DE2849393C2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 2,5-DiketogluconsäureInfo
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
20
24-Diketogluconsäure ist ein brauchbares Zwischenprodukt bei der Synthese von Vitamin C Bislang wurde
24-Diketogluconsäure von mehreren unterschiedlichen Arten von Bakterien wie Acetobacter melanogenum,
Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens und Pseudomonas
sesami gebildet Die Verwendung dieser Mikroorganismen ist jedoch vom technischen Standpunkt aus nicht
vollständig zufriedenstellend wegen der großen Mengen an braunen oder gelblichbraunen Pigmenten als
Nebenprodukten der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gleichzeitig gebildeten 24-Diketogluconsäure
*?nnindert wird.
In der US-Patentschrift 37 90 444 ist die Bildung von 24-Diketogluconsäure ohne begleitendes, braunes Pigment
durch eine neue Species, welche als Acetobacter fragum bezeichnet wird, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von 24-Diketoglucon- «
säure unter Verwendung von leicht zugänglichen, öffentlich aufbewahrten Mikroorganismen der Species
Acetobacter cerinus.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 24-Diketogluconsäure,
dadurch gekennzeichnet, daß man Acetobacter cerinus IFO 3263 oder IFO 3266 in einem Medium, dessen
Glucosekonzentration 24 bis 20% und anfänglicher pH-Wert 34 bis 74 betragen, bei 20 bis 35'C aerob
züchtet, wobei der pH-Wert während der Fermentation
bei etwa 54 gehalten wird, und die erhaltene 24-Diketogluconsäure gewinnt Die 24'Diketogluconsäure
wird hierbei in Ausbeuten von >95%, bezogen auf Glucose, gebildet
24-Diketogluconsäure ist als Zwischenprodukt zur Herstellung von Ascorbinsäure brauchbar. Eine wäßrige
Lösung von 24'Diketogluconsäure kann selektiv reduziert werden, um ein Gemisch von 2-Ketogulotiat und
2-Ketogluconat zu bilden, welche zu Ascorbinsäure und Brylhi obinsäure (Isoascorbinsäure) umgewandelt wer' so
den können.
24-Diketogluconsäure wird einfach durch die bakterielle Wirkung auf Glucose gebildet Die Anmelderin hat
die nachstehend aufgeführten, öffentlich zugänglich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus unter- «
sucht, die alle Ketosäuren in einer Ausbeute von 50 bis 95%, bezogen auf Glucose, bildeten. Wenn Acetobacter
cerinus IFO 3263 oder 3266 verwendet wird, besteht die gbfldet^tQijäHre vollständig aus der gewünschten
24-DiHetoglnconsmjre in Ausbeuten von ?-95%, bezogen auf Glucose, Folgende Stimme γορ. Acetobacter
cerinus sind öffentlich zugänglich; Vi.' .-
IFO 3262 (ATCC 1230313263,3264,3265,3266,
3267,3268 und 3269,
3267,3268 und 3269,
Der Mikroorganismus wird jn einem Medium
gezüchtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle Glucose ist
Dieser Mikroorganismus erfordert keine kostspieligen ' Quellen für organischen Stickstoff wie Pepton oder
Fleischextrakt Wenn Harnstoff und Quellen für anorganischen Stickstoff wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat
oder Ammoniumphosphat verwendet werden, wird Nikotinsäure als essentieller Wachstumsfaktorzugesetzt
Die Glucosekonzentration in dem Mediam variiert
zwischen 24 und 20%, vorzugsweise zwischen 10 und 12%, um 24-DiketogIuconsäure in besonders wirtschaftlicher
Weise zu erhalten. Die Fermentationstemperatur liegt zwischen 20°Cund 35°Cund vorzugsweise
zwischen 25 und 300C, ganz besonders bevorzugt in der
Nähe von 28°G Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums
kann von 34 bis 74 und vorzugsweise von 5 bis 6 variieren. Im Verlauf der Fermentation wird der
pH-Wert bei etwa 54 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung gehalten. Calciumcarbonat kann zur
pH-Steuerung verwendet werden, und es wird in einem Ansatzmedium nach der Autoklavenbehandlung in
einer Menge von 30 g pro 110 g Glucose zugesetzt
Nach dem Impfen wird das Fermentationsmedium mit einem mechanischen Rührer bei etwa 1700 UpM
gerührt, und es wird in einer Rate von 04 bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Brühe pro Minute belüftet
Die Fermentation wird so lange durchgeführt, bis eine
Ausbeute an 24-Diketogluconsäure von wenigstens 90%, bezogen auf Glucose, erhalten wird, wobei dies
üblicherweise 36 bis 40 Stunden erfordert
Papierchromatografisch wurde bestimmt, daß die
Umwandlung von Glucose zu 24-Diketogluconsäure auf folgenden Wegen verläuft:
— ■ 24-Diketogluconsäure
Glucose ->■ 5-KetogIuconsäure
Glucose ->■ 5-KetogIuconsäure
-* 24-Diketogluconsäure
Als Chromatografierpapier wurde handelsübliches
Filterpapier (Whatman No. 1 und Nt.. 4) verwendet, als
Lösungsmittelsystem Methyläthylketon zu Aceton zu Ameisensäure zu Wasser (80:6 :2 :12). Die Flecken der
Säure wurden durch Besprühen mit einer 0,2%igen äthanolischen Lösung von o-Phenylendiamin, welche
1% Salpetersäure enthielt, und Erwärmen auf etwa 70*C lokalisiert, wobei 5-Ketogluconsäure eine blaue
Färbung, 2-Ketogluconsäure eine gelbe Färbung und 24-Diketogluconsäure eine grüne Färbung ergab. Zur
Identifizierung kann ebenfalls die Hochdruckflüssigkeitschromatografie
eingesetzt werden.
23-Diketoglueonsäure kann aus der zum Schluß
erhaltenen Fermentationsbrühe nach jeder beliebigen, dem Fachmann an sich bekannten, konventionellen
Arbeitsweise abgetrennt und gewonnen werden, Die filtrierte Fermentationsbrühe kann als solche durch
Behandlung mit einem Borhydrid weiterverarbeitet werden, und das erhaltene Gemisch von 2-Ketogluconsäure
und 2-Ketogulonsäure kann unter Bildung von
Ascorbinsäure und ErythorbinsSure hydrolysiert wer*
den,
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert,
Das folgende wäßrige Impfmedmm wurde hergestellt;
g/l
Glucose
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4-7 H2O
CaCO3
pH = 6,2
25
5
5
0,5
0,5
0,2
6,3
0,5
0,2
6,3
Eine Schüttelflasche, welche 11 des Mediums enthielt,
wurde 30 Minuten bei 121°C im Autoklaven behandelt Der pH-Wert des abgekühlten Mediums lag bei 5,0.
Zellen von Acetobacter cerinus IFO 3263 aus einer Nähragar/Schrägplatte (5 ml einer 20 ml sterilen,
wäßrigen Suspension) wurden in die Flasche gegeben, die dann auf einem Drehschüttler bei etwa 28° C für
etwa 24 Stunden geschüttelt wurde.
Eine Teilmenge der KultWiTfichtungsbrube, welche
zur Bereitstellung einer 5Vo|yVo|,-% Impfmenge
ausreichte, wurde in einen «H-Fermentator gegeben, der
21 des folgenden Produktionsmediums enthielt;
B/l
Glucose
MaisqueUwasser
MaisqueUwasser
KH2PO4
MgSO+ >7 H2O
Harnstoff
MgSO+ >7 H2O
Harnstoff
CuSO4 -5H2O
Nikotinsäure
Nikotinsäure
pH = 6,0
110
0,5
0,58
0,5
lmg 3OC μg
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von etwa 28° C unter Rühren bei 1700UpM und Belüftung
mit einer Rate von 0,75 Volumen pro Volumen der Brühe pro Minute durchgeführt Nach einer Fermentationsperiode
von etwa 20 Stunden wurde sterile Glucose (55 g/l) zugesetzt Der pH-Wert wurde auf 5,5
durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung gehalten. Die Fermentation wurde fortgeführt, bis eine Ausbeute
von 2,5-Diketogluconsäure von >95%, bezogen auf
Glucose, erreicht war.
Claims (2)
- Patentansprüche;1, Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 2^-Diketogluconsäure, dadurch ge|cennzeichnet, daß man Acetobactercerinus IFO3263 oder IFO 3266 in einem Medium, dessen Glucosekonzentration 24 bis 20% und anfänglicher pH-Wert 3,5 bis 74 betragen, bei 20 bis 35° C aerob züchtet, wobei der pH-Wert während der Fermenta- to tion bei etwa 5,5 gehalten wird, und die erhaltene 24-Diketogluconsäure gewinnt - :
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Fermentationsbrühe durch selektive Reduktion unter Bildung von 2-Ketogulonsäure und 2-KetogIuconsäure· weiterverarbeitet.
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