JPS60196194A - ６‐ヒドロキシニコチン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物工学的手段により６−ヒト【］キシニコ
チン酸を製造する方法に開方る。

有機合成法による６−ヒドロキシニコチン酸の製造法は
多く知られており、ヒドロキシ芳＠族のコルベ−シュミ
ット・カル小キシル化によって、６−ヒドロキシニコチ
ン酸か２−ピロリドンから得られる。　他の合成法は、
リンゴ酸またはイソシンコメロン酸から出発するもので
おる［　１３　ｒｉ−ａｎｃｏｕｒｔら、　Ｊ、　Ｃｈ
ｉｍ　、　１−ｈｅｒ　、（１９７３年）、　８　（２
）　、　２２６〜２３２　；Ｑｕａｒｒｏｚ、スイス特
許出願Ｎα７７３１／８０］。

これら既知の製造法は、いずれも、純粋な６−とドロキ
シニコチン酸の簡単で費用がかからす、しかも環境的に
問題のない製造を可能にするものではない。　これらの
方法は、買換反応が定量的でないとか、反応に伴って望
ましくない副生物か生成するといった欠点を有している
。　副生物は夾雑部となり、反応終了後に反応生成物か
ら除去しな（プればならない。

バチルス属（［３ａＣｉｌｌｌｊＳ　）　、シュードモ
ナス属（ｐ　ｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ）　、クロストリジ
ウム属（ＣＩＯ３−ｔｒｉｄｉｕｍ　）　ｌよびミコバ
クテリウム属（Ｍｙｃｏ−ｂａＣｔｅｒ’ｉｕｍ　）の
微生物がニコチン酸上で増殖すること、およびこれらの
微生物がこの基質を、炭素源、窒素源およびエネルギー
源として利用することも知られている［Ａ１１ｉｎｓｏ
ｎ　Ｍ、　Ｊ、　Ｃ，、Ｊ。

３ｉｏ１　、　Ｃｔｌｅｍ　、（１９４３年）１４７，
７８５：３ｅｔ１ｒｍａｎ　Ｅ、　Ｊ、　、　５ｔａｎ
ｉｅｒ　Ｒ，Ｖ、　、　Ｊ。

３ｉｏｌ　、　ＣＩ）ｅｍ　、（１９５７年）２２８，
９２３］。　ニコチン酸は、すべての被検細菌によって
、−次分解段階で６−ヒドロキシニコチン酸に酸化され
る。　６−ヒドロキシニコチン酸は直ちに、あまり高い
濃度になることなくさらに転換して、好気性細菌の場合
には水、二酸化炭素およびアンモニアまでになる。

いくらか純粋な形でニコチン酸ヒドロキシラーゼを単離
することは、微生物の分解によってのみ可能であった［
１−１ｕｎｔ　Ａ、　Ｌ、　、　［３ｉｏｃｈｅｍ、　
Ｊ。

（１９５８年）Ｌス、１〜７］。　ニコチン酸ヒドロキ
シラーゼは約４００，０００ダルトンの大分子である。

　これはフラビン補因子、多くの金属原子（Ｆｅ、ＭＯ
）、無機イオウおよび若干の場合にはセレンも含んでい
る。　ニコチン酸ヒドロキシラーゼは、適当な電子転移
系（たとえばチトクロム、フラビン、ＮＡＤＰ　その他
）の存在下でのみ活性である。

細胞抽出液からニコチン酸ヒドロキシラーゼを単離し、
この酵素製剤をニコチン酸のヒドロキシル化に用いるこ
とも可能である。　これを実施して、少量の６−ヒドロ
キシニコチン酸が実際に得られた［　Ｂｅｈｒｍａｌｌ
および３ｔａｎｉｅｒ、　Ｊ、３ｉｏｌ　。

Ｃ１１ｅｍ（Ｃ１１ｅ年＞、２２８．９２３］。　１１
キ素を単離する費用が高く、酵素が不安定であるにもか
かわらず、補因子および電子転移系の再生のためにニコ
チン酸ヒドロキシラーゼをめなりればならない。

多くの発酵および酸素反応では、反応溶液中の生成物濃
度が非富に低いので、生成物を単離する場合に多聞の反
応溶性を処理しなＣブればならない。

このために、処理費用、装置費用および排水処理費用が
高くなる。

６−ヒドロキシニコチン酸のバイオテクノロジー的製造
の場合も、同じような事情で必る（スイス特許出願第８
２５　／　８４　＠　）。　０．１重量％から飽和まで
のニコチン酸溶液を用いて、酵素的ヒドロキシル化を行
なうことも可能である。　しかし、細胞内に存在する酵
素の安定性は、基質濃度が高くなるとひどく低下する。

　そのため、これに応じて酵素消費量および酵素費用も
増大する。

他方では、かなり低い二］チン酸濃度においても細菌［
アクロ−Ｅバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）　
］の増殖は強く阻害される。　酵素の損失は反応中の細
胞増殖が緩慢であることによって補償されるが、この補
償は希薄なニコチン酸溶液（０，１〜１．５％）におい
てのみ起りうることである。

上記した事実から、ニコチン酸のけドロキシル化は希薄
な溶液において実施づ−へきておるが、これは処理費用
の増大をもたらす。

本発明の課題は、この欠点を克服して、経済的な方法に
よってニコチン酸から６−ヒドロキシニコチン酸を、高
純度かつ高収率で製造することを可能にする方法を提供
することである。

この目的は、本発明に従う特許請求の範囲第１項に記載
の方法によって達成される。

バイオ反応器にニコチン酸マグネシウムまたはニコチン
酸ナトリウムの０．１重量％から飽和までの溶液を満た
し、ニコチン酸富化細胞を添加づるのが好都合である。

　反応中に生成するヒト１］キシニコチン酸マグネシウ
ムまたはヒドロキシニコチン酸バリウムは、飽和限界に
達した後に析出する。

反応は、１０〜５０’Ｃの温度において、望ましくは２
５〜３５°Ｃの温度において実施する。

ｐＨ値はニコチン酸の添加によって、５〜９に一定に保
持される。

本発明の好ましい実施方法は、適当な６−ヒドロキシニ
コチン酸を得るための酵素的ヒドロキシル化の規模に応
じて、ニコチン酸のマグネシウム塩またはバリウム塩の
０．２〜１０％溶液を、アクロモバクタ−・キシロース
オキシダン（ＡＣｈ−ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｏ
ｓｏｘｙｄａｎｓ）のｐＨ５〜９に保持した懸濁液中に
供給し、生成する６−ヒドロキシニコチン酸のマグネシ
ウム塩またはナトリウム塩を連続的に分離する連続方法
である。

ヒドロキシニコチン酸マグネシウムまたはヒドロキシニ
コチン酸バリウムの溶解度が低いために、反応中の生成
物をマグネシウム塩またはバリウム塩として選択的に沈
でんさせ、ニコチン酸を溶液中に留めることが可能にな
る。　ヒドロキシニコチン酸マグネシウムまたはヒドロ
キシニコチン酸バリウムは、ろ過または遠心分離によっ
て容易に分離される微細なミクロ結晶を形成する。　こ
れらの塩を酸性化することによって、純粋な６−ヒドロ
キシニコチン酸か得られる。

ニコチン酸マグネシウムまたはニコチン酸バリウムの溶
液としての溶出液の添加は、導電率調節器と結合したポ
ンプによる導電率測定にもとづいて、自動的に行なうこ
とができる。　反応器の底または付属のデカンタ−中に
析出するヒドロキシニコチン酸マグネシウムまたはヒド
ロキシニコチン酸バリウムの結晶は、定期的または連続
的に分離することができる。

固体のニコチン酸を適当量の酸化マグネシウムとともに
、または平行して、固体物質計量器を介してバイオ反応
器に加えることかできることはいうまでもない。

このようにして、固体の抽出物を供給し、固体の生成物
を取り出す実質的に閉じた系が実現する。

この系において、良好な酵素安定性を保証し、処理問題
および廃水処理問題を招くことがないような条件下で、
希薄な基質溶液を扱うことかできる。

酵素的ヒドロキシル化は、ニコチン酸ヒドロキシラーゼ
のソースとして微生物を用いることによって実施する。

シュードモナス属、バチルス属およびアクロモバクタ−
属の微生物によって６−ヒドロキシニコチン酸の製造が
右利に行われることか発見され７ｊ。

ずなわら、アクロモバクタ−・キシロースオキシダンス
　０８Ｍ２４−０２＜菌株型）、シュートモ−ｊ−ス・
７Ｆ−タ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）
　Ｋ　Ｂ　ｌＮＣｌＢ１０５２１．ＮＣＩＢ８１７６ま
たはＥｎｓｉｇｎおよびＲｉｔｔｅｎｂｅｉｇが記述し
ている［Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ　、２３９　（１９６４年＞、２
２８５〜２２９１］バチルス属菌株を用いることかでき
る。

好ましくは、アクロモバクタ−・キシロースオキシダン
スの新しい菌株ＤＳＭ２７８３を用いる。

名称ニアクロモバクター・キシロースオキシダンス　Ｄ
ＳＭＮｏ、２７８３ 単離源：ニコチン酸母液 （Ａ＞形態 栄養肉汁中で培養 （１）　細胞形態：桿状、長さ２〜３，５μｍ幅０．６
μＩｎ。

（２）　配置：孤立 （３）　運動性：非常に活発、繊毛によって運動 （４）　内生胞子：厳密に好気性 （５）　グラム：陰性 （６）　オキシダーゼ：陽性 （７）　カタラーゼ：陽性 この菌株は、検査したずぺての特徴において、アクロモ
バクタ−・キシロースオキシダンスの代表的な菌株（Ｄ
ＳＭ２４０２＞と一致する（例外：アセトアミドの加水
分解）。

前記菌株は、バイオテクノロジー研究所西ドイツ微生物
コレクション（ＤＳＭ）［西ドイツのグッティングン　
４３００　グリーゼハッハシュトラーセ　８］に、ＮＱ
ＤＳＭ２４．０２およびＤＳＭ２７８３として奇−託さ
れている。

新しい菌株であるＤＳＭ２７８３は、上述の寄託所に１
９８３年１１月１８日に寄託された。

シュードモナス・プチダの菌株ＮＣｌＢ１０５２１およ
び８１７６は、Ｔ　ｏｒｒｙ研究所、国立産業バクテリ
ア・コレクション［スコツ１〜ランドのアバディーン　
Ａ３９ＢＤＣアベイロード　１３５］において入手可能
である。

前記菌株は唯一の炭素源、窒素源およびエネルギー源と
してのニコチン酸によって増殖する。

前記微生物の培養は、この種類の菌株に対して既知の方
法に従って行なうことができる。　たとえば、リン酸塩
緩衝液（５０ｍ）ｌ）Ｈ７，０，痕跡元素（＃Ｉｙ／ｕ
）として Ｃａ（ｊｌ　−２Ｈ２０２０ １Ｖｌｎ　５ｏ４１０ Ｆｅ　３０４　”　７　Ｈ２０５ ｃｏ　ｃΩ２・６日２０　０．１ Ｃｕ　３０４−５１−１２０　０．１ Ｚｎ　３０４　・７　Ｈ２００，ｌ ＮａＭｏ０　・２Ｈ２００，１ ｄ′−３よび、増殖を促進させるだめの少量の酵母エキ
ス（Ｍｅｒｃｋ）　（０，０５重用量）を含有する、希
薄な殺菌したニコチン酸溶Ｆｊ（０，０５〜０．５重量
％）中において、好気性条件下で３０’Ｃにおいて、菌
株ＤＳＭ２７８３を２４〜４８時間発酵させる。　増殖
したバイオマス（水分的１０９／ｇ）はニコチン酸ヒド
ロキシラーゼを多く含有しでいる。　細胞を遠心分離し
、直ちに、または−２０℃に保存した後に直接、すなわ
ち酵母回収または精製することなく、ニコチン酸のヒド
ロキシル化に用いることができる。

ニコチン酸のヒドロキシル化を実施する場合に、−次段
階すなわち６−ヒドロキシニコチン酸へのヒドロキシル
化のあいだに、ニコチン酸の分解が生じないことが望ま
しい。　この産生段階では、収率を犠牲にして微生物の
増殖が行なわれる。

上述したように、菌株ＤＳＭ２７８３は希薄なニコチン
酸溶液（０，０５〜０．５％）中で良好に増殖し、この
ときに供給されたニコチン酸を完全に消費する。　ニコ
チン酸の濃度を高めると細胞の増殖が阻害され、２重量
％以上のニコチン酸濃度では、もはや増殖が観察されな
い。　しかし、細胞内のニコチン酸ヒドロキシラーゼの
活性は変化しない。　異化分解はヒドロキシル化段階の
のちに停止する。　このため、副反応および随伴反応は
排除されて、６−ヒドロキシニコチン酸の純度と収率は
非常に高くなる。

以下の実施例により、本発明の実際の適用を説明する。

大凰■ニ アクロモバクタ−・キシロースオキシダンスＤＳＭ２７
８３細胞の製造 Ｎａ２　ＨＰＯ４−２Ｈ２０：５１．９ｇ、ＫＨ，、Ｐ
Ｏ４：　２０．０ｇ、酵母エキス２．５ｇおよびニコチ
ン酸１０ｇを水４７５０７！中に含有する栄養溶液を発
酵器に満たし、１２０’Ｃにおいて２０分間殺菌した。

　３０℃に冷却したのち、発酵器に出発培養物５００ｍ
！！を接種し、３０’Ｃ。

ＤＨ７，０において、空気を通風しながら２４時間発酵
させた。　２４時間後に、ニコチン酸１゜びと酵母エキ
ス２．５ｇを水に溶がした溶液２゜Ｏｄを無菌状態で加
え、再び発酵を行なった。

４２時間後に培養物を回収し、アクロモバクタ−属細胞
を遠心分離（１５，０ＯＯＧにおいて３０分）によって
分離した。　湿ったバイオマス３８゜３３が得られた。

７ｇ発酵器内に、前もって固体の酸化マグネシウムを添
加してｐＨ７，１に調節した２％二］ヂン酸を満たし、
３０℃に加熱した。　アクロモバクタ−・キシロースオ
キシダンスＤＳＭ２７８３の濃縮懸濁液（最終濃度１０
１０細胞／ｄ＞２００ｄの添加後に、ヒドロキシル化が
開始した。

消泡剤（たとえばポリプロピレングリコールＰ−２００
０）を添加した後、強く撹拌して換気した。　発酵器を
３０℃の一定温度に保持した。

１）Ｈを、ｐ＋−＋制御装置および調節剤としてのニコ
チン酸溶液（仝使用１２３ｙ＞を用いて、７．０に保持
した。　基質濃度は導電率計によって連続的に測定した
。　この測定器は、調整器を介してぜん動ポンプに連結
した。　ヒドロキシニコチン酸マグネシウムの生成と沈
降のために基質濃度が低下した場合には、ニコチン酸マ
グネシウムの貯蔵溶液（１Ｍ）を最初の導電率に達する
まで、ポンプによって供給した。　このようにして、基
質濃度を自動的に調節することができる。

ヒドロキシニコチン酸マグネシウムの結晶は発酵器の容
器の底に析出するので、これを定期的に取り出して吸引
ろ過し、ろ液は発酵器内に戻した。

装置は３日間連続的（稼動させた。　１Ｍニコチン酸マ
グネシウム溶液３ｇを添加した。　添加が終了したのち
、ざらに５時間反応器を稼働させてから、反応器を空に
した。　懸濁溶液を吸引ろ過した。　これから、ろ液５
．３．１！および湿ったヒドロキシニコチン酸マグネシ
ウムまたはヒドロキシニコチン酸バリウムが得られた。

ヒドロキシニコチン酸マグネジ、ラムの全量を水２．５
４１に懸濁させ、濃塩酸によってＩ）８１．２まで酸性
化した。　析出した６−ヒドロキシニコチン酸を吸引ろ
過した。　まだ湿っている結晶を水４．ＯＯｍ！！で洗
浄し、乾燥した。　白色のミクロ結晶性生成物４６８．
ｓｇが得られ、これはＨＰＬＣ分析によると６−ヒドロ
キシニコチン酸９８゜８％を含有していた。　これはニ
コチン酸使用量にもとづいて紳出すると、９１．６％の
収率に相当する。

実施例２ ２、５．１！発酵器にニコチン酸の３％水性懸濁液１．
１１を充填し、固体の酸化バリウムを添加してｐＨを７
．０に調節した。　この基質溶液の温度を３０’Ｃに調
節し、消泡剤（Ｒｈｏｄｏｒｓｉ　ｌ　７０４１４）を
添加した後に、アクロモバクタ−・キシロースオキシダ
ンスＤＳＭ２７８９の濃縮懸濁液ＯＤ””０＝９０）７
０ｄを供給した。　この懸濁液に強く通風し、撹拌した
。　固体ニコチン酸を添加してｐＨを常に７．０に維持
した。　基質にコチン酸バリウムの１モル溶液）の添加
は、実施例１におけるように、導電率の測定および調節
によって自動化した。

２〜３時間後にニコチン酸は飽和度に達し、生成物が析
出し始めた。　結晶は発酵器の底に沈降し、これを定期
的に取り出した。　結晶ペーストを吸引ろ過し、ろ液は
戻し入れた。

装置は連続的に６０時間稼動させた。　ヒドロキシル化
の間、１モルのニコチン酸（バリウム塩）１．１１を発
酵器に供給した。　これに加えて、さらに固体のニコチ
ン酸６．８ｔｊをｌ）Ｈ調節のために用いた。

発酵器を空にし、器壁に付着したヒドロキシニコチン酸
バリウムの結晶をノＴ門落した。　懸濁液を吸引ろ過し
、ろ液１．９ｇを得た。　これはトＩＰＬＣ分析による
と、ニコチン酸０．５％および６−ヒドロキシニコチン
酸２．４％を含有していた。

湿ったヒドロキシニコチン酸バリウムの全量を２００ｄ
中に懸濁させ、これに濃塩酸を加えてｐｌ」を１．２に
低下させた。　２時間撹拌したのち６−ヒドロキシニコ
チン酸を吸引ろ過し、水１００ｄで洗浄し、５０’Ｃに
おいて真空乾燥しで、淡黄色の６−ヒドロキシニコチン
１１１８．６ｙを得た。　これはＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によ
ると、９８．３％の含量を示した。　また、これは反応
系に供給したニコチン酸にもとづいて、６４．７％の収
率に相当する。

ろ液中に残菌するヒドロキシニコチン酸バリウムの分析
検出量を加算した場合には、全収率は８９．９％にまで
高まった。

実施例３ （段階１）シュードモナス・プチダ　ＮＣＩＢ８１７Ｇ
　バイオマスの製造 Ｎａ２　ＨＰＯ４・２Ｈ２０：５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：
２０ｇ、酵母エキス２．５ｇおよびニコチン酸１０ｇを
水４７５０威中に含有する栄養溶液を７．１！ケマツプ
（Ｃｈｅｍａｌ）　）発酵器に入れ、１２０′Ｃにおい
て２０分間殺菌した。　３０’Ｃに冷却したのち、無菌
の痕跡元素溶液を加え、次の最終濃度（ｄ／、１１）に
達するようにした：ＣａＣｆ１　−２１−１２０　２０ ２ Ｍｎ　ｓｏ４　１０ Ｆｅ　ｓｏ４＠　７　Ｈ２０５ Ｃｏ　Ｃ，ｌｌ　・６Ｈ２００，１ ＣＩ　５Ｃ）４−５Ｈ２００，１ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，１ Ｎａ　Ｍｏ　ｏ４’　２Ｈ２００，１ 発酵器にシュードモナス出発培養物５００威を接種し、
３０’Ｃ，１）Ｈ７，０において空気を通風しながら２
４時間発酵さゼた。　２４時間後にニコチン酸１（ｌお
よび酵母エキス２．５ｇを水に溶かした無菌溶液２００
ｄを添加して、再発酵させた。　３８時間後に細胞塊を
遠心分離（１０゜０００Ｇにおいて３０分間）によって
分離した。

これにより、湿ったバイオマス４．３．：Ｉｎが得られ
た。

（段階２）ニコチン酸のヒドロキシル化３、５．１！発
酵器内で０．５％二」チン酸溶液２ｇに固体の酸化マグ
ネシウムを添加してｌ）Ｈを７゜０に調節し、３０’Ｃ
に加熱した。

必らかじめ水１００ｄ中に懸濁させた、湿ったシュード
モナス・プチダＮＣＩＢバイオマス２０Ｊを添加した後
に、ヒドロキシル化が開始した。

同時に、消泡剤（ポリプロピレングリコールＰ−２００
，Ｆｌｕｋａ）を添加し、この混合物中に空気を送風し
、溶解した酸素の濃度が３〜５　ｍｙ　Ｏ２／、１１の
範囲にあるようにした。　調節剤としてのニコチン酸を
添加して（総消費！１５．２ｇ）、１）Ｈを７．０に維
持した。　基質濃度は１Ｍ−ニコチン酸マグネシウムの
添加量を導電率測定と制御によって調節し、一定に保持
した（実施例１参照）。　飽和濃度に達しただ後に、６
−ヒドロキシニコチン酸のマグネシウム塩が析出し始め
る。

発酵器の底に沈降した結晶を定期的に取り出し、吸引ろ
過した。　そのたびに生じるる液は、新しいニコチン酸
マグネシウム１Ｍ溶液の製造に用いた。結晶は湿った状
態で保存した。　溶出液にニコチン酸マグネシウムの１
Ｍ溶液）の添加速度を測定し、発酵器内の総酵母活性の
評価に利用した。

活性損失は新鮮な湿ったバイオマスの定期的な一添加（
１日１回）によって補充した。

この実験系列は、５日間を要した。　この期間内に、１
Ｍニコチン酸マグネシウム１．６．Ｉｌを発酵器に導入
した。　収率測定のために発酵器を空にし、器壁に付着
する結晶をかき取った。　結晶を吸引ろ過した。

全実験系列で得られたヒドロキシニコチン酸マグネシウ
ムを水１，５ρ中に懸濁させ、濃塩酸を添加して、ｐＨ
を徐々に１．５にした。　６−ヒドロキシニコチン酸の
結晶を吸引ろ過し、フィルター上で水２００ｍ１で洗浄
し、６０’Ｃにおいて真空乾燥した。　ＨＰＬＣ分析に
よれば９９．３％の含量を示す白色結晶３６５．０９が
得られた。

これは、発酵器内に導入したニコチン酸にもとづいて、
９２．４％の収率に相当する。

特許出願人　ロング　リミテッド 代理人　弁理士　須　賀　総　夫

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）　バイオテクノロジー的手段により６−ヒドロキ
   シニコチン酸を製造する方法において、等量のマグネシ
   ウムイオンまたはバリウムイオンの存在下で、ニコチン
   酸ヒドロキシル化微生物によってニコチン酸を酵素的に
   ヒドロキシル化し、生成した反応混合物中に析出する６
   −ヒドロキシニコチン酸のマグネシウム塩またはバリウ
   ム塩を分離し、この分離した塩から６−ヒドロキシニコ
   チン酸を遊離させることを特徴とする方法。
2. （２）　ニコチン酸のマグネシウム塩またはバリウム塩
   の０．１％から飽和までの溶液を用い、この溶液を適当
   な６−ヒドロキシニコチン酸を得るための酵素的ヒドロ
   キシル化の規模に応じて連続的に、ｐＨ５〜９に保持し
   たアクロモバクタ−・キシロースオキシダンス（Ａ　ｃ
   ｈｒｏｍｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ
   ）懸濁液に供給し、析出する６−ヒドロキシニコチン酸
   の塩を連続的に分離することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項の方法。
3. （３）　１０〜５０℃の温度において実施することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項または第２項の方法。
4. （４）　ニコチン酸の添加によってｐＨを５〜９に定常
   に保持することを特徴とする特許請求の範囲第１項ない
   し第３項のいずれかの方法。
5. （５）　反応を連続的に実施することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの方法。
6. （６）　バチルス属（３ａｃｉｌｌｕｓ　＞　、シュー
   ドモナス属（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）またはアク
   ロモバクタ−属（ＡＣｈｒＯｍＯｂａＣｔｅｒ’）の微
   生物を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項な
   いし第５項のいずれかの方法。
7. （７）　ＤＳＭ２７８３なる寄託番号を有するアクロモ
   バクタ−・キシロースオキシタ゛ンスを用いることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか
   の方法。