Verfahren wird ein D-Ribose bildender Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der L-Tyrosin, L-Tryptophan'und L-Phenylalanin zum'Wachstum benötigt, (diese Mikroorganismen werden nachstehend als "Aminosäuren benötigende Mikroorganismen" bezeichnet) oder dem Transketolaseaktivität fehlt (nachstehend werden diese Mikroorganismen als "Kikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität" bezeichnet), verwendet.

Das erstgenannte Verfahren, bei dem Aminosäuren benötigende Organismen verwendet werden, wird in der britischen Patentschrift 1.255*25^ und das letztgenannte Verfahren, bei dem Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität verwendet werden, in "Agricultural and Biological Chemistry", Band 35, Nr. 4, Seite 509 (1971), beschrieben.

Die bei diesen Verfahren erhaltene Ausbeute an D-Ribose liegt zwischen etwa 20 und J>0 mg/ml Kulturmedium.

Sowohl die Mikroorganismen, die Aminosäuren benötigen, als auch die Mikroorganismen, denen Transketolase fehlt, haben eine äußerst geringe Transketolaseaktivität. Insbesondere würde bei den letztgenannten Mikroorganismen aufgrund von •,Versuchen, in denen die Aktivität nach der nachstehend beschriebenen Methode von B.L. Horecker und Mitarbeitern

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(Journal of Biological Chemistry, Band 225, Seite 1009 gemessen wurde, angenommen, daß sie. keine Transketolase enthalten.

I. Herstellung der rohen Enzymlösung

Die Schrägkultur eines Stammes, dessen Transketolaseaktivität bestimmt werden soll, wird in 200 ml eines modifizierten Spizizen-Mediums (Agricultural and Biological Chemistry, Band 34, Nr. 3, Seite 38I (1970)) überführt, das 0,4 % (NH₄^SO₄, 1,4 % K₂HPO₄, 0,6 % KH₂PO₄, 0,02 % MgSO₄-TH₃O, 0,0004 % Biotin, 0,0068 % Adenin, 0,014 % Guanosin, 0,5 %> Sorbit und 0,5 ^ Natrium-L-glutamat als Kohlenstoffquellen enthält und. in einem. 1 1-Kolben enthalten ist, und bei 37 C. auf einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. Nach einer Kultivierungsdauer von 16 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugieren isoliert, mit einer 0,01-molaren Tris-(hydroxymethyl)aminoiTiethan-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), die 0,001 Mol Mercaptoäthanol enthält, gewaschen und in der gleichen Pufferlösung so suspendiert, daß die Extinktion der Zellsuspension bei 650 mn 10 beträgt. Dann wird Lysozym der Zellsuspension in einer Konzentration von 5Qfcß/ml zugesetzt. Die Suspension wird 90 Minuten bei 37°C bebrütet. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (1,2x10 g) entfernt. Die klare Lösung wird als Enzymlösung verwendet.

II. Herstellung von Reaktionslösungen

Reaktionslösung A:

20 /U-MoI D-Ribose-5-phosphat, 0,5 η-Mol NADH, D-Ribose-5-phosphatisomerase, D-Ribose-5-phosphatepimerase, 0,66 Einheiten a-Glycerophosphatdehydrogenase, die Triosephosphatisomerase enthält, und 60 u-Mol Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl Pufferlösung (pH 7,5).

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Reaktionslösung_B:

2Oa-MoI MgCl₂, 0,4^ u-Mol Thiaminpyrophosphat, 40 Ai-Tris(hydroxymethyi)aminomethan-HCl-Pufferlösung (pH 7*5) und eine gegebene ^ivlenge der Enzymlösung.

III. Bestimmung der Transketolaseaktivität

Jede Reaktionslösung wird 10 Minuten bei J>0°0 bebrütet. Die Reaktionslösungen werden dann gemischt (Gesamtvolumen 2 ml), worauf ihre Extinktion bei J>hQ nyi im Laufe der Zeit gemessen wird. Die Transketolaseaktivität (u-Mol/Min./mg Protein) in der Enzymlösung wird durch die folgende Formel ausgedrückt:

AE ^x

^x vx d χ Ε χ ρ Hierin ist -Δε,^/». die Geschwindigkeit der Abnahme der reinen Absorption der gemischten Reaktionslösung bei ^40 mu für 1 Minute, V das Gesamtvolumen des Gemisches der Reaktions lösungen (2 ml), 2H der molare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 mu (6,22 cm²/u-Mol),. d der Lichtweg (1 cm), E das Volumen der Enzymlösung (0,1 ml) und ρ das Gewicht des Proteins in der Enzymlösung (mg/ml).

Als Testmikroorganismen wurden bekannte Stämme von Aminosäuren benötigende Mikroorganismen, nämlich Bacillus pumilus Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtil is Nr. 429 (britische Patentschrift 1.255.254) sowie Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität, nämlich die Bacillus species Shi 5 und Shi 7 (Agricultural and Biological Chemistry, Band 35, Nr. 4, Seite 509 (1971)), verwendet. Zum Vergleich wurden Wildstämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis verwendet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

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BAD ORKSlNAL Tabelle 1

Mikroorganismus

Protein optische Transke tolaseakt ivi tat, (mc/ml) Dichte (u-Mol/ (-AE_Vn/ 4-Un./mg

Min?)

Bacillus	pumilus
(wild	strain)
Bacilliis	pumilus
No. W5
Bacillxis	pumi-luH
No«557
Bacillus	subtilis
(wild	strain)
Bacillus	subtilis
No.429
Bacillus	species
Shi 5
Bacillus	species

2.2

1*8

2*0

0.165

1.9 < 0.005

0i005

0.24

0.00

OtOOO 0*15

Shi 7

1.7 < 0.005 0.00 1.8 < 0.005 0.00 1.9 < 0.005 0.00

Bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung dor Transketolaseaktivität wurde als Enzymlösung die klare Lösung als solche verwendet, und die Aktivität wurde zumindest bis hinab zur zweiten Dezimalstelle mit Null ermittelt. Bei dieser Methode wurde jedoch keine wesentliche Zahl an der dritten Dezimalstelle gefunden.

V/eitere Untersuchungen über die Bestimmung der Transketolaseaktivität führten zur Entwicklung einer Methode, bei der die Berechnung der TransketolaseaktivitäV richtig bis hinab zur dritten Dezimalstelle an einer konzentrierten Lösung, die durch Ultrafiltration der Enzymlösung bei der vorstehend beschriebenen Bestimmungsmethode erhalten wird, vorgenommen werden kann. Hierbei wird die Enzymlösung durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, z.B. der DIAFLO-Membran.PM 10 (Hersteller: Amicon Corporation, USA), konzentriert, bis sie etwa 1/10 ihres ursprünglichen VoIu-

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mens hat. Von der Anmelderin wurde die in dieser Weise konzentrierte Lösung als Enzymlösung verwendet.

Bei dieser Methode zeigte es sieh, daß die Transketolaseaktivität der Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen und der Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität an der dritten Dezimalstelle nicht Mull betrug. Weitere Untersuchungen der Stämme und Kultivierungsmethoden führten zu der Peststellung, daß Stämme, deren Transketolaseaktivität wenigstens bis zur dritten Dezimalstelle Null ist, D-Ribose in größerer Menge als die Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen und die Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität anzuhäufen vermögen, und daß die angehäufte Menge •etwa 40 bis 50 mg/ml Kulturmedium, das nach den bekannten Verfahren erhalten wird, betragen kann. Es wurde ferner gefunden, daß die Stämme, deren Transketolaseaktivität bis wenigstens zur dritten Dezimalstelle Null beträgt (nachstehend einfach als "die Mikroorganismen" bezeichnet), eine wesentlich größere D-Ribosemenge anhäufen, wenn sie in Gegenwart einer zweibasischen organischen Säure kultiviert werden. Die vorstehend genannten Feststellungen, liegen der Erfindung zugrunde.

Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mikroorganismen können unter Verwendung von WiIdstammen, wie Bacillus puir.jlus, Bacillus subtilis usw. als Ausgangsstämme und Bestrahlung dieser Stämme beispielsweise mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen oder γ-Strahlen oder durch Behandlung mit einem Mutagen, z.B. Nitrosoguanidin, erhalten werden. Für die Zwecke der Erfindung eignen sich beispielsweise die Stämrre Bacillus pumilus Nr. 716, Nr. 755 und Nr. 783 und Bacillus subtilis Nr. 608 und Nr. 632. In Tabelle 2 ist die Transketolaseaktivität dieser Stämme im Vergleich zu Bacillus pumilus Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtilis -Nr. 429, Bacillus species Shi 5 und Shi 7 angegeben. Diese Werte wurden unter Verwendung der Enzymlösung als solche (Methode I) und der konzentrierten Enzymlösung (Methode II) ermittelt. 309881/0949

. BAD ORIGINAL

Tabelle

Relative Transketoiaseaktivitäten

Methode I Methode II

Mikroorganismus mg/ml

3acillu3 pusiilus (ViId strainT

Bacillus pumilus No:503

Bacillus pumilus No.537

Bacillus pumilus No.716

Bacillus pumilus No.735

Bacillus pumilus No.783

Protein Extinktion Transketoiase-

Bacillus subtilis (wild strain)

Bacillus subtilis ϊίο.4^9

2.2 1.9 1.8 2.0 2.0 2.2

2.0 1.7

"^ΔΕ"54Ο/Μ1η aktivität y*j/win. „.

Protein Extinktion Transketolasemg/ml

0.165

< 0.005

0.080 < 0.005

'Protein

0.24

0.00 (< 0.01)

0.13

0.00 (< 0.01) 100

100

Il-

19 ~L

19.0

20.3

19.8

23.0

20*0

0.030

0.045

< 0.005

< 0*005

0.025

0.005 0.008

JlCO₁ 2 3

0.000« 0.001)

0.000(< 0.001)

0.004

100 3

Methode I Methode II

Protein Extinktion Transketolase-Mikroorganismus mg/ml -δΕ,ι,_λλ»- aktivität

Bacillus subtilis
No.608

ο Bacillus subtilis

co No. 6^2

oo

oo Bacillus species
-· 3hi 5

Bacillus species
Shi 7

yU-Mol/Min./mg 'Protein Protein Extinktion Trar.sketolasemg/ml -AE, n _Q//_Mln> aktivität

yU-Mol/Min./^S ^/Proteln .

0.00 (< 0.01)

< 0.005

! 19.8

0.000(. < 0.001)

0.000(< 0.001)

0.007
0.007

NJ CJ CO

In Tabelle 3 ist die Fähigkeit der vorstehend genannten Stamme zur Bildung von Ribose nach der nachstehend genannten Methode angegeben:

(platindraht)
Eine Imprnade^nenge der Schrägkultur des Testmikroorganistius wurde in 20 ml eines Mediums geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliurnhydrogenphosphat, 0,1 % Kaliur.¹.-dihydrogenphosphat, 100 γ/ml L-Tryptophan, 100 γ/ml L-Phenylal.anin und 100 γ/ml L-Tyrosin enthielt und in einem 200 rr.l-Kolben enthalten war.. Eine Impfkultur wurde hergestellt, indem 16 Stunden bei.37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 200 Upm bebrütet wurde.

•2 ml· eier Impfkultür 'wurden in 20 ml eines Kauptkulturnediur.s (nachstehend als Medium A bezeichnet) überführt, das 15 % D-Glukose, 1,5 % Trockenhefe, 0,5 % Arr.moniurr,sulfat, 2 % CaI-ciumcarbonat, 100 7/ml L-Tryptophan, 100 γ/ml L-Phenylalanin und 100 γ/ml L-Tyrosin enthielt und in einem 200 ml-Kolben enthalten war. Die Bebrütung wurde 6 Tage bei /7°C auf einerrotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 Upm vorgenommen.

Die in den Kulturmedien angehäufte Menge der D-Ribose wurde nach der Methode bestimmt, die in "Agricultural and Biological Chemistry", Band 35, Seite 509 (1971), beschrieben ist.

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■- Io -

Tabelle 5 ' Fähigkeit zur Ribose-Bildung

Mikroorganismus angehäufte D-Ribose . _t mg/ml ]

Bacillus pumilus (V/ildstamm) 0

Bacillus pumilus Nr. 505 29

Bacillus pumilus Nr. 537 28

Bacillus pumilus Ur. 716 45

Bacillus pumilus Hr. 735 49

Bacillus punilus Nr. 783 47

Bacillus subtilis (V/ildstamm) 0

Bacillus subtilis Nr. 429 ' ' 26 '

Bacillus subtilis Nr. βθ8 4-5

Bacillus subtilis Nr. 63 48

Bacillus species Shi 5 31

Bacillus species Shi 7 27

Die Mikroorganismen haben die genetischen Merkmale, daß sie nicht auf Kohlehydraten, wie D-Glukonsäure, L-Arabinose und D-Ribose als ausschließliche Kohlenstoffquellen wachsen können und daß sie zum Wachstum Shikimisäure oder gleichwertige Substanzen, wie L-Tyrosin, L-Tryptophan oder L-Phenylalanin benötigen.

Weitere genetische und biochemische Merkmale, in denen diese Stämme sich von den ursprünglichen Mikroorganismen und den bekannten Stämmen unterscheiden, bestehen darin, daß ihre Transketolaseaktivität unter der zur Zeit bekannten Grenze der Nachweisbarkeit liegt und ihre Entwicklung und die Anhäufung von D-Ribose sehr hoch sind.

Zur Kultivierung der Mikroorganismen können als Kohlenstoff-309831/09 49

- ii -

quellen D-Glukose, D-Fruktose, D-iiannose, Sorbit, D-Mannit, Saccharose, Maltose, Dextrin, lösliche Stärke, ausgebrauohte Melasse usw. und als Stickstoffquellen verschiedene anorganische und organische Stickstoffverbindungen und diese ent- ' haltende Substanzen, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff, Maisquellwasser, Trockenhefe, Fleischextrakt, Pepton und Kaseinhydrolysat, verwendet vierden. Außer diesen Bestandteilen müssen als zum Wachstum notwendige Faktoren Shikimisäure oder ihre Derivate (z.B. der Methylester und Äthylester) dem Medium zugesetzt werden.

Natürlich können als Ersatz für Shikimisäure oder ihre Derivate auch aromatische Säuren, z.3. L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Phenylalanin und deren Derivate (z.B. die Γ-'e.t.hyl ester,. Äthylester, Äcetylate und Benzoylate) verwendet werden.

Die vorstehend genannten aromatischen Aminosäuren müssen nicht unbedingt reine Produkte sein. Beispielsweise können ebenso gut Trockenhefe, Polypepton, Fleischextrakt, Kaseinhydrolysate usw., die aromatische Aminosäuren enthalten, verwendet vierden. Bei Verwendung der vorstehend genannten aromatischen Aminosäuren als Stickstoffquelle können sie daher in einem leichten Überschuß über den Bedarf als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Anhäufung von D-Ribose kann weiter gesteigert werden, indem dem Nährmedium eine zweibasische organische Säure mit 2 bis 5 C-Atomen, z.B. Apfelsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Malonsäui-e oder Glutarsäure oder ein Alkalisalz dieser Säuren, zugesetzt wird. Im allgemeinen liegt der Anteil dieser Säure vorzugsweise im Bereich von 0,002 bis 0,2 Mol, insbesondere etwa 0,005 bis. 0,05 Mol.

Der Einfluß der Zugabe dieser zweibasischen Säuren auf die Anhäufung von D-Ribose bei Verwendung von Bacillus pumilus Nr. 735 ergibt sich aus der folgenden Tabelle 4.

309881/0949 BADORtGfKAL

- 1

2 -

Tabelle

Anhäufung von D-Ribose, mg/ml

Zweibasische Zugesetzte Menge, g/l

organische Säure 6 0.1 0.3 0.5 1.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 10.0

Oxalsäure (C₂O₄H₂)	49 48	56	55	53	55	54	40	30	18	15
Malonsäure	- 50	54	56	58	57	56	53	50	50	45
Bernsteinsäure	- 48	53	57	56	58	57	56	52	52	40
Maleinsäure (C₄O₄H₄)	'- 50	55	60	58	59	59	57	55	.45	37
Fumarsäure (C f\* T-T N ν / ί Λ	- 49	56	60	57	59	58	57	55	50	45
Glutarsäure (CsO₄H₈)	- 50	52	54	55	54	55	55	54	45	38
Adipinsäure	- 48	50	48	30	32		15		10	10
Korksäure	- 51	35	28	15	17		10		12	8
Sebacinsäure <^C10°4^H18>	- 38	20	15	10	12		15		5	5

Der typische Einfluß der Zugabe dieser zweibasischen organischen Säuren bei Verwendung von Bacillus pumilus Nr. 716 und Bacillus subtilis Nr. βθ8 und Nr. 6j2 ergibt sich aus Tabelle 5.

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Tabelle "3

Einfluß der Zugabe von zweibasischen organischen Säuren auf die Anhäufung von D-Ribose

Zweibasische

sehe Säure

Anhäufung von D-Ribose, mg/ml Bacillus Bacillus Bacillus purnil us ■ subtil is '. subtil is

Verbindung

Menge Nr. 716 Nr. 6O8

Mr.

Oxalsäure	0	42	45	48
	500	56	55	56
Malonsäure	100	45	45	47
(C₃H₄O₄)	500	55	53	55
Maleinsäure	100	45	46	48
(C₁-H₄O₄.)	■ 500	. 59	57	. 55
Fumarsäure	500	58	55	54
Bernsteinsäure	100	46	43	49
\ \J λ + ■£* vJ / / τ* O *4"	500	55	52	53
Glutarsäure	100	43	46	45
(C₅H₈O₄)	500	58	55	54
Adipinsäure	500	45	44	37
Korksäure	500	27	35	39
(C₈O₄H₁₄)
Sebacinsäure	500	8	21	29
(C₁₀O₄H₁₈)

Die Ergebnisse in Tabelle 4 und 5 wurden nach der gleichen Kultivierungsmethode und der gleichen Bestimmungsmethode wie bei dem Versuch in Tabelle j5 erhalten*mit dem Unterschied, daß die genannten Mengen der zweibasisehen organischen Säuren dem Medium A zugesetzt wurden.

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Wie die vorstehenden typischen Ergebnisse zeigen, bewirken zweibaslsohe organische Säuren eine Steigerung der Ausbeuten an D-Ribose, wobei Maleinsäure besonders wirksam ist. Auf'er den vorstehend genannten Bestandteilen können Magnesiumsulfat, Calciurnphosphat, Calciumcarbonat usw. zugesetzt werden.

Die Mikroorganismen können nach Verfahren, die für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein üblich sind, kultiviert werden, jedoch ist die Subtnerskultur am Die Kultivierungstemperatur, der p„-V,^Tert und die Kultivierungsdauer sind weitgehend freigestellt, jedoch wird eine genügend große Menge D-Ribose gebildet und angehäuft, wenn der Stamm 24 bis 120 Stunden bei 25 bis 45°C und einem p„-;.^Tert

von 4,5 bis 8,5 kultiviert wird. - ' ■■·■".

Für die in dieser V/eise angehäufte D-Ribose aus dem Kulturmedium wird ein Verfahren empfohlen, bei dem die Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt werden, das erhaltene Filtrat oder der Überstand mit Aktivkohle und Ioneneustauscherharzen zur Entfärbung bzw. Entsalzung behandelt, eingeengt und anschließend ein organisches Lösungsmittel, z.3. A'thanol, zum Konzentrat gegeben und hierdurch die Kristallisation der gewünschten Verbindung bevjirkt wird. Wenn das Fermentationsprodukt durch andere Kohlenhydrate als die gev:üncchte D-Ribose verunreinigt ist, können diese Kohlenhydrate durch Behandlung des Produkts mit Glukose, Oxydase oder -mit einem Stamm eines Mikroorganismus, der D-Ribose nicht verwertet, aber die jevieiligen Kohlenhydrate verwertet, entfernt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Hierbei bedeutet die Abkürzung IFO "Institute for Fermentation Osaka", Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen (g/100 ml), falls nicht anders angegeben.

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BAD ORKSfNAL Beispiel 1

Bacillus pumllus Nr. 716 (IPO 13522), der erhalten worden war, indem der Ursprungestamm mehreren Dosen von UV-Strahlung ausgesetzt worden war, wurde in 10 1 eines Mediums geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat und 0,1 %> Monokal i umpho spha t enthielt. Das geimpfte Medium wurde. 24 Stunden bei 36°C bebrütet, wobei eine Impfkultur erhalten wurde. Mit dieser Impfkultür wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15 % D-Glukose, 1,0 % Trockenhefe, 0,5 % Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCO^ und 100 mg L-Tryptophan pro Liter enthielt, worauf 72 Stunden bei 36°C unter Belüftung und Bewegung kultiviert wurde. Hierbei wurde D-Ribose in einer Menge von 45 g/l im Medium angehäuft. Diese D-Ribo-'se-Fermentationsbrühie wurde zur Entfernung der Zellen filtriert. Das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt und dann mit Äthanol in einer Menge von etwa 1/4 seines Volumens versetzt. Die Fällung wurde verworfen und die Losung mit einem Kationenaustauscherharz und einem Anionenaustauscherharz entsalzt und dann an einer Aktivkohlesäule entfärbt. Die entfärbte Lösung wurde eingeengt und dann mit etwa dem 4-fachen Volumen Äthanol versetzt. Hierbei wurden 3» 5^g kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 2

Bacillus subtilis Nr. 6o8 (IFO 13323), der durch Behandlung des Ursprungsstamms mit UV-Strahlung und anschließende Behandlung mit Nitrosoguanidin erhalten worden war, wurde in 10 1 eines Impfmediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung geimpft. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 36⁰C unter Belüftung und Bewegung bebrütet. Mit der erhaltenen Impfkultür wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15 % D-Glukose, 1,2 % Trockenhefe, 0,3 # Ammoniumsulfat, 2,0 % CaHO-, und pro Liter 100 mg L-Phenylalanin, 50 mg L-Tyroßin, 50 mg L-Tryptophan und 10 mg Shikimisäure enthielt, geimpft. Das geimpfte Medium wurde 84 Stunden bei

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⁰C unter Belüftung und Rühren bebrütet, wobei 45,5 g D-Ribose pro Liter im Medium angehäuft wurden.

Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium entfernt und das FiI-trat auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Hierbei wurden 3,5 kg kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 3

Mit dem in Beispiel 1 verwendeten Stamm Bacillus pumilus Nr. 716 (IFO I3322) wurden 10 1 eines Mediums geimpft, das ' 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat und 0,1 % Monokaliumphosphat enthielt. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 37°C kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15 % D-Glukose, 1,0 ',' Trockenhefe, 0,5 % Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCO, und pro Liter 50 mg L-Tryptophan, 50 mg L-Tyrosin, 50 mg L-Phenylalanin und 500 mg Maleinsäure enthielt. Das geimpfte Medium wurde unter Belüftung und Bewegung 90 Stunden bei 37°C bebrütet. Nach dieser Zeit betrug die angehäufte Menge D-Ribose 60 mg/ml. Das Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene V/eise aufgearbeitet, wobei 4,5 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden.

Beispiel 4

Der in Beispiel 2 verwendete Mutant von Bacillus subtil is Nr. 608 (IFO I3323) wurde in 10 1 eines Medium geimpft, das 2 % Sorbit, 2 % Maisquellwasser, 0,3 % Dikaliumphosphat und 0,1 % Monokaliumphosphat enthielt, und 24 Stunden bei 36⁰C kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15$ D-Glukose, 2,0 % Trockenhefe, 0,5 56 Ammoniumsulfat, 2,0 % CaCO_v und 750 mg. Maleinsäure/l enthielt. Das geimpfte Medium wurde 72 Stunden bei 37°C unter Belüftung und Bewegung bebrütet, wobei D-Ribose "in einer Menge von 55*5 g/l im Medium angehäuft wurde.

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Das Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Hierbei wurden 4,3 kg kristalline D-Riböse erhalten.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, dessen Transitetolaseaktivitat Null beträgt, so kultiviert, daß er D-Ribose bildet und anhäuft und die hierbei angehäufte D-Ribose aus dem erhaltenen Kulturmedium isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, dessen nach der in der Beschreibung beschriebenen Methode bestimmte Transketolaseaktlvität wenigstens bis zur dritten Dezimalstelle Null beträgt.
3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem Nänrmediuin kultiviert wird, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und für das Wachstum des Mikroorganismus notwendige Paktoren enthält.
4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis J, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium als Faktoren, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, L-Tyrosin oder sein Derivat und L-Tryptophan oder sein Derivat und L-Phenylalanin oder sein Derivat enthält.
5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Medium als Faktor, der für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig ist, Shikimisäure oder ein Shikimisäurederivat enthält.
6) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5*"dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus im Kulturmedium bei einer Temperatur_von 25 bis 45°C unter aeroben Bedingungen kultiviert wird.
7) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dem Medium für die Kultivierung des Mikroorganismus eine zweibasische organische Säure zugesetzt wird, um den Mikroorganismus zu veranlassen, D-Ribose zu bilden und anzuhäufen.
8) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Mutant von Bacillus pumilus verwendet wird.
9) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 716 (IPO 1^522) verwendet wird.
10) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7* dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet wird.
11) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7 und 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus subtilis Nr. 608 (IFO I3325) verwendet wird.
12) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als zweibasische Säure eine aliphatische zweibasische Säure mit 2 bis 5 C-Atomen verwendet wird.
13) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als aliphatische zweibasische Säuren Apfelsäure. Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Glutarsäure oder Alkali sal ze dieser Säuren verwendet werden.

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