KR850001940B1

KR850001940B1 - 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법

Info

Publication number: KR850001940B1
Application number: KR1019840000248A
Authority: KR
Inventors: 이새배; 정태만; 이진호; 양규준
Original assignee: 서울미원 주식회사; 임철수
Priority date: 1984-01-20
Filing date: 1984-01-20
Publication date: 1985-12-31
Also published as: KR850005501A

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법

본 발명은 5'-크산틸산을 미생물적 방법에 의해서 5'-구아닐산으로 전환시키는 5'-구아닐산 제조방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산은 정미성을 가지고 있는 핵산계 조미료로 널리 알려져 있는 물질이다. 종래 5'-크산틸산을 미생물적 방법에 의해서 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법으로는 5'-크산틸산 생산균주와 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 전환균주를 동시에 배양하는 혼합 배양방법(일본 특허 소46-39070, 48-33393), 전환능력을 가지는 미생물 배양액에 5'-크실린산을 첨가하는 방법(일본 특허 소46-39069, 소47-41557)등이 알려져 있다.

그러나 종래 이들 방법은 실제 공업적으로 이용하기에는 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째 : 혼합배양에 의한 방법은 성질이 다른 두종의 미생물을 동시에 관리해야 하므로 관리가 어렵고 생산수율이 낮다.

둘째 : 5'-크산틸산 배양액에서 5'-크산틸산을 회수하여 전환배양에 사용할 경우는 5'-크산틸산 회수방법이 어렵고 회수수율이 낮아 비경제적이다.

셋째 : 전환균주를 배양한 효소함유액에 5'-크산틸산 배양액을 첨가하여 전환시킬 경우 전체액량의 증가로 두 배양액이 서로 희석되어 5'-크산틸산 농도가 낮아지고 효소활성이 저하하여 최종 생산물인 5'-구아닐산 농도가 낮다.

본 발명자들은 이와 같은 문제점들을 해결하여 종래의 방법보다 고농도의 5'-구아닌산을보다 경제적으로 생산하기 위하여 연구하여 오던중 고농도의 5'-크산틸산 발효액에서도 잘 생육하며, 효율좋게 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 특벗한 변이주를 발명하였다.

이와 같은 변이주는 고농도의 5'-크산틸산 발효액에서 직접 5'-구아닐산을 생산할 수 있어 종래의 변이주에 비하여 단위시설당 생산량이 증가하고 제조원가가 절약되어 공업적으로 특히 유용한 새로운 신규주인 것이다.

본 발명자들은 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산으로 전환시키는 능력이 우수한 종래의 여러균주 즉, 브레비박테리움 암모니아 게네스(Brevibacterium ammoniagenes) MW 1672, 바실러스 마세란스(Bacillus macerans) MW-4231, 브레비박테리움 아세티리컴(Brevibacterium acetylicum) MW-2245등을 이용하여 고농도의 5'-크산틸산 발효액에서 직접 5'-구아닐산으로 전환시키기 위해서 전환배양연구를 한 결과 각 전환균주의 생리적 성질에 따라 다소 차이는 있지만 고농도의 5'-크산틸산 발효액에서는 전환균들이 생육의 저해를 받아 배양시간이 길어짐은 물론 전환수율이 극히 저조하였다.

본 발명자들은 이러한 원인을 여러면에서 조사해본 결과 고농도의 5'-크산틸산 발효액중에는 여러가지 물질 즉 계면활성제, 고농도의 암모늄염, 발효대사물질등의 축적되기 때문이며 이러한 원인은 5'-크산틸산 발효시 사용당 농도가 높으면 높을수록 더욱 현저하다는 것을 알았다.

따라서 본 발명자들은 고농도의 발효액에서는 잘 생육하면서 전환능력이 강한 변이주를 발명하기 위하여 고농도 발효액을 분리배지로 직접 사용하여 미생물 변이처리방법에 의해서 본 발명의 특수한 변이주 MW-6643을 분리하였다. 친주로서는 브레비 박테리움 암모니아 게네스 ATCC 6872를 1차 변이처리하여 유도된 데코이닌(DECOYNINE 200㎍/ml) 내성주 MW-1672를 사용하였으며 본 발명 변이주 MW-6643(KAIST 850214-15812)을 얻기 위한 변이처리 및 선별방법은 다음과 같다.

가. 주 1의 방법에 의해 5'-크산틸산을 고농도로 축적시킨 발효액을 100℃에서 5분가열 멸균한 후 주 2의 배지를 멸균하여 무균적으로 첨가하고 MW-1672를 식균하여 5일간 배양하였다.

나. 5일 배양한 후 생존한 균체를 분리하여 화학변이 유기제인 N-메칠-N'-니트로-N-니트로 소구아니딘 250㎍/ml농도로 30분 처리하여 주 3배지에 평판 배양한 후 생육이 좋은 코로니만을 취하여 5'-뉴클레오타이드 분해농이 거의 없고 크산틸산 아미나제 활성이 강한 변이주를 선별하여 5'-크산틸산 배양액에서 직접 전환능을 확인하여 최종 선별하였다.

(주 1) 5'-크산틸산 발효방법 : 5'-크산틸산 생산균주는 브레비박테리움 암모니아게네스 MW 4768-8을 사용했다. 발효배지는 포도당 10%, 인산 제1카리 1.0%, 인산 제2카리 1.0%, 황산마그네슘 7수화물 0.7%, 황산 제1철 7수화물 10mg/ℓ, 염화칼슘 2수화물 10mg/ℓ, 황산아연 7수화물 1mg/ℓ, 황산망간 1수화물 5mg/ℓ, 비오틴 50㎍/ℓ, 치아민염산염 5mg/ℓ, 판토텐산칼슘 10mg/ℓ, 황산암모늄 3g/ℓ, 요소2g/ℓ, 미트엑기스 0.5%, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 120mg/ℓ, 베타-알라닌 10mg/ℓ, 히스티딘 20mg/ℓ로서 5ℓ 소형 발효조에 2ℓ 사입하여 120℃에서 20분 멸균한 후 종배양액을 5%되게 접종하고 32℃에서 교반회전수 800rpm,통기량 1vvm, 암모니아수로 pH 7.2를 유지하면서 50시간 배양하였다. 발효중 잔당이 2%이상 유지되고 총첨가량이 발효액에 대해서 12%되게 70%포도당을 첨가하였다. 배양완료액중 5'-크산틸산 축적량은 67.4mg/ml이었다.

(주 2) 포도당 140g, 미트엑기스 4g, 인산 10g, 수산화카리 8g, 황산암모늄 10g, 비오틴 40㎍, 치아민염산염 10mg, 아데닌 50mg, 베타-알라닌 10mg을 증류수 500ml에 용해시켜 120℃에서 20분 가열 멸균한다.

(주 3) 주 1의 5'-크산틸산 배양액에 주 2배지를 첨가하고 한천을 2%, 데코이닌을 200㎍/ml되게 첨가한다.

본 발명의 변이주 MW-6643주가 친주 MW-1672주와 배양 및 생리학적 특성의 차이점은 다음과 같다.

[표 1]

배양 및 생리학적 특성비교

(주 4) 5'-크산틸산 아미나제 활성도는 저널오브 바이오 케미스트리 63권 3호 661페이지(The Journal of Bichemisty vol.63 No 3, P 661)의 모이드와 마가사닉(H.S. Moyed and Magasanik)의 변법에 따라 295mμ에서 대조구에 대한 OD증가로 표시하였다.

[표 2]

5'-크산틸산 발효액농도에 따른 생육도 비교

(주 5) 주 1의 방법에 의한 발효액과 증류수를 1:0, 1:1, 1:2, 1:3의 비율로 각각 섞은 혼합액 2ℓ에 첨가배지 주 2를 첨가하여 500ml 진탕 플라스크에 20ml 분주하여 종배양액을 5% 접종하고 배양온도 32℃에서 48시간 진탕하였다.

배양중 pH는 요소수용액으로 7.0으로 조절하였다. 생육도는 100배 희석하여 610mμ에서 흡광도를 측정하여 초기접종 후 배양액의 흡광도에 대한 증가를 표시하였다.

표 1과 같이 친주는 아데닌 비오틴 요구성이며 포도당, 과당을 자화하는데 비하여 MW-6643주는 비오틴만을 생육에 요구하고 포도당, 과당, 만노스를 자화하였으며 5'-크산틸산 아미나제 활성에서는 차이를 발견할 수 없었다.

본 발명의 변이주 MW-6643주가 고농도의 5'-크산틸산 발효액에서도 생육에 지장을 받지않는 이유를 여러가지 생리유전학적 면에서 특성을 상세히 조사해본 결과표 3과 같이 종래의 크산틸산아미나제 생산균주에 비하여 계면활성제(폴리옥시에칠렌스테아릴아민, 폴리옥시에칠렌알킬아민, 알킬디메칠벤질암모늄클로라이드등)에 대한 내성이 증가하였으며, 표 4와 같이 친주에 비해서 고온에서도 잘 생육하여 배양온도에 대한 내성도 동시에 부여된 것을 알 수 있었다.

[표 3]

계면활성제에 대한 내성비교

(주 6) ＋＋ : 생육양호, ＋ : 생육보통, － : 생육않음

계면활성제에 대한 내성비교는 각 농도의 계면활성제를 함유한 육즙한천평판 배지에 32℃, 72시간 배양하여 생육여부를 검사했다.

[표 4]

배양온도에 따른 생육도 비교

(주 7) 배양온도에 따른 생육도 비교는 육즙배지를 500ml 진탕플라스크에 20ml 분주하여 육즙한천사면 배지에서 배양한 균체 1백금이를 접종하여 24시간 각 온도에서 진탕배양한 후 100배 희석하여 610mμ에서 흡광도를 측정하여 표시하였다.

위 표 3, 4에서 보는 바와 같이 본 발명의 특이한 변위주가 각종 살균작용이 있는 계면활성제 및 고온의 배양조건에 대한 내성을 나타냄은 배양조건이 극히 나쁜 고농도의 5'-크산틸산 배양액에서도 잘 생육하는 원인으로 볼 수 있으며, 특히 이와 같은 유전적인 변화는 5'-크산틸산 아미나제의 세포의 분비를 촉진시키기 위하여 계면활성 제등약제를 배양중 첨가하거나 전환된 5'-구아닐산이 5'-구아노신 2인산 및 5'-구아노신 3인산등으로 재합성되는 것을 방지하기 위하여 전환반응온도를 40-50℃고온으로 할 때 특히 효과적이다.

5'-크산틸산이 5'-구아닐산으로 전환하는데는 5'-아데노신 3인산의 공급이 원활하여야 함이 필수적이다. 또한 5'-아데노신 3인산의 생합성은 미생물이 당을 분해할 때 생성되는 것으로 따라서 미생물이 당을 잘 소비하여야만 5'-아데노신 3인산의 공급이 원활하다.

고농도의 5'-크산틸산 발효액 및 계면활성제 첨가, 고온반응등의 조건에서 잘 생육하는 본 발명 변이주는 여러면에서 특히 공업적인 면에서 효과적인 신규의 변이주로 판단된다.

본 발명의 균주의 배지는 탄소원으로서 포도당, 과당 및 이들을 구성하고 있는 다당류의 가수분해물을 사용할 수 있고 질소원으로서는 황산암모늄, 요소, 염화암모늄, 암모니아수, 암모니아가스등을 사용할 수 있다. 이외에 생육에 필요한 각종 무기물과 비타민류를 첨가하고 또한 천연영양원으로 효모액기스, 미트엑기스, 옥수수침지액, 펩톤등을 첨가해도 효과가 좋다.

본 발명의 변이주는 위의 영양분을 첨가한 수용액 즉, 종래의 미생물배지 뿐만아니라 고농도의 5'-크산틸산 발효액에 위 영양분을 첨가한 배지에서도 생육하며 5'-크산틸산 아미나제를 생산한다. 특히 5'-크산틸산 발효액에 이들 물질을 적당량 첨가하여 직접 배양하는 것이 공업적인 면에서 효과적이다. 배양 종료후 이미 알려진 이온교환수지처리법, 흡착법, 침전법, 추출법등에 의해 생성한 5'-구아닐산을 회수할 수 있다.

본 발명의 변이주를 이용하여 고농도의 5'-구아닐산을 생산하는 상세한 방법을 다음에 기재하고 있으나 본원이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

사용균주 : 본 발명의 특수한 변이주 MW-6643

종배양 : 포도당 80g, 인산 제1카카리 3g, 인산 제2카리 3g, 펩톤 5g, 미트엑기스 5g, 황산암모늄 6g, 요소 3g, 염화칼슘 2수화물 0.1g, 황산 제1철 7수화물 10mg, 황산망간 1수화물 10mg, 황산아연 7수화물 10mg, 비오틴 80㎍, 치아민 염산염 5mg, 증류수 1ℓ, 5N-NaOH로 pH 7.6 조절하여 2ℓ 진탕플라스크에 250ml 분주한 후 120℃에서 20분간 가압멸균한다. 종균(MW-6643변이주) 1백금이 식균한 후 30℃에서 24시간 진탕배양한다.

생산배지 조성 및 배양방법 : 주 1의 배양방법과 동일하게 실시한 5'-크산틸산 배양액(5'-크산틸산 650mg/ml함유) 5ℓ를 가열하여 100℃에 다다르면 냉각시킨 후 아래의 배지 1을 첨가하여 혼합한다. 이 혼합배지를 14ℓ 발효조에 사입하고 상기 종배양액 500ml을 접종하여 30-32℃에서 pH 6.8-7.0, 통기량 1vvm, 600rpm으로 25시간 배양한 후 아래의 배지 2를 첨가하여 계속 배양한다. 배양개시후 40시간이 되면 배양온도를 43-45℃, pH를 7.4-7.6, 통기량을 1/2vvm으로 조절하고 배지 3을 첨가한다. 이후 배양시간 3시간 간격으로 황산마그네슘을 0.1%되게 2회 첨가했으며, 배양개시 후 50시간에서 발효를 종료했다. 최종발효액중 5'-구아닐산 농도는 49.8mg/ml였으며, 5'-구아노신 2인산, 5'-구아노신 3인산, 5'-크산틸산은 미량존재했다. 배양액 2ℓ로부터 균체를 제거한 후 상법에 따라 탈색수지와 이온교환수지를 이용하여 5'-구아닐산 함유액을 분리하고 기지의 농축법과 결정법을 이용하여 2'-구아닐산나트륨 조결정 92.4g을 얻었다.

(배지 1) 포도당 400g, 인산 12g, 수산화카리 12g, 황산마그네슘 7수화물 6g, 치아민염산염 20mg, 베타알라닌 20mg, 황산망간 1수화물 10mg을 증류수에 용해하여 총액량 500ml되게 한다. 120℃에서 20분 가압멸균한다.

(배지 2) 포도당 400g을 증류수로 용해하여 500ml되게 한다. 120℃에서 20분 가압멸균 한다.

(배지 3) 포도당 200g, 인산 제3나트륨 12수화물 30g, 황산마그네슘 7수화물 14g, 알킬디메칠벤질암모늄클로라이드 14g을 증류수에 용해하여 250ml로 되게 한다. 120℃에서 20분 가압멸균한다.

[실시예 2]

실시예 1의 5'-크산틸산 배양액 대신에 5'-크산틸산 배양액과 멸균증류수를 1 : 1로 섞은 희석액(5'-크산틸산 33.2mg/ml함유)을 사용하고 그외는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

배양완료액중 5'-구아닐산 농도는 25.2mg/ml였으며 5'-구아노신 2인산 및 5'-구아노신 3인산은 미량존재하였으며 5'-크산틸산은 검출되지 않았다.

Claims

본문에서 상술한 바와 같이 브레비 박테리움 암모니아 게네스에 속하고 계면활성제 및 고온에 내성을 갖는 동시에 고농도의 5'-크산틸산 배양액에서 직접 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 변이주 MW-6643(KAIST 850214-15812)을 5'-크산틸산을 함유한 배지에 배양하여 5'-구아닐산을 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법.