JPH0463676B2

JPH0463676B2 -

Info

Publication number: JPH0463676B2
Application number: JP59190521A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Shimizu; Tsuneo Yamane; Takahiro Suzuki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-09-13
Filing date: 1984-09-13
Publication date: 1992-10-12
Also published as: JPS6170991A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、メタルノール資化性かつ菌体内にポ
リ−β−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有する
シユードモナス属細菌を用い、第１段階で高菌体
濃度に増殖せしめ、第２段階で培地の窒素を欠乏
せしめて培養を行なうポリ−β−ヒドロキシ酪酸
（以下PHBと称することがある）の製法に関す
る。 PHBは種々の細菌中に貯蔵物質として存在す
ることが知られ、かかる天然ポリエステルが酵素
により加水分解をうけることから、最近は易分解
性高分子材料としての新しい用途が期待されてい
る。たとえば、医者、農薬の製剤用添加物および
医療材料として使うことができる。（従来の技術）従来、メタノールを炭素源とするPHBの微生
物学的製法の研究としては、アゾトバクター・ベ
イジエリンキーおよびヒドロゲノモナス・ユウト
ロフアが特定の条件下でメタノールからPHBを
生成した報告がみられるが、それら細菌はメタノ
ールを資化できない。メタノールを資化して
PHBを生成する菌株としては、英国特許第
1370892号にハイフオミクロビウム・ヴアリアビ
レおよびシユードモナス・ロゼア種のうちの特定
の菌株が記載されている。さらに、J.Gemeral
Microbiology1977，98，265−272には、メチロ
バクテリウム・オルガノフイラムおよびシユード
モナスAM−１がそれぞれメタノールからPHB
を生成することが記載されている。しかし、上記
のメタルール資化性細菌は、いずれも充分に高い
PHB収量が得られないか、あるいは生産された
PHBの分子量が低い（40〜50000）ものしか得ら
れない欠点が認められている。その後、メタノー
ルを資化して高分子量のPHBを菌体内に蓄積す
るメチロバクテリウム・オルガノフイラムのある
特定の菌株が数種類発表されている（特開昭56−
117793）。（発明が解決しようとする問題点）前記メチロバクテリウム・オリガノフイラムの
菌株を使用する方法においても、高分子量の
PHBを高濃度に生成させることにおいて、未だ
充分であるとはいえないものである。（問題点を解決するための手段）本発明者らは、既知のシユードモナス・ロゼア
種およびシユードモナスAM−１とは明らかに異
なるシユードモナス属細菌のいくつかの菌株が、
メタノールを資化して高分子量のPHBを高濃度
に生成することを見出した。すなわち、代表的菌
株として、シユードモナス・メタノリチカ（微工
研菌寄第2698号）、シユードモナス・メタノボラ
ンス（微工研菌寄第2695号）、シユードモナス・
メタノアルブム（微工研菌寄第2699号）、シユー
ドモナス・メチリカ（微工研菌寄第2701号）、等
が使用される。また、これら菌株を人工的に変異
処理を加えて誘導される変異株であつても、メタ
ノールを資化して高分子量のPHBを菌体内に生
成するシユードモナス属細菌も同様に使用され
る。本発明に用いる微生物の培養条件としては、通
常の微生物培養条件と顕著に変わる点として、第
１に、メタノール濃度が0.1〜1.0g／ｌの範囲に
なるように保持しつつ培養することであり、かく
することにより、従来法たとえば特開昭56−
117793の場合、たかだか10〜30g／ｌの菌体濃度
に対して、本発明方法は40〜200g／ｌと約数倍
の菌体濃度に達する。第２に、培地の溶存酸素濃度が１〜3ppmとな
るように、高攪拌条件下に空気または必要に応じ
て酸素ガスを供給しつつ培養することであり、そ
の溶存酸素濃度が1ppm未満では、培養時間が著
しく増加して好ましくない。第３に、微生物の増殖に充分量の窒素源を、た
とえばNH⁺ ₄として0.05〜0.2g／ｌの濃度となる
ように保持しつつ培養する第１段階の培養行程
と、次いで、培地の遊離窒素源が飢餓の状態、つ
まり事実上NH⁺ ₄の供給を中止して培養する第２
段階の培養行程からなることであり、かかる第１
段階において、微生物は少なくとも30〜150g／
ｌの菌体濃度まで成育し、この時の菌体内の
PHBは約10〜30％に過ぎないが、第２段階の増
殖（菌体増加率として20〜30％増が望ましい）で
40〜200g／ｌの菌体濃度まで成育した菌体内
PHB含量が40〜70％に達し、したがつて、培養
液あたりのPHBの生産量としては、従来法たと
えば前記特開昭56−117793の場合が約７〜21g／
ｌであるのに対し、本発明方法においては約30〜
130g／ｌが得られる。培養の第１段階におけるメタノールの供給は、
窒素源たとえばNH⁺ ₄の供給を一定の割合、たえ
ばメタノール対33％アンモニア水が１対４の割合
で連動して供給すると、極めて安定した培養管理
ができる。培養の第１段階と第２段階では、メタ
ノールの供給の他に菌体増殖に必要な栄養源を供
給する。それら栄養源としては、通常の発酵に用いられ
る無機物、たとえば、リン酸カリウム、リン酸ナ
トリウム、硫酸、硫酸マグネシウムの他に、鉄、
マンガン、亜鉛、カルシウム、銅、コバルト等の
塩類の添加が有効である。また、必要に応じて有
機栄養源、たとえば、大豆蛋白加水分解液、廃糖
蜜、コーン・スチープ・リカー、酵母エキス等を
添加することも有効である。次いで、培養温度は25〜40℃で、最も好ましく
は30℃である。培養液のpHは６〜８、好ましく
は6.5〜7.5の範囲に保つべく苛性アルカリによつ
て調整する。培養時間は菌体生成濃度により変化
するが、たとえば、培養の第２段階で約150g／
ｌの菌体濃度を達成する場合３日程度であり、第
２段階で約200g／ｌの菌体濃度を得る場合さら
に２日程度である。かくして、PHBは微生物菌体内に顆粒として
生成されているから、培養後に遠心分離法等の公
知の分離方法により菌体を分離する。次いで、水
洗後、クリーム状菌体のまま菌体破壊処理する
か、もしくは菌体の水性懸濁液を噴霧乾燥処理し
て、これから適当な溶媒でPHBを抽出すること
ができる。PHB抽出溶媒の例としては、クロロ
ホルム等のハロゲン化炭化水素が適当である。ま
た、必要に応じてクロロホルム−メタノール混液
（２：１）にてPHBを抽出することもできる。次
に抽出液を蒸発乾固した後、再びクロロホルム等
のハロゲン化炭化水素に溶解し、残査を濾別して
得られる濾液から蒸発乾固することにより、糖製
PHBを収得する。（発明の効果）本発明によれば、得られるPHBの純度は98.5
〜99％を示し、高分子量のPHBを高濃度に製造
することができる。（実施例）以下、本発明を実施例により説明する。実施例１スラント培地〔リン酸１カリウム3g／ｌ、リ
ン酸２カリウム4g／ｌ、塩化アンモニウム0.8g／
ｌ、硫酸マグネシウム（７水塩）0.2g／ｌ、メタ
ノール10ml／ｌ、チアミン塩酸塩0.1mg／ｌ、リ
ボフラビン0.2mg／ｌ、パントテン酸カルシウム
0.2mg／ｌ、ピチオン0.01mg／ｌ、パラアミノ安
息香酸0.1mg／ｌ、ニコチン酸0.2mg／ｌ、寒天
20g／ｌ、pH7.0〕にシユードモナス・メタノリ
チカ（微工研菌寄第2698号）を接種し、24時間、
30℃で培養し、保存用スラントとした。つぎに、
第１表の前培養培地を500ml容の揺盪フラスコに
100ml入れ、120℃、15分間殺菌した。なお、メ
タノールは別に準備し、培養開始前に添加した。
この培地に、先に培養した保存用スラントから接
種し、30℃、３日間振盪培養して種培養とした。
種培養液約1lを集め、無菌的に遠心集菌した。

【表】一方、2l容量のジヤー培養槽に、第１表の殺菌
した基本培地750ml仕込み、上記種菌体を全量添
加して、30℃に保温しつつ通気攪拌培養を開始し
た。この培養開始と共に、培養液中のメタノーを
定期的に測定して、メタノール濃度が約0.5g／ｌ
となるようにメタノールを常時添加し、同期に33
％アンモニア水および第２表の無機塩溶液をそれ
ぞれ液量比0.25（33％アンモニア水ml／メタノー
ルml）および0.063（無機塩溶液ml／メタノール
ml）となるように添加した。培地のpHは、常時
7.0となるように水酸化カリウムを用いて調節し
た。培養液中の溶存酸素（DO）は、２〜3ppm
となるように最初攪拌機の回転数を500rpmに調
節し、その後、逐次回転数を上げ、最終的（培養
約60〜120時間）に1500rpmまで増大させた。さ
らにこの間、空気および純酸素を供給することに
よりDOレベルを保持した。培養開始後約75時間
において、33％アンモニア水の添加のみを中止し
て培養を継続し、培地中の遊離アンモニアがほぼ
完全に消費されたことを確認して培養を終了とし
た（全培養時間144時間）。培養液中の菌体濃度は
80.5g／ｌ、菌体中のPHB含有量は52％であつ
た。

【表】実施例２シユードモナス・メタノボランス（微工研菌寄
第2695号）、シユードモナス・メタノアルブム
（微工研菌寄第2699号）、シユードモナス・メチリ
カ（微工研菌寄第2701号）を用いた他は、実施例
１とまつたく同様にして培養した。各微生物の培
養終了液中の菌体濃度ならびに菌体中のPHB含
有量を測定した結果をまとめて第３表に示した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１メタノールを炭素源とし、微生物菌体内にポ
リーβ−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有する
シユードモナス属に属する細菌を、第１段階にお
いて30〜150g／ｌの菌体を含むようになるまで
培養し、次いで、第２段階において窒素飢餓条件
下で培養を継続することを特徴とするポリ−β−
ヒドロキシ酪酸の製法。２細菌の培養に供給される主炭素源であるメタ
ノールを、培地中に0.1〜1.0g／ｌ濃度の範囲に
保持しつつ培養を行なう特許請求の範囲第１項記
載の方法。３細菌の培養液中の溶存酸素濃度を１〜3ppm
の範囲に保持しつつ培養を行なう特許請求の範囲
第１請記載の方法。４細菌の培養の第１段階における培地上清中、
窒素の量が菌体の生成に十分な濃度として、
NH₄ ⁺を0.05〜0.2g／ｌに常時保持し、第２段階
における培地の窒素の量は第１段階より少ない量
に事実上NH₄ ⁺の欠乏下に保持して培養を行なう
特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
記載の方法。５細菌がシユードモナス・メタノリチカ
（Pseudomonas methanolytica）、シユードモナ
ス・メタノボランス（Pseudomonas
methanovorans）、シユードモナス・メタノアル
ブム（Pseudomonas methanoalbum）、シユー
ドモナス・メチリカ（Pseudomonas methylica）
からなる群より選択されるシユードモナス属細菌
である特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載の方法。