HU200752B - Process for producing 6-hydroxynicotinic acid in biological way - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására, biotechnikai úton.

A 6-hidroxi-nikotinsav szerves szintézis útján történő előállítására több eljárás ismert, például 2-piridonból kiindulva a hidroxiaromások Kolbe-Schmidt-féle karboxilezésével. Más eljárások almasavból vagy piridin-2,5-dikarbonsavból indulnak ki. [Lásd: Brincourt et al,: J. Chim. Ther. (1973), 8 (2) 226-232, valamint a 7731/80 számú svájci szabadalmi bejelentést].

Az ismert eljárások azonban nem teszik lehetővé tiszta 6-hidroxi-nikotinsav egyszerű, olcsó és környezetkímélő előállítását. Az eljárások hátránya, hogy a reakció nem kvantitatív, és nemkívánatos melléktermékek kísérik. A melléktermékek szennyeződésként jelennek meg, és ezért a reakció befejeződése után el kell azokat távolítani.

Ismert továbbá, hogy a Bacillus, Pseudomonas, Clostridium és Mycobakterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok nikotinsavon fejlődnek, és ezt az anyagot szén-, nitrogén- és energiaforrásként alkalmazzák [Allinson M.J.C.: J. Bioi. Chem, (1943), 147, 785; Behrmann EJ.; Stanier R.V.: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923],

A nikotinsavat valamennyi vizsgált organizmus már az első lépésben 6-hidroxi-nikotinsavvá oxidálja. A 6-hidroxi-nikotinsavat rögtön és jelentős felhalmozás nélkül tovább alakítja. Ez a lebontás aerob mikroorganizmusoknál egészen víz, széndioxid és ammónia eléréséig lejátszódik.

Csak a mikroorganizmusok feltárása után vált lehetővé, hogy a nikotinsav-hidroxilázt többé vagy kevésbé tiszta formában izolálják. [Hunt A.L.: Biochem. J. (1958), 72, 1-7]

A nikotinsav-hidroxiláz mintegy 400 000 Dalton értékű nagy molekula. Ez a molekula flavinkofaktorokat, számos fématomot (Fe, Mo), szervetlen kénatomot és néhány esetben szelént is tartalmaz. A nikotinsav-hidroxiláz csak megfelelő elektronátadó rendszerek (például Cytochrome, Flavinok, NADP⁺ és más hasonló rendszerek) jelenlétében aktív.

A nikotinsav-hidroxiláz sejtextraktumokból izolálható és az enzimpreparátum a nikotinsav hidroxilezéséhez felhasználható. Ezt az elvet követve sikerült kismennyiségű 6-hidroxi-nikotinsavat előállítani [Behrmann és Stanier: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923], Eltekintve az enzimelválasztás magas költségeitől, és a nikotinsav-hidroxiláz bomlékonyságától, jelen esetben gondoskodni kell a kofaktorok és az elektronátadó rendszerek regenerálásáról is.

Számos fermentációs és enzimreakciós eljárásnál a termék koncentrációja a reakcióelegyben nagyon alacsony és ezért elválasztásához nagy térfogatú reakcióelegyet kell feldolgozni. Ez magas feldolgozási, berendezési és szennyvíztisztítási költségekkel jár.

Hasonló a helyzet a 6-hidroxi-nikotinsav biotechnológiai előállításánál is (825/84 számú svájci szabadalmi bejelentés). Elvileg lehetséges olyan nikotinsav-oldat enzimatikus hidroxilezése, amelyben a nikotinsav koncentrációja 0,1 tömeg% és telítettség között változik. A sejtekben található enzim stabilitása azonban magasabb szubsztrátkoncentrációnál igen alacsony. Ez jelentősen fokozza a felhasznált enzim mennyiségét és költségeit.

Ezzel szemben a mikroorganizmusok (Achromobacter) növekedése már viszonylag alacsony nikotinsav-koncentrációknál is erősen gátolt. Az enzimveszteségek a sejt lassú növekedésével kompenzálhatok. Ez azonban csak hígított nikotinsavoldatban (0,1-1,5 tömeg%) történhet meg.

Ebből az következik, hogy a nikotinsav enzimatikus hidroxilezését hígított oldatban kell végezni, ami növeli a feldolgozás költségeit.

A találmány feladata, hogy a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan eljárást dolgozzunk ki, amely lehetővé teszi nagytísztaságú 6-hidroxi-nikotinsav gazdaságos előállítását nikotinsavból.

A 6-hidroxi-nikotinsav biotechnológiai úton történő előállítása során a találmány értelmében úgy járunk el, hogy a nikotinsavat ekvivalens mennyiségű magnézium vagy bárium ion jelenlétében nikotinsav-hidroxilező mikroorganizmussal enzimatikusan hidroxilezzük, és a reakció közben képződő és a reakcióelegyből kiváló 6-hidroxi-nikotinsav-magnézium- vagy -báriumsót elválasztjuk és az elválasztott sóból a 6-hidroxi-nikotinsavat felszabadítjuk.

A bioreaktort célszerűen olyan magnézium- vagy bárium-nikotinát oldattal töltjük fel, amelyben a só koncentrációja 0,1 tömeg% és telítettség között változik, majd hozzáadjuk a nikotinsav-hidroxilázt tartalmazó sejteket. A reakció közben keletkező magnézium- vagy bárium-hidroxi-nikotinát a telítettség elérése után kikristályosodik.

A találmány szerinti eljárás során a reakcióhőmérséklet 10-50 °C között, előnyösen 25-35 °C között változtatható, a pH értéket nikotinsav adagolásával

5-9 közötti állandó értéken tartjuk.

A találmány szerinti eljárás előnyösen folyamatos üzemmódban valósítható meg, amelynek során a 6-hidroxi-nikotinsav enzimatikus hidroxilezésének megfelelő módon 0,2-10 tömeg%-os magnéziumvagy bárium-nikotinát oldatot vezetünk be az Achromobacter xylosoxydans pH=5-9 értéken tartott szuszpenziójába, és a 6-hidroxi-nikotinsav keletkező magnézium- vagy báriumsóját folyamatosan eltávolítjuk.

A magnézium- vagy bárium-hidroxi-nikotinát rossz oldékonysága lehetővé teszi, hogy a termék a reakció közben magnézium- vagy báriumsó formájában szelektíven kiváljon, míg a nikotinsav oldatban marad. A magnézium- vagy bárium-hidroxi-nokotinát finom mikrokristályokat képez, amely szűréssel vagy centrifugálással könnyen elválasztható. A sóból savanyítással megkapható a tiszta 6-hidroxi-nikotinsav.

A magnézium- vagy bárium-nikotinát kiindulási anyagok oldat formájában történő adagolását a vezetőképesség mérésének alapján vezetőképesség-szabályozóval összekapcsolt szivattyúval automatikusan végezhetjük. A magnézium- vagy bárium-hidroxi- nikotinét kristályok, amelyek a reakcióedény vagy egy beépített elválasztó alján gyűlnek össze, szakaszosan vagy folyamatosan eltávolíthatók.

A bioreaktorba szilárd anyag adagoló szerkezettel természetesen szilárd nikotinsav is adagolható, megfelelő mennyiségű magnézium-oxiddal együtt, vagy azzal párhuzamosan.

Ily módon gyakorlatilag zárt rendszert kapunk, amelybe a szilárd kiindulási anyagokat bevezetjük, és szilárd végterméket kapunk. Ebben a rendszerben

HU 200752 Β hígított szubsztrát-oldattal, vagyis megfelelő enzimstabilitást biztosító körülmények között dolgozhatunk, feldolgozási és szennyvíztisztítási nehézségek jelentkezése nélkül.

Az enzimatikus hidroxilezést nikotinsav-hidroxiláz forrásként alkalmazott mikroorganizmus segítségével végezzük.

Azt tapasztaltuk, hogy a 6-hidroxi-nikotinsav jó eredménnyel állítható elő a Pseudomonas, Bacillus és Achromobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok segítségével. Előnyösen alkalmazhatók a Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 (tipikus törzs), Pseudomonas putida KB1 NCIB 10521, NCIB 8176, vagy egy bacillus törzs, amelyet Ensign és Rittenberg [J. Bioi. Chem. 239, 2285-2291 (1964)] ismertetett.

Különösen előnyösen alkalmazható az új Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 törzs, amely nikotinsav-anyalúgből izolálható.

Morfológia és fiziológia

Tenyésztés: táptalajon (1) A sejt alakja: 2-3,5 gm hosszú és mintegy 0,6 gm széles pálcikák (2) Elrendeződés: egyesével (3) Motiütás: erősen mozgékony (körkörösen ostoros) (4) Endospórák: kizárólag aerob (5) Gram: negatív (6) Oxidáz: pozitív (7) Kataláz: pozitív.

A törzs minden jellemzőjében azonos az Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 tipikus törzzsel. (Kivétel: az acetamid hidrolízise.)

A fenti törzseket a Deutsche Samtnlung von Mikroorganismen (DSM); (Mikroorganizmusok Németországi Gyűjteménye) Intézetnél (Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, NSZK) a DSM 2402 és DSM 2783 szám alatt vannak deponálva.

Az új DSM 2783 számú törzs deponálásának napja: 1983. 11. 18.

A Pseudomonas putida NCIB 10521 és 8176 számú törzsek a National Collection of Industrial Bacteria Intézetnél (Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB98DC, Skócia) találhatók meg.

A fenti törzsek egyedüli szén-, nitrogén- és energiaforrásként nikotinsavon fejlődnek. A mikroorganizmusok tenyésztését az ilyen típusú törzseknél szokásos eljárással végezzük. Például a DSM 2783 törzs hígított és sterilizált nikotinsav-oldatban (0,05-0,5 tömeg%) fermentálható, amely pH=7,0 foszfát-puffért, - 50 mmól - valamint nyomelemeket (20 mg/1 CaCl2-2H2O, 10 mg/1 MnS04, 5 mg/1 FeSCL x 7H₂O, 0,1 mg/1 CoCl₂ x 6H₂O, 0,1 mg/1 CuSO4 x 5H₂O, 0,1 mg/1 ZnSO4 x 7H₂O, 0,1 mg/1 NaMoO4 x 2H₂O), továbbá a fejlődés gyorsítása érdekében kis mennyiségű élesztőkivonatot (Merck) (0,05 tömeg%) tartalmaz.

A fermentációt 24-48 órán keresztül 30 ’C hőmérsékleten aerob körülmények között végezzük. A kapott biomassza (mintegy 10 g nedves tömeg literenként) nikotinsav-hidroxilázban gazdag. A sejteket lecentrifugáljuk, és azonnal vagy -20 ’C hőmérsékleten történő tárolás után közvetlenül, vagyis ezimkinyerés vagy tisztítás nélkül felhasználható a nikotinsav hidroxilezéséhez.

A nikotinsav hidroxilezése érdekében célszerű, ha a nikotinsav leépítését nem az első lépéssel, vagy nem a 6-hidroxi-nikotinsavvá történő hidroxilezéssel indítjuk. Ebben a fázisban a mikroorganizmus fejlődése a kitermelés rovására növekszik.

Mint említettük, a DSM 2783 törzs hígított nikotinsav oldatban (0,05-0,5 tömeg%) jól fejlődik, és a nikotínsavat teljes mennyiségben felhasználja.

A nikotinsav növekvő koncentrációja azonban gátolja a sejt növekedését és 2 tömeg% nikotinsav koncentráció felett további fejlődés nem figyelhető meg. A nikotinsav-hidroxiláz aktivitása a sejten belül változatlan marad.

A katabolikus leépítés a hidroxilező lépés után megszakad. Ez kiküszöböli a mellékreakciókat és növeli a 6-hidroxi-nikotinsav tisztaságát és kitermelését.

A következő példák közelebbről mutatják be a találmány gyakorlati alkalmazását.

1. példa

Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 sejtek előállítása

51,9 g Na₂HPO4 x 2H₂O 20,0 g KH₂PO4, 2,5 g élesztőkivonat és 10 g nikotinsav keverékéből, valamint 4750 ml vízből álló tápoldatot töltünk a fermentorba, és 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Ezután 30 ’C hőmérsékletre hűtjük és 500 ml índítókultúrával beoltjuk. A fermentálást 30 °C hőmérsékleten pH=7,0 érték mellett levegőztetés közben 24 órán keresztül végezzük. Ezután 200 ml steril oldatot adunk hozzá, amely vízben oldva 10 g nikotinsavat és 2,5 g élesztőkivonatot tartalmaz. A fermentációt 42 órán keresztül folytatjuk. Ezután a kultúrát begyújtjuk és az Achromobacter sejteket centrifugálással (30 perc 15 000 g mellett) elválasztjuk. Ily módon 38,3 g nedves biomasszát kapunk.

Egy 7 literes fermentorban szilárd magnéziumoxid adagolásával előzetesen pH=7,l értékre állított 2750 ml 2 %-os nikotinsav oldatot 30 ’C hőmérsékletre melegítünk. A hidroxilezés 200 ml koncentrált Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 szuszpenzió (végkoncentráció: 10¹⁰ sejt/ml) hozzáadásával indul.

Habzásgátlő szer [például poli(propilén-glikol) P2000] hozzáadás után az elegyet intenzív kevertetés közben levegőztetjük. A fermentort 30 ’C hőmérsékleten termosztáljuk. A pH értékét pH- mérő és nikotinsav-oldat adagoló (teljes felhasználás 23 g) segítségével pH=7,0 értéken tartjuk. A szubsztrátkoncentrátumot vezetőképességmérő segítségével folyamatosan méijük. Ezt a szabályozón keresztül egy perisztaltikus pumpa segítségével kapcsoljuk a rendszerhez. Ha a szubsztrátkoncentráció a magnézium-hidroxi-nikotinát képződése és kiválása miatt csökken, egy előtétedényből 1 mólos magnézium-nikotinát oldatot pumpálunk a rendszerhez, míg az eredeti vezetőképességet ismét elérjük. így a szubsztrátkoncentrátum automatikusan szabályozható.

A magnézium-hidroxí-nikotinát kristályai a fermentor edény alján gyűlnek össze, onnan szakaszosan eltávolítjuk, leszűrjük és a szűrletet a fermentorba visszavezetjük.

A rendszert 3 napon keresztül folyamatosan üzemeltetjük, miközben 3 liter 1 mólos magnézium-nikotinát oldatot adagolunk hozzá. Az adagolás befe3

HU 200752 Β jeződése után a reaktort még 5 órán keresztül üzemeltetjük, majd kiürítjük. A szuszpenziót leszűrjük, amelynek során 5,3 liter szűrletet és 650 g nedves magnézium- vagy bárium- hidroxi-nikotinátot kapunk.

A magnézium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét

2,5 liter vízben szuszpendáljuk és koncentrált sósavval pH=l,2 értékig savanyítjuk. A kiváló 6-hidroxi-nikotinsavat leszűrjük. A még nedves kristályokat 400 ml vízzel mossuk, majd szántjuk.

Ily módon 468,8 g fehér mikrokristályos terméket kapunk, amely HPLC-analízis alapján 98,8 % 6-hidroxi-nikotinsavat tartalmaz. A felhasznált nikotinsav mennyiségére vonatkoztatott kitermelés értéke 91,6 %. Olvadáspont: 139 ’C.

2. példa

2,5 liter térfogatú fermentorba 1 liter 3 tömeg%-os vizes nikotinsav szuszpenziót töltünk és szilárd báriumoxid adagolásával pH=7,0 értékre állítjuk. Ezt a szubsztrát oldatot 30 ’C hőmérsékleten termosztáljuk. Habzásgátló szer (Rhodorsil 70414) hozzáadása után 70 ml koncentrált Achromobacter xylosoxydans DSM 2789 szuszpenziót (OD⁵⁵°=90) adunk hozzá. A szuszpenziót intenzíven levegőztetjük és kevertetjük. A pH értékét szilárd nikotinsav adagolásával folyamatosan 7,0 értéken tartjuk. A szubsztrátum (1 mólos bárium-nikotinát oldat) adagolását az 1. példában ismertetett módon vezetőképesség mérő és szabályozó rendszer segítségével automatizáljuk.

2-3 óra után a bárium-hidroxi-nikotinát koncentrációja eléri a telítettségi értéket, és a tennék kristályosodni kezd. A kristályok a fermentor alján gyűlnek össze, ahonnan szakaszosan el távolíthatók. A kristályokat leszűrjük és a szűrletet visszavezetjük.

A rendszert 60 órán keresztül folyamatosan üzemeltetjük. A hidroxilezés alatt I liter 1 mólos nikotinsavat (báriumsó formájában) adagolunk a fermentorba. A pH ellenőrzéséhez további 6,8 g szilárd nikotinsavat használunk el.

Ezután a fermentort kiürítjük és a faira tapadt bárium-hidroxi-nikotinát kristályokat eltávolítjuk. A szuszpenziót leszűrjük. Ily módon 1,9 liter szűrletet kapunk, amely HPLC-analízis alapján 0,5 tömeg% nikotinsavat és 2,4 tömeg% 6-hidroxi-nikotinsavat tartalmaz.

A nedves bárium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét 200 ml vízben szuszpendáljuk, koncentrált sósavval pH=l,2 értékre állítjuk. 2 órás kevertetés után a 6-hidroxi-nikotinsavat leszűrjük, 100 ml vízzel mossuk és vákuumban 50 ’C hőmérsékleten szárítjuk. Ily módon 118,9 g enyhén sárgás 6-hidroxi-nikotinsavat kapunk, amely HPLC-analízis alapján 98,3 %os. Ez a felhasznált nikotinsav mennyiségére vonatkoztatva 64,7 %-os kitermelésnek felel meg. Olvadáspont: 139 ’C.

Ha a szűrletben visszamarad bárium-hidroxi-nikotinsav analítikailag kimutatott mennyiségét is hozzászámítjuk, az ossz kitermelés értéke 89,9 %,

3. példa

1. Pseudomonas putida NCIB 8176 biomassza előállítása g NazHPOa x 2H?O, 20 g KH2PO4, 2,5 g élesztőkivonat és 10.0 g nikotinsav keverékéből és 4750 ml vízből álló tápoldatot egy 7 literes Che4 map-fermentorban sterilizálunk 20 percen keresztül 120 ’C hőmérsékleten. Ezután 30 ’C hőmérsékletre hűtjük, majd 50 ml steril nyomelemoldatot adunk hozzá, oly módon, hogy az alábbi végkoncentrációkat érjük el:

CaCb χ 2H2O 20 mg/1, MnSO4 10 mg/1, FeSOa x 7H₂O 5 mg/1, C0CI2 χ 6H2O 0,1 mg/1, CuSO₄ x 5H2O 0,1 mg/1, ZnSO4 χ 7H2O 0,1 mg/1, NaMoÖ4 χ 2H2O 0,1 mg/1.

A fermentort 500 ml Pseudomonas indítókultúrával oltjuk be és 30 ’C hőmérsékleten pH=7,0 érték mellett levegőztetés közben 24 órán keresztül fermentáljuk. 24 óra elteltével 200 ml steril oldatot adunk hozzá, amely 10 g nikotinsavból és 2,5 g élesztőkivonatból áll. 38 óra elteltével a sejttömeget centrifugálással (30 perc 10 000 g mellett) elválasztjuk. Ily módon 43,3 g nedves biomasszát kapunk.

2. A nikotinsav hidroxilezése

3,5 literes fermentort 2 liter 0,5 tömeg%-os nikotinsavoldattal töltjük meg, amelyet szilárd magnéziumoxiddal pH=7,0 értékre állítunk, majd 30 ’C hőmérsékletre melegítünk.

A hidroxileződés 20 g nedves Pseudomonas putida NCIB 8176 biomassza hozzáadásával indul be, amely biomasszát előzőleg 100 ml vízben felvettük. Habzásgátlószer [poli(propílén-glikol) P-200, Fluka] hozzáadása után a rendszert olyan sebességgel levegőztetjük, hogy az oldott oxigén koncentrációja 3-5 mg/1 értéken maradjon. A rendszert nikotinsav adagolásával (teljes felhasználás 15,2 g) pH=7,0 értéken tartjuk.

A szubsztrátkoncentrátumot 1 mólos magnézium-nikotinát oldat vezetőképesség alapján történő szabályozott adagolásával konstans értéken tartjuk (lásd az 1. példát).

A telítési koncentráció elérése után a 6-hidroxi-nikotinsav magnéziumsója kiválik. A fermentor alján összegyűlő kristályokat szakaszosan eltávolítjuk, majd szűrjük. A keletkező szűrletet új 1 mólos magnézium-nikotinát oldat előállításához használjuk fel. A kristályokat nedvesen tároljuk.

A kiindulási anyag (1 mólos magnézium-nikotinát oldat) adagolását mérjük, és a fermentor teljes enzimaktivitásának meghatározásához használjuk fel. Az aktivitás csökkenését nedves, friss biomassza hozzáadásával kompenzáljuk (naponta egyszer).

A fermentálást 5 napon keresztül végezzük. Ez idő alatt 1,6 liter I mólos magnézium-nikotinát oldatot vezetünk a fermentorba. A kitermelés meghatározásához a fermentort kiürítjük és a falra tapadt kristályokat eltávolítjuk. A kristályokat leszűrjük.

A nyert magnézium-hidroxi-nikotinát teljes mennyiségét 1,5 liter vízben szuszpendáljuk és koncentrált sósavval lassan pH=l,5 értékre állítjuk. A 6-hidroxi-nikotinsav kristályait leszűrjük, a szűrőn 200 ml vízzel mossuk és vákuumban 60 ’C hőmérsékleten szárítjuk.

Ily módon 365,0 g fehér kristályt nyerünk, amely HPLC-analízis alapján 99,3 %-os. A fermentorba bevezetett nikotinsav mennyiségére számolva ez 92,4 %-os kitermelésnek felel meg. Olvadáspont: 139 ’C.

4. példa

A Bacillus sejtek előállításához Ensign és Rittenberg módszerét (J. Bioi. Chem. 239, 2285—2291, 1964) alkalmazzuk. Ennek során egy tápoldatot.

HU 200752 Β amelynek összetétele 1000 ml vízben 13,3 g KH2PO4 x 3H₂O, 4 g KH2PO4, 1 g (NH₄)2SO4, 0,1 g MgSOa, g nikotinsav, 0,02 g CaCl₂ x 2H₂O, 0,01 g MnSO₄ χ 4H2O, 5 mg FeSO₄ x 7H₂O és 0,5 g élesztőextraktum, fermentorban 20 percen keresztül 120 ’C hőmérsékleten sterilizálunk. Ezután hagyjuk 30 *C hőmérsékletre hűlni, majd a talajból a szokásos módon izolált starterkultúrával beoltjuk és 30 ’C hőmérsékleten, pH=7,0 értéken levegőztetés mellett 24 órán keresztül fermentáljuk. Ezután hozzáadjak 2,5 g rü- 70 kotinsav és 2,5 g élesztőextraktum 50 ml vízben felvett steril oldatát és tovább fermentáljuk. így 7$ g nedves biomasszát kapunk.

Egy 2,5 literes fermentorba 1000 ml 2 tömeg%-os nikotinsav oldatot adagolunk, amelyet előzőleg szilárd 15 magnézium-oxiddal pH=7,l értékre állítottunk és 30 ’C hőmérsékletre melegítünk. A hidroxilezést 70 ml koncentrált Bacillus szuszpenzió (végkoncentráció 10¹⁰ sejt/ml) hozzáadásával indítjuk. Habosodásgátló (például polipropilénglikol P-2000) hozzáadása után az 20 elegyet intenzív kevertetés közben levegőztetjük. A fermentor hőmérsékletét 30 °C értékre állítjuk be. A pH értéket nikotinsav oldat segítségével (összfelhasználás 7,5 g) 7,0-nál tartjuk. A szubsztrát koncentrátumot vezetőképességmérővel folyamatosan mérjük. A 25 mérőberendezést perisztaltikus pumpával ellátott szabályozón keresztül csatlakoztatjuk. Amikor a szubsztrát koncentrátum a magnézium-hidroxi-nikotinát képződése és kicsapódása következtében lecsökken, az eredeti vezetőképességet 1 mól/1 magnézium-nikotinát 30 adagolásával visszaállítjuk. így a szubsztrát koncentrátum automatikusan szabályozható. A magnézium-hidroxi-nikotinát kristályok a fermentor fenekén gyűlnek össze, ahonnan szakaszosan eltávolítjuk, majd szűrjük és a szűrletet a fermentorba visszavezetjük. A 35 berendezést 3 napon keresztül folyamatosan üzemeltetjük, végül 1 liter 1 mól/1 koncentrációjú magnézium-nikotinát oldatot adunk hozzá, 5 órán keresztül tovább járatjuk, majd kiürítjük. A szuszpenziót szűrjük, amelynek során 1,8 1 szűrletet és 220 g nedves mag- 40 nézium- vagy bárium-hidroxi-nikotinátot kapunk. A magnézium-hidroxi-nikotinát összmennyiségét 250 ml vízben szuszpendáljuk és koncentrált sósavval pH=l ,2 értékre állítjuk. A kiváló 6-hidroxi-nikotinsavat 100 ml vízzel mossuk és szárítjuk. így 165,3 g fehér, mikrokristályos terméket kapunk, amely HPLC analízis szerint 99 % tisztaságú 6-htdroxi- nitotinsav, ami a bevitt nikotinsavra vonatkoztatva 90,5 %-os kitermelésnek felel meg, olvadáspont 139 *C.

J45. példáik

Az í. p&fáfeatn megadott módon Achromobacter xytoswsydfans DSM 2783 segítségével járunk el, amelynek során változtatjuk a hőmérsékletet és a pH-értéket.

Példaszám	PH	Hőmérséklet (’C)	Kitermelés
5.	8	10	81,4
6.	9	20	83,7
7.	5	40	82,9
8.	6	50	88,6

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására nikotinsavnak Pseudomonas, Bacillus vagy Achromobacter nikotinsavbontó mikroorganizmusok jelenlétében végzett enzimatikus hidroxilezésével, azzal jellemezve, hogy a nikotinsav magnézium- vagy báriumsójának legalább 0,1 tömeg%-os oldatát pH=5-9 értéken és 10-50 “C hőmérsékleten a mikroorganizmus szuszpenziójába vezetjük, a képződő és kiváló 6-hidroxi-nikotinsav magnéziumvagy báriumsót eltávolítjuk és a sóból a 6-hidroxi-nikotinsavat felszabadítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót folyamatosan végezzük.
3. 3. Az Lés 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 törzset alkalmazunk.