LU80536A1 - Procede de production d'acide 2,5-dicetogluconique - Google Patents

Description

D. 5o.o62 GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG Brevet N°...........’ A Λ P “i Λ du 1.6 noYeôb M Μ7.η u qm Monsieur le Ministre , 0ν§*Ξ& de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes

Titre délivré : ........................................ 5¾¾¾ . . x gWrjw Service de la Propriété Industrielle

^ LUXEMBOURG

/{_ Demande de Brevet d’invention I. Requête .....La. .....EFIYER.....IUC.. 23.5.. East.A2nâ Street.,.....à..iiEiÎ-YOPJôi .....F/cafe. de New-York.....Etats-Unis.....dlMcrique.,.....représentas.. par..............................

.....Iions.ie.ur.....Jacques.....de.Jiu.yser..,.....agissant, en.. .qualité....de...siândataire (2) dépose........ ce.....seize. .nQ.y.eiabr.e...,19oQ.....soixante-dix-îiuit..................................© à .........15.......... .... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ......"ErocSda.....de... production... d'acide...^., S-dicatogluconicue"........................................(4) déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) Inventeurs) est (sont) : .....1*-.....Donald... JLlbart...ü.I.TA/.....Ueadcir.ïOOds ..Rosd,......à....i.S.SEX-f----Crjàté..c.Q.........(5) ......................Hidd les SX.,.... Etat... de.....CQnnact.ic.ut.,.....Etats-Unis.....à.Utàsriqna..........................

......2..»..-r.....Karl.ene....Lli2ab.Cith....EM.;L./......1.7..... Granite.....Street,......H.„USS_.L025LQSl/....C.oint .......................àe...KÂ:;i....London.^...Etat...c3...CorniJciciït/....E^Jc2d&i3.àti^^idi2........................................

2. la délégation de pouvoir, datée de Ιχ^νίτ.τ.ΥΟΒΚ.,................ le .2-5._JLOÛt.....19.7.3.................

3. la description en langue........ XD5.I1Ç2.ÀE&....... ...................... de l'invention en deux exemplaires ; 4........JJ................. planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l'Enregistrement à Luxembourg, le......16.. .novtnr:br.e. ...19.7 δ........................................................................................................................................................................................

revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande© de (6).......................brevet..............................................déposée© JcJ(7) _aux....llt,nfcs.-Un.i5.....dl-lrnSriqus......................

le ......XS....noMÂîéhre.....19.71___________(Kcu.....£52,,9.5a)-............................................................................................................................(8) au nom de S....inyfcntS.UPS.................... .......................................................................................................................................................................(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ........................................

.....35, . bld .BÖ.V.3.1............................................................................................................................................................................................................... (10) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à ........IB............................. mois.

Le.....çinSifcalre.......X.........¢,.......Ü I, JX. J\ J .

II. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d'invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 16 r.oy-ylrre 1973

Pr. le Ministre à 1 5 heures /Je.· s't*i* ÇYv de l'Économie Nationale et des Classes Movennes, (/ r~ \ »*/

U? J) (r ; /J

A 6SQ07 \ J ν' ' - 1 D. 5o.o62

REVENDICATION DE LA PRIORITE

, de la demande de brevet / txt Aux ETATS-UNIS D'AMERIQUE Du 18 NOVEMBRE 1977 Mémoire Descriptif déposé à l’appui d’une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg au nom de: PFIZER INC.

pour: "Procédé de production d'acide 2,5-dicétogluconique".

4

La présente invention concerne la production de l'acide 2,5-dicétogluconique.

L’acide 2,5-dicétogluconique est un composé intermédiaire intéressant pour la synthèse de la vitamine C. Jus-5 qu'à présent, cet acide a été produit par diverses espèces bactériennes telles que Acetobacter melanoqenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens et Pseudomonas sesami. Toutefois, l'utilisation de ces micro-organismes n'est pas entièrement souhaitée du 10 point de vue industriel, à cause de la production de grandes quantités de pigments bruns ou brun-jaunâtre comme sous-produits de la culture, qui abaissent la pureté de l'acide 2,5-dicétogluconique produit en même temps.

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 790 444 15 concerne la production de l'acide 2,5-dicétogluconique sans production concomitante de pigment brun, par une espèce nouvelle appelée Acetobacter fraqum.

L'invention concerne un procédé économique de production d'acide 2,5-dicétogluconique qui utilise des souches 20 d'un micro-organismes facile à obtenir et tenu à la disposition du public; ce micro-organisme s'appelle Acetobacter cerinus. Deux de ces souches, IFO 3263 et 3266, produisent l'acide 2,5-dicétogluconique en des rendements de plus de 95% sur la base du glucose.

25 L'acide 2,5-dicétogluconique est un composé inter médiaire intéressant à utiliser pour la production de l’acide ascorbique. Une solution aqueuse d'acide 2,5-dicétogluconique peut être réduite sélectivement pour produire un mélange de 2-cétogulonate et de 2—cétogluconate que l'on peut transformer 30 en acides ascorbique et érythorbique.

L'acide 2,5-dicétogluconique est aisément préparé par action bactérienne sur le glucose en utilisant, conformément au procédé de la présente invention, des souches d'Acetobacter cerinus faciles à obtenir. Toutes les souches indi-35 quées d'Acetobacter cerinus, tenues à la disposition du public, ont été soumises à des essais par lesquels on a constaté qu'elles donnent des céto-acides en un rendement de 50 à 95% sur la base du glucose. Lorsqu'on utilise 1'Acetobacter cerinus .[ 2 IFO 3263 ou 3266, le céto-acide produit est en totalité l’acide 2,5-dicétogluconique désiré, que l’on obtient en des ’ rendements de plus de 95 % sur la base du glucose. Les sou ches existantes d'Acetobacter cerinus, tenues à la disposition 5 du public, sont les suivantes : IFO 3262 (ATCC 12303) 3263 3264 3265 10 3266 3267 3268 3269

Ces souches d'Acetobacter cerinus sont cultivées 15 dans un milieu dont la principale source de carbone est le glucose. Ces micro-organismes ne nécessitent pas de sources organiques coûteuses d * aaotê telles quepeptone ou extrait deviante. Lorsqu’on utilise l'urée et des sources inorganiques d'azote telles que le sulfate d'ammonium, le nitrate d’ammonium ou 20 le phosphate d’ammonium, on ajoute de l'acide nicotinique comme facteur essentiel de croissance.

La concentration en glucose du milieu varie entre 2,5 et 20 %, de préférence entre 10 et 12 %, pour l'obtention de l'acide 2,5-dicétogluconique de la façon la plus économi-25 que. La température de fermentation se situe entre 20 et 35°C, de préférence entre 25 et 30°C, et elle est très avantageusement de l'ordre de 28°C. Le pH initial du milieu de culture peut aller de 3,5 à 7,5 et se situe de préférence entre 5 et 6.

Au cours de la fermentation, le pH est maintenu à environ 5,5 30 par l'addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. Du carbonate de calcium peut être utilisé pour ajuster le pH et ce sel est ajouté comme appoint au milieu après l'autoclavage, en une quantité de 30 g par 110 g de glucose.

Après l'inoculation, le milieu de fermentation est 35 agité à l'aide d'un agitateur mécanique à environ 1700 tr/min et il est aéré à un débit de 0,5 à 1 volume d'air par volume de bouillon par minute.

3 ί m

Lorsqu'on utilise Acetobacter cerinus IFO 3263 ou 3266, on conduit la fermentation jusqu’à ce que l'acide 2,5-dicétogluconique ait été obtenu en un rendement d’au moins 90 % sur la base du glucose (36 à 40 heures).

5 On a déterminé par chromatographie sur papier que la transformation du glucose en acide 2,5-dicétogluconique s'effectue selon les schémas suivants : glucose—·> acide 2-cétogluconique—î> acide 2,5-dicétogluconique glucose—5* acide 5-cétogluconique—? acide 2,5-dicétogluconique.

1 10 On se sert du papier "Whatman" n° 1 et n° 4 et on utilise un mélange de solvants formé de méthyléthylcétone, d'acétone, d'acide formique et d'eau dans la proportion de 80:6:2:12.Les taches correspondant à l'acide sont localisées par pulvérisation d'une solution éthanolique à 0,2 % de o-phényl-15 ènediamine contenant 1 % d'acide nitrique et en chauffant à environ 70°C (acide 5-cétogluconique - couleur bleue; acide 2-cétogluconique - couleur jaune; acide 2,5-dicétogluconique -couleur verte). L'identification peut aussi être effectuée par chromatographie en phase liquide sous haute pression.

20 L'acide 2,5-dicétogluconique peut être séparé et recueilli du bouillon final de fermentation par toute opération classique connue de l'homme de l'art. Le bouillon de fermentation qui a été filtré peut être traité par exemple au borohydrure et le mélange résultant d'acide 2-cétogluconique 25 et d'acide 2-cétogulonique peut être hydrolysé en donnant les acides ascorbique et érythorbique.

EXEMPLE 1

On prépare pour l'inoculation le milieu aqueux suivant : 30 Ingrédients Grammes/litre

Glucose 25

Extrait soluble de maïs 5 KH2P04 0,5 K2HP04 0,5 ' 35 MgS04.7H20 0,2

CaC03 6,3 pH 6,2 it 4 %· »

Une fiole d’agitation par secousses contenant un litre de milieu est autoclavée pendant 30 minutes à 121°C.

» Le pH du milieu refroidi est égal à 5,0. Des cellules d*Acetobacter cerinus IFO 3253 provenant d’une culture incli-5 née sur gélose nutritive (5 ml d'une suspension aqueuse stérile de volume égal à 20 ml) sont ajoutées à la fiole qui est ensuite agitée par secousses sur une secoueuse rotative à 28°C pendant environ 24 heures.

Un échantillon de culture en cours de croissance - 10 suffisant pour représenter une proportion de 5 % en v/v d'inoculum est ajouté à un fermentateur sous agitation de 4 litres de capacité contenant 2 litres du milieu de production suivant :

Ingrédients Grammes/litre 15 Glucose 110

Extrait soluble de maïs 0,5 (NH.KHPO, 0,58 KH2P04 1,5

MgS04.7H20 0,5 20 Urée 0,5

CuS04.5H20 1 mg

Acide nicotinique 300 Ύ pH 6,0

On conduit la fermentation à une température d'en-25 viron 28°C en agitant à 1700 tr/min et en aérant à un débit de 0,75 volume par volume de bouillon par minute. Après une période de fermentation d'environ 20 heures, on ajoute du glucose stérilisé (55 g/1). On maintient le pH à 5,5 par l'addition d'une solution d'hydroxyde de sodium. On poursuit la 30 fermentation jusqu'à ce que le rendement en acide 2,5-dicéto-gluconique soit supérieur à 95 % sur la base du glucose.

EXEMPLE 2 » On répète le mode opératoire de l'exemple 1 en uti lisant Acetobacter cerinus IFO 3266j on obtient des résultats ‘ 35 comparables.

Claims (5)

1. Procédé de production d'acide 2,5-dicétogluco- * nique, caractérisé par le fait qu'il consiste à conduire la , culture aérobie d'Acetobacter cerinus dans un milieu glucosé 5 puis à recueillir l'acide 2,5-dicétogluconique résultant ou à traiter le bouillon de fermentation par réduction sélective pour obtenir les acides 2-cétogalonique et 2-cétogluconique.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la concentration en glucose du milieu a une 10 valeur de 2,5 à 20 %, la température de la fermentation va de 20 à 35°C, le pH initial va de 3,5 à 7,5 et le pH au cours de la fermentation est maintenu à environ 5,5.

3. Procédé suivant l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la souche d'Acetobacter cerinus 15 est la souche IFO 3263.

4. Procédé suivant l’une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que la souche d♦Acetobacter cerinus est la souche IFO 3266.

5. L'acide 2,5-dicétogluconique, l'acide 2-céto-20 gulonique ou l'acide 2-cétogluconique obtenu par un procédé suivant l'une quelconque des revendications prédédentes. «