JPS6249038B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物を培地に培養してL
―グルタミンを培地中に蓄積させ、これを採取す
る方法において、リゾチームに感受性を有し、培
地中に存在する過剰のビオチンによつてL―グル
タミンの生産が抑制されない菌株を用いることを
特徴とするL―グルタミンの製造法に関する。 生育にビオチンを要求するL―グルタミン酸生
産菌によるL―グルタミンの生産はL―グルタミ
ン酸の生産条件に類似して培地中のビオチン濃度
を菌の生育に対して制限することがまず必須であ
り、さらに培地中の窒素源を炭素源に対して菌の
増殖生活に必要以上加え、かつ特定量以上の重金
属イオンを添加することによりL―グルタミンの
生産量を増大せしめる方法が知られている(特公
昭39―7391,同42―7595,同43―6993等)。さら
にL―グルタミン酸生産菌のサルフア剤耐性変異
株によりL―グルタミンの生産性が高められる
(特公昭51―44196)ことも知られているが、この
場合も同様に培地中のビオチン濃度を制限量にす
ることが絶対的条件であるため、炭素源として廃
糖蜜のようにビオチン含量の多い原料は安価でも
使用できず、やむをえず高価な精製糖等が使われ
てきた。 本発明者らは過剰量のビオチンを含む安価な粗
原料を用い、L―グルタミンを製造する方法につ
き研究した結果、従来のL―グルタミン酸または
L―グルタミン生産菌を親株として変異誘導した
リゾチームに感受性を有する変異株を用いれば、
過剰のビオチン含有培地を用いても、ビオチンに
よる抑制を受けることなく高い収率でL―グルタ
ミンを生産できることを見出した。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 本発明によればコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性
を有し、培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てL―グルタミンの生産が抑制されない性質を有
する微生物を培地に培養すれば培地中にL―グル
タミンが蓄積するので、これを採取することによ
り高収率にL―グルタミンが得られる。 本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、リゾチーム
に感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによつてL―グルタミンの生産が抑制されない
性質を有する微生物であればいかなる菌株をも用
いることができる。一般にはコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属し、L―グル
タミン、またはL―グルタミン酸生産能を有する
菌株を親株とし、これを変異誘導処理して得られ
た変異株からリゾチームに感受性を有するものを
選択し、これを用いる。変異誘導の方法として
は、紫外線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等
の通常の方法が用いられる。変異誘導された変異
株からリゾチームに感受性を有する菌株を選択す
るには、親株が生育可能な濃度のリゾチームを含
有する培地で生育できなくて、リゾチーム無添加
培地では親株と同様に生育できるものを選べばよ
い。従つて、ここでリゾチームに感受性であると
は、リゾチームに対する最小阻止濃度が親株より
も低いことを意味する。また培地中に存在する過
剰のビオチンによつてL―グルタミンの生産が抑
制されないとは、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによるL―グルタミン生産の抑制が実質的に無
視できる程度のものであることを意味する。具体
的には前記のごとき粗原料を用いた場合でも過剰
のビオチンによる影響をうけることなくL―グル
タミンの生産ができることを意味する。 本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株として得られたコリネバクテ
リウム・グルタミクムKY9703(微工研菌寄第
4412号、NRRL11271)、およびブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067を親株として得られた
ブレビバクテリウム・フラブムKY9733(微工研
菌寄第4414号、NRRL11273)があげられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株としてリゾチーム感受性変異
株を取得する方法について以下具体的に説明す
る。該親株を粉末ブイヨン(極東製薬社製)20
g/および酵母エキス5g/の組成を有する
培地(殺菌前PH7.2、以下C培地という)に植菌
し30℃で振盪培養する。中期対数期で培養を中止
し、集菌し、生理食塩水で洗浄後、M/20トリ
ス・マレート緩衝液(PH6.0)に5×108細胞/ml
になるように懸濁する。この懸濁液に最終濃度
500μg/mlになるようにニトロソグアニジンを
加え、25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体
を集め、同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水
に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈してC培地にさ
らに2g/dlの寒天を含む固体培地(以下CA培
地という)に塗りつける。これを30℃で2日間培
養し、生じたコロニー(約6000)を次の3種類の
固体培地にレプリカ法により塗りつける。 CA培地 CLA培地:CA培地を加熱殺菌後、冷却して
培地の温度が45℃まで下がつてから200mg/
になるようにリゾチームを添加した培地。 MA培地:グルコース10g/、NH4C4
g/、尿素2g/、KH2PO41g/、
K2HPO43g/、FeSO4・7H2O10mg/、
MgSO4・7H2O400mg/、MnC2・4H2O2
mg/、ZnSO4・7H2O0.9mg/、CuSO4・
5H2O0.4mg/、Na2B4O7・10H2O0.09mg/
、(NH4)6Mo7O24・4H2O0.04mg/、ビオチ
ン30μg/、サイアミン塩酸塩1mg/、シ
ステイン塩酸塩20mg/および寒天20g/の
組成を有する培地(殺菌前PH7.0)。 30℃で2日間培養後、CA培地で生育し、CLA
培地で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株と
して得る。MA培地で親株と同様に生育する自己
栄養性でリゾチームに対して感受性の変異株は試
験した6000コロニーの中に110株得られた。この
110株中3株がビオチン過剰培地でも多量のL―
グルタミンを生産する能力を有していた。コリネ
バクテリウム・グルタミクムKY9703はかくして
得られた変異株の一例である。 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を
親株とする変異誘導も上記と同様に行つて、ブレ
ビバクテリウム・フラブムKY9733を得た。 上記例示の変異株のMA培地、CA培地、CLA
培地での生育およびリゾチーム感受性度について
親株と比較した結果を第1表に示す。3種類の固
体培地上での生育はレプリカ法で塗りつけ、30℃
で2日間培養後判定した。表中生育欄の+は菌の
生育が観察されたものを、−は生育が観察されな
かつたものを示す。また表中リゾチーム感受性は
次のように試験した。すなわちC培地にて24時間
30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水に
て適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。 この懸濁液104細胞相当を倍々系列の濃度のリ
ゾチームを含有するCA培地に滴下接種し、30℃
で2日間培養する。菌の生育がまつたく認められ
ない最小のリゾチーム濃度を菌のリゾチーム感受
性値(最小生育阻止濃度)とした。
クテリウム属に属する微生物を培地に培養してL
―グルタミンを培地中に蓄積させ、これを採取す
る方法において、リゾチームに感受性を有し、培
地中に存在する過剰のビオチンによつてL―グル
タミンの生産が抑制されない菌株を用いることを
特徴とするL―グルタミンの製造法に関する。 生育にビオチンを要求するL―グルタミン酸生
産菌によるL―グルタミンの生産はL―グルタミ
ン酸の生産条件に類似して培地中のビオチン濃度
を菌の生育に対して制限することがまず必須であ
り、さらに培地中の窒素源を炭素源に対して菌の
増殖生活に必要以上加え、かつ特定量以上の重金
属イオンを添加することによりL―グルタミンの
生産量を増大せしめる方法が知られている(特公
昭39―7391,同42―7595,同43―6993等)。さら
にL―グルタミン酸生産菌のサルフア剤耐性変異
株によりL―グルタミンの生産性が高められる
(特公昭51―44196)ことも知られているが、この
場合も同様に培地中のビオチン濃度を制限量にす
ることが絶対的条件であるため、炭素源として廃
糖蜜のようにビオチン含量の多い原料は安価でも
使用できず、やむをえず高価な精製糖等が使われ
てきた。 本発明者らは過剰量のビオチンを含む安価な粗
原料を用い、L―グルタミンを製造する方法につ
き研究した結果、従来のL―グルタミン酸または
L―グルタミン生産菌を親株として変異誘導した
リゾチームに感受性を有する変異株を用いれば、
過剰のビオチン含有培地を用いても、ビオチンに
よる抑制を受けることなく高い収率でL―グルタ
ミンを生産できることを見出した。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 本発明によればコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性
を有し、培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てL―グルタミンの生産が抑制されない性質を有
する微生物を培地に培養すれば培地中にL―グル
タミンが蓄積するので、これを採取することによ
り高収率にL―グルタミンが得られる。 本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、リゾチーム
に感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによつてL―グルタミンの生産が抑制されない
性質を有する微生物であればいかなる菌株をも用
いることができる。一般にはコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属し、L―グル
タミン、またはL―グルタミン酸生産能を有する
菌株を親株とし、これを変異誘導処理して得られ
た変異株からリゾチームに感受性を有するものを
選択し、これを用いる。変異誘導の方法として
は、紫外線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等
の通常の方法が用いられる。変異誘導された変異
株からリゾチームに感受性を有する菌株を選択す
るには、親株が生育可能な濃度のリゾチームを含
有する培地で生育できなくて、リゾチーム無添加
培地では親株と同様に生育できるものを選べばよ
い。従つて、ここでリゾチームに感受性であると
は、リゾチームに対する最小阻止濃度が親株より
も低いことを意味する。また培地中に存在する過
剰のビオチンによつてL―グルタミンの生産が抑
制されないとは、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによるL―グルタミン生産の抑制が実質的に無
視できる程度のものであることを意味する。具体
的には前記のごとき粗原料を用いた場合でも過剰
のビオチンによる影響をうけることなくL―グル
タミンの生産ができることを意味する。 本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株として得られたコリネバクテ
リウム・グルタミクムKY9703(微工研菌寄第
4412号、NRRL11271)、およびブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067を親株として得られた
ブレビバクテリウム・フラブムKY9733(微工研
菌寄第4414号、NRRL11273)があげられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株としてリゾチーム感受性変異
株を取得する方法について以下具体的に説明す
る。該親株を粉末ブイヨン(極東製薬社製)20
g/および酵母エキス5g/の組成を有する
培地(殺菌前PH7.2、以下C培地という)に植菌
し30℃で振盪培養する。中期対数期で培養を中止
し、集菌し、生理食塩水で洗浄後、M/20トリ
ス・マレート緩衝液(PH6.0)に5×108細胞/ml
になるように懸濁する。この懸濁液に最終濃度
500μg/mlになるようにニトロソグアニジンを
加え、25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体
を集め、同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水
に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈してC培地にさ
らに2g/dlの寒天を含む固体培地(以下CA培
地という)に塗りつける。これを30℃で2日間培
養し、生じたコロニー(約6000)を次の3種類の
固体培地にレプリカ法により塗りつける。 CA培地 CLA培地:CA培地を加熱殺菌後、冷却して
培地の温度が45℃まで下がつてから200mg/
になるようにリゾチームを添加した培地。 MA培地:グルコース10g/、NH4C4
g/、尿素2g/、KH2PO41g/、
K2HPO43g/、FeSO4・7H2O10mg/、
MgSO4・7H2O400mg/、MnC2・4H2O2
mg/、ZnSO4・7H2O0.9mg/、CuSO4・
5H2O0.4mg/、Na2B4O7・10H2O0.09mg/
、(NH4)6Mo7O24・4H2O0.04mg/、ビオチ
ン30μg/、サイアミン塩酸塩1mg/、シ
ステイン塩酸塩20mg/および寒天20g/の
組成を有する培地(殺菌前PH7.0)。 30℃で2日間培養後、CA培地で生育し、CLA
培地で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株と
して得る。MA培地で親株と同様に生育する自己
栄養性でリゾチームに対して感受性の変異株は試
験した6000コロニーの中に110株得られた。この
110株中3株がビオチン過剰培地でも多量のL―
グルタミンを生産する能力を有していた。コリネ
バクテリウム・グルタミクムKY9703はかくして
得られた変異株の一例である。 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を
親株とする変異誘導も上記と同様に行つて、ブレ
ビバクテリウム・フラブムKY9733を得た。 上記例示の変異株のMA培地、CA培地、CLA
培地での生育およびリゾチーム感受性度について
親株と比較した結果を第1表に示す。3種類の固
体培地上での生育はレプリカ法で塗りつけ、30℃
で2日間培養後判定した。表中生育欄の+は菌の
生育が観察されたものを、−は生育が観察されな
かつたものを示す。また表中リゾチーム感受性は
次のように試験した。すなわちC培地にて24時間
30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水に
て適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。 この懸濁液104細胞相当を倍々系列の濃度のリ
ゾチームを含有するCA培地に滴下接種し、30℃
で2日間培養する。菌の生育がまつたく認められ
ない最小のリゾチーム濃度を菌のリゾチーム感受
性値(最小生育阻止濃度)とした。
【表】
本発明の微生物を培養するための培地は、炭素
源、窒素源、無機化合物、その他の栄養素を適当
に含む培地ならば、通常L―グルタミン生産に用
いられる天然培地、合成培地のいずれも使用でき
る。たとえば炭素源としては蔗糖、ブドウ糖、糖
蜜などの糖質および殿粉糖化液などが、窒素源と
してはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、尿素などの有機無機窒素化合物、
ペブトン、肉エキス、コーンスチープリカーなど
の天然栄養源などが、無機化合物としては燐酸第
一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化第二
鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸鉛、クロ
ム酸カリ、塩化ニツケル、塩化コバルト、硫酸亜
鉛、モリブデン酸アンモニウムなどが、その他の
栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用い
らえる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件で行い、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が
好適である。培養中は適当な中和剤を用いてPHを
6〜9に調整するのが好ましい。培養は1〜3日
間行えば培養液中に著量のL―グルタミンが生成
蓄積する。培養液からのL―グルタミンの採取
は、菌体を除去した上清液から、イオン交換樹脂
による吸脱着法、濃縮晶析法、等電点晶析法な
ど、従来のL―グルタミンの製造において常用さ
れる諸方法を適宜使用して行うことができる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 1 グルコース75g/,(NH4)2SO420g/,
KH2PO40.5g/,K2HPO40.5g/,
MgSO4・7H2O0.5g/,FeSO4・7H2O2mg/
,MnSO4・4H2O2mg/,サイアミン塩酸塩
1mg/,ビオチン3.5μg/あるいは100μ
g/およびCaCO320g/の組成を有する培
地を調製し、PHを7.2に調整した後、30mlずつ300
ml容のフラスコに入れ、115℃で15分間加熱殺菌
した。この培地に第2表に示した菌の種培養を接
種し、30℃にて40時間振盪培養した。かくして培
養液中に蓄積したL―グルタミン量は第2表に示
す通りであつた。
源、窒素源、無機化合物、その他の栄養素を適当
に含む培地ならば、通常L―グルタミン生産に用
いられる天然培地、合成培地のいずれも使用でき
る。たとえば炭素源としては蔗糖、ブドウ糖、糖
蜜などの糖質および殿粉糖化液などが、窒素源と
してはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、尿素などの有機無機窒素化合物、
ペブトン、肉エキス、コーンスチープリカーなど
の天然栄養源などが、無機化合物としては燐酸第
一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化第二
鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸鉛、クロ
ム酸カリ、塩化ニツケル、塩化コバルト、硫酸亜
鉛、モリブデン酸アンモニウムなどが、その他の
栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用い
らえる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件で行い、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が
好適である。培養中は適当な中和剤を用いてPHを
6〜9に調整するのが好ましい。培養は1〜3日
間行えば培養液中に著量のL―グルタミンが生成
蓄積する。培養液からのL―グルタミンの採取
は、菌体を除去した上清液から、イオン交換樹脂
による吸脱着法、濃縮晶析法、等電点晶析法な
ど、従来のL―グルタミンの製造において常用さ
れる諸方法を適宜使用して行うことができる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 1 グルコース75g/,(NH4)2SO420g/,
KH2PO40.5g/,K2HPO40.5g/,
MgSO4・7H2O0.5g/,FeSO4・7H2O2mg/
,MnSO4・4H2O2mg/,サイアミン塩酸塩
1mg/,ビオチン3.5μg/あるいは100μ
g/およびCaCO320g/の組成を有する培
地を調製し、PHを7.2に調整した後、30mlずつ300
ml容のフラスコに入れ、115℃で15分間加熱殺菌
した。この培地に第2表に示した菌の種培養を接
種し、30℃にて40時間振盪培養した。かくして培
養液中に蓄積したL―グルタミン量は第2表に示
す通りであつた。
【表】
実施例 2
甘蔗廃糖蜜200g/(グルコースとして100
g/相当量),(NH4)2SO420g/,
KH2PO0.5g/,K2HPO40.5g/,MgSO4・
7H2O0.5g/,FeSO4・7H2O2mg/,
MnSO4・4H2O2mg/,サイアミン塩酸塩1
mg/の組成を有する培地3を5ジヤーフア
ーメンターに仕込み、常法により殺菌した後、ア
ンモニア水でPHを0.7に調整してから、第3表に
示した菌の種培養300mlを植菌し、30℃、通気量
5/min,600rpmにて培養を行つた。培養期
間中はアンモニア水でPHを6.5に維持しながら36
時間培養した。培養液中に蓄積したL―グルタミ
ン量は第3表に示す通りであつた。 KY9703株の発酵終了液1より遠心分離によ
つて菌体を除去して得た上清液から、イオン交換
樹脂を用いる常法にしたがつてL―グルタミンの
精製を行つたところ、L―グルタミンの粗結晶
11.6gを得た。
g/相当量),(NH4)2SO420g/,
KH2PO0.5g/,K2HPO40.5g/,MgSO4・
7H2O0.5g/,FeSO4・7H2O2mg/,
MnSO4・4H2O2mg/,サイアミン塩酸塩1
mg/の組成を有する培地3を5ジヤーフア
ーメンターに仕込み、常法により殺菌した後、ア
ンモニア水でPHを0.7に調整してから、第3表に
示した菌の種培養300mlを植菌し、30℃、通気量
5/min,600rpmにて培養を行つた。培養期
間中はアンモニア水でPHを6.5に維持しながら36
時間培養した。培養液中に蓄積したL―グルタミ
ン量は第3表に示す通りであつた。 KY9703株の発酵終了液1より遠心分離によ
つて菌体を除去して得た上清液から、イオン交換
樹脂を用いる常法にしたがつてL―グルタミンの
精製を行つたところ、L―グルタミンの粗結晶
11.6gを得た。
【表】
Claims (1)
- 1 コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウ
ム属に属し、リゾチームに感受性を有し、かつ培
地中に存在する過剰のビオチンによつてL―グル
タミンの生産が抑制されない微生物を培地に培養
し、L―グルタミンを培養物中に生成させ、該培
養物からL―グルタミンを採取することを特徴と
するL―グルタミンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11883479A JPS5642593A (en) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Production of l-glutamine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11883479A JPS5642593A (en) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Production of l-glutamine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5642593A JPS5642593A (en) | 1981-04-20 |
JPS6249038B2 true JPS6249038B2 (ja) | 1987-10-16 |
Family
ID=14746301
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11883479A Granted JPS5642593A (en) | 1979-09-18 | 1979-09-18 | Production of l-glutamine |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5642593A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01150310U (ja) * | 1988-04-06 | 1989-10-18 | ||
JPH026835U (ja) * | 1988-06-28 | 1990-01-17 | ||
JPH0525989B2 (ja) * | 1987-08-26 | 1993-04-14 | Shin Meiwa Ind Co Ltd | |
WO2000014241A1 (fr) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1185197A (en) * | 1981-04-30 | 1985-04-09 | Akira Furuya | Lysozyme-sensitive microorganism |
JP4746684B2 (ja) * | 2009-03-24 | 2011-08-10 | 有限会社長州電気 | 伸縮装置 |
-
1979
- 1979-09-18 JP JP11883479A patent/JPS5642593A/ja active Granted
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0525989B2 (ja) * | 1987-08-26 | 1993-04-14 | Shin Meiwa Ind Co Ltd | |
JPH01150310U (ja) * | 1988-04-06 | 1989-10-18 | ||
JPH026835U (ja) * | 1988-06-28 | 1990-01-17 | ||
WO2000014241A1 (fr) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene |
US7223587B2 (en) | 1998-09-04 | 2007-05-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Gene conferring lysozyme insensitivity to Corynebacterium |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5642593A (en) | 1981-04-20 |
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