JPS6170991A

JPS6170991A - 微生物によるポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製法

Info

Publication number: JPS6170991A
Application number: JP59190521A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Shimizu; 清水　祥一; Tsuneo Yamane; 恒夫山根; Takahiro Suzuki; 高広鈴木
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-09-13
Filing date: 1984-09-13
Publication date: 1986-04-11
Also published as: JPH0463676B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、メタノール資化性かつ菌体内にポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸を蓄積する能力を有するシュードモナス属
細菌を用い、第１段階で高菌体濃度に増殖せしめ、第２
段階で培地の窒素を欠乏せしめて培養を行なうポリーβ
−ヒドロキシ漏酸（以下ＰＨＢと称することがある）の
製法に関する。

ＰＨＢは種々の細菌中に貯蔵物質として存在することが
知られ、かかる天然ポリエステルが酵素　−により加水
分解をうけることから、最近は易分解性高分子材料とし
ての新しい用途が期待されている。たとえば、医薬、農
薬の製剤用添加物および医療材料として使うことができ
る。

（従来の技術）従来、メタノールを炭素源とするＰＨＢの微生物学的製
法の研究としては、アゾトバクタ−・ベイジェリンキー
およびヒドロゲノモナス・ユウトロファが特定の条件下
でメタノールからＰＨＢを生成した報告がみられるが、
それら細歯はメタノールを資化できない。メタノールを
資化してＰＨＢを生成する菌株としては、英国特許第１
３７０８９２号にハイフォミクロビウム・ヴアリアビレ
およびシュードモナス・ロゼア種のうちの特定の菌株が
記載されている。さらに、Ｊ、　Ｇｅｍｅｒａｌ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏ８ｙ１９７７、９８．２６５−２７２
には、メチロバクテリウム・オルガノフィラムおよびシ
ュードモナスＡＭ−１がそれぞれメタノールからＰＨＢ
を生成することが記載されている。しかし、上記のメタ
ノール資化性細菌は、いずれも充分に高いＰＨＢ収量が
得られないか、あるいは生産されたＰＨＢの分子量が低
い（４０〜５００００）ものしか得られない欠点が認め
られている。その後、メタノールを資化して高分子量の
ＰＨＢを菌体内に蓄積するメチロバクテリウム・オルガ
ノフィラムのある特定の菌株が数種類発表されている（
特開昭５６−１１７７９３’）。

（発明が解決しようとする問題点）前記メチロバクテリウム・オリガノフィラムの菌株を使
用する方法においても、高分子量のＰＨＢを高濃度に生
成させることにおいて、未だ充分であるとはいえないも
のである。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、既知のシュードモナス・ロゼア種および
シュードモナスＡ−Ｍ−１とは明らかに異なるシュード
モナス属細菌のい（つかの菌株が、メタノ−、ルを資化
して高分子量のＰＨＢを高濃度に生成することを思出し
た。すなわち、代表的菌株として、シュードモナス・メ
タノコーラ（微工研菌寄第２６９８号）、シュードモナ
ス・メチロボランス（微工研苗寄第２６９５号）、シュ
ードモナス・メタノコーラ（徽工研菌寄第２７００号）
、シュードモナス・メタノール濃度（徽工研菌寄第２６
９９号）、シュードモナス・メチリカ（徽工研菌寄第２
７０１号）、シュードモナス・メタノコーラム（微工研
菌寄第２６９４号）等が使用される。また、これら菌株
を人工的に変異処理を加えて誘導される変異株であって
も、メタノールを資化して高分子量のＰＨＢを菌体内に
生成するシュードモナス属細菌も同様に使用される。

本発明に用いる微生物の培養条件としては、通常の微生
物培養条件と顕著に変わる点として、第１に、メタノー
ル濃度が０．１〜ｌＯｇ／ｌの範囲になるように保持し
つつ培養することであり、かくすることにより、従来法
たとえば特開昭５６−１１７７９３の場合、たかだか１
０〜３０ｇ／ｌの菌体濃度に対して、本発明方法は４０
〜２００ｇ／βと約数倍の菌体濃度に達する。

第２に、培地の溶存酸素濃度が１〜３　ｐｐｍとなるよ
うに、高攪拌条件下に空気または必要に応じて酸素ガス
を供給しつつ培養することであり、その溶存酸素濃度が
１ｐｐＩ１１未満では、培養時間が著しく一増加して好
ましくない。

第３に、微生物の増殖に充分量の窒素源を、た＋とえばＮＨ，とじて０．０５〜０．２．ｇ／ｌの濃度と
なるように保持しつつ培養する第１段階の培養工程と、
次いで、培地の遊離窒素源が飢餓の状態、つまり事実上
ＮＨ，の供給を中止して培養する第２段階の培養工程か
らなることであり、かかる第１段階において、微生物は
少なくとも３０〜１５．０ｇ／ｌｆの菌体濃度ま工生育
し、この時の菌体内のＰＨＢは約１０〜３０％に過ぎな
いが、第２段階の増殖（菌体増加率として２０〜３０％
増が望ましい）で４０〜２００ｇ／βの菌体濃度まで生
育した菌体内Ｐ）ＩＢ含量が４０〜７０％に達し、した
がって、培養液あたりのＰＨＢの生産量としては、従来
法たとえば前記特開昭５６−１１７７９３の場合が約７
〜２１ｇ／ｊ！であるのに対し、本発明方法においては
約３０〜１３０ｇ／ｌが得られる。

培養の第１段階におけるメタノールの供給は、窒素源た
とえばＮＨ４の供給を一定の割合、たとえばメタノール
対３３％アンモニア水が１対４の割合で連動して供給す
ると、極めて安定した培養管理ができる。培養の第１段
階と第２段階では、メタノールの供給の他に菌体増殖に
必要な栄養源を供給する。

それら栄養源としては、通常の発酵に用いられる無機物
、たとえば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸
、硫酸マグネシウムの他に、鉄、マンガン、亜鉛、カル
シウム、銅、コバルト等の塩類の添加が有効である。ま
た、必要に応じて有機栄養源、たとえば、大豆蛋白加水
分解液、廃糖蜜、コーン・スチープ・リカー、酵母エキ
ス等を添加することも有効である。

次いで、培養温度は２５〜４０℃で、最も好ましくは３
０℃である。培養液のｐＨは６〜８、好ましくは６．５
〜７．５の範囲に保つべく苛性アルカリによって調整す
る。培養時間は菌体生成濃度により変化するが、たとえ
ば、培養の第１段階で約１５０　ｇ／ｌの菌体濃度を達
成する場合３日程度であり、第２段階で約２００ｇ／ｎ
の菌体濃度を得る場合さらに２日程度である。

かくして、ＰＨＢは微生物菌体内に顆粒として生成され
ているから、培養後に遠心分離法等の公知の分離方法に
より菌体を分離する。次いで、水洗後、クリーム状菌体
のまま菌体破壊処理するか、もしくは菌体の水性懸濁液
を噴霧乾燥処理して、これから適当な溶媒でＰＨＢを抽
出することができる。ＰＨＢ抽出溶媒の例としては、ク
ロロホルム等のハロゲン化炭化水素が適当である。また
、必要に応じてクロロホルム−メタノール混液（２：１
）にてＰＨＢを抽出することもできる。次に、抽出液を
蒸発乾固した後、再びクロロホルム等のハロゲン化炭化
水素に溶解し、残査を濾別して得られる濾液から蒸発乾
固することにより、精製ＰＨＢを収得する。

（発明の効果）本発明によれば、得られるＰＨＢの純度は９８．５〜９
９％を示し、高分子量のＰＨＢを高濃度に製造すること
ができる。

（実施例）以下、本発明を実施例により説明する。

実施例１スラント培地〔リン酸１カリウム３ｇ／ｌ、リン酸２カ
リウム４　ｇ／ｌ、塩化アンモニウム０．８ｇ／ｌ、硫
酸マグネシウム（７水塩）０．２ｇ／ｌメタノール１０
ｍ１／Ｉｌ、チアミン塩酸塩し１ｍｇ／ｌ！。

リボフラビンＱ、２ｍｇ　／　ｌ　、パントテン酸カル
シウム０．２ｍｇ　／　ｌ　、ビオチン０．０１ｍｇ／
　ＩＩ、パラアミノ安息香酸０．１ｍｇ　／　ｌ、ニコ
チン酸９．２ｍｇ　／　ｌ、寒天２０ｇ／ｊ！、ｐ　Ｈ
７，０）にシュードモナス・メタノフィラム（微工研菌
寄第２６９４号）を接種し、２４時間、３０℃で培養し
、保存用スラントとした。つぎに、第１表の前培養培地
を５００ｍ　ｌ容の振盪フラスコ呻１００ｍ１入杵、１
２０℃、１５分間殺菌した。なお、メタノールは別に準
備し、培養開始前に添加した。この培地に、先に培養し
た保存用スラントから接種し、３０℃、３日間振盪培養
して種培養とした。種培養液約１６を集め、無菌的に遠
心集菌したところ、約１ｇの種菌体（乾燥重量として）
が得られた。

第１表　培地の組成リン酸１カリウム　　　　　　　　　　　１．０　　ｇ
／ｌ　　　　　Ｏ，８ｇ／ｇリン酸２ナトリウム　　　
（１２）ρめ　　　３．５　　　〃３．０　　　〃ホウ
酸　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　〃０一方
、２Ｉ！容量のジャー培養槽に、第１表の殺菌した基本
培地７５０ｍ１仕込み、上記種菌体を全量１１１１．３
０℃に保温しつつ通気攪拌培養を開始した。この培養開
始と共に、培養液中のメタノ−を定期的に測定して、メ
タノール濃度が約０．５ｇ／ｌとなるようにメタノール
を常時添加し、同時に３３％アンモニア水および第２表
の無機塩溶液をそれぞれ液量比０．２５　（３３％アン
モニア水ｍｌ／メタノールｍｌ）および０．０６３　　
（無機塩溶液ｍｌ／メタノールｍｌ）となるように添加
した。培地のｐＨは、常時７．０となるように水酸化カ
リウムを用いて調節した。培養液中の溶存酸素（Ｄｏ）
は、２〜３ｐｐｍとなるように最初攪拌機の回転数を５
０Ｏｒｐｍに調節し、その後、逐次回転数を上げ、最終
的（培養約６０〜１２０時間）に１５０Ｏｒｐｍまで増
大させた。

さらにこの間、空気および純酸素を供給することにより
Ｄｏレベルを保持した。培養開始後約７５時間において
、３３％アンモニア水の添加のみを中止して培養をＷ！
続し、培地中の遊離アンモニアがほぼ完全に消費された
ことを確認して培養を終了とした（全培養時間１４４時
間）。培養液中の菌体濃度は２０７　ｇ／Ｉｌ　（菌体
の対メタノール収率約３３％）、菌体中のＰＨＢ含有量
は６４％であった。

第２表　　無機塩溶液の組成リン酸　　　　　　　　　　　　　３０　　ｍｌ／ｊ！
硫酸　　　　　　２　〃硫酸マグネシウム（７水塩）　　　　１５ｇ／ｌ硫酸第
１鉄　　　（７水塩）　　　　６００　　ｍｇ／ｊ！塩
化カルシウム　（２水塩）２００〃硫酸マンガン　　（ｎ水塩）１００〃塩化コバルト　　（６水塩）９０〃硫酸亜鉛　　　　（７水塩”）　　　　１２０　　　〃
塩化銅　　　　　（２水塩）８０〃実施例２微生物としてシュードモナス・メタノリチカ（微工研菌
寄第２６９８号）、シュードモナス・メチロボランス（
微工研菌寄第２６９５号）、シュードモナス・メタノコ
ーラ（微工研菌寄第２７００号）、シュードモナス・メ
タノール濃度（微工研菌寄第２６９９号）、シェードモ
ナス・メチリカ（微工研菌寄第２７０１号）を用いた他
は、実施例１とまったく同様にして培養した。各微生物
の培養終了液中の菌体濃度ならびに菌体中のＰＨＢ含有
量を測定した結果をまとめて第３表に示した。

第３表

Claims

【特許請求の範囲】

（１）メタノールを炭素源とし、微生物菌体内にポリ−
β−ヒドロキシ酪酸を蓄積する能力を有するシュードモ
ナス属に属する細菌を、第１段階において３０〜１５０
ｇ／ｌの菌体を含むようになるまで培養し、次いで、第
２段階において窒素飢餓条件下で培養を継続することを
特徴とするポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製法。
（２）細菌の培養に供給される主炭素源であるメタノー
ルを、培地中に０．１〜１．０ｇ／ｌ濃度の範囲に保持
しつつ培養を行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）細菌の培養液中の溶存酸素濃度を１〜３ｐｐｍの
範囲に保持しつつ培養を行なう特許請求の範囲第１項記
載の方法。
（４）細菌の培養の第１段階における培地上清中、窒素
の量が菌体の生成に十分な濃度として、ＮＨ＿４を０．
０５〜０．２ｇ／ｌに常時保持し、第２段階における培
地の窒素の量は第１段階より少ない量に事実上ＮＨ＿４
の欠乏下に保持して培養を行なう特許請求の範囲第１項
ないし第３項のいずれかに記載の方法。
（５）細菌がシュードモナス・メタノリチカ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌｙｔｉｃａ）、シュ
ードモナス・メチロボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・メ
タノコーラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｌａ）、シュードモナス・メタノアルブム（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏａｌｂｕｍ）、シュ
ードモナス・メチリカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅ
ｔｈｙｌｉｃａ）、シュードモナス・メタノフィラム（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｐｈｉｌｕｍ
）からなる群より選択されるシュードモナス属細菌であ
る特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載
の方法。