JP2800005B2 - デオキシリボ核酸の製造法 - Google Patents
デオキシリボ核酸の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、発酵法によるデオキシリボ核酸（以下、DN
Aという）の製造法に関するものであり、更に詳しくは
シュードモナス（Pseudomonas）属に属し、DNA生産能を
有する微生物を培養し、菌体内に多量に生成蓄積せしめ
たDNAを、分離採取するDNAの製造法に関する。 ［従来の技術］ 本発明で得られるDNAは、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤な
どの医薬品の重要な合成原料として有用な物質である。 従来、このDNAを製造する方法としては、魚類白子を
原料として抽出精製する方法が一般的である。また、発
酵法によるDNAの製造法も知られており、例えば、アー
スロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス属、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ミクロコッ
カス（Micrococcus）属、コリネバクテリウム（Coryneb
acterium）属、カンディダ（Candida）属またはアスペ
ルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、該微生
物の資化しうる炭素源含有培地を用いて好気的に培養し
て、培地中にDNAを生成させる方法（特公昭55−35106号
公報）、シュードモナス属に属する細菌をｎ−パラフィ
ンを炭素源とする培地で培養し、菌体外にDNAを蓄積さ
せる方法〔アグリカルチァル・バイオロジカル・ケミス
トリー（Agricultural Biological Chemistry）第36
巻、第133頁（1972年）および第38巻、第293頁（1974
年）〕、シュードモナス属に属する微生物を酢酸および
／または酢酸塩を主たる炭素源とする培地にキレート剤
を添加し、培養方法として培養初期は好気的条件下で培
養し、対数期に静置培養条件下に移す方法を採用するこ
とにより、DNAを菌体外に蓄積させる方法（特開昭55−4
8399号公報）、アシネトバクター（Acinetobacter）属
に属する微生物を培養して、培養物からDNAを採取する
方法（特開昭61−115497号公報）が知られている。 ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、DNAの製造法として、魚類白子より抽
出精製する方法は、抽出操作のさいのDNAの損失、夾雑
物との分離・精製操作の煩雑さ、原料である魚類の白子
の入手が季節により制約される等の問題点を有する。ま
た、発酵法による製造法は、一般に得られるDNA溶液が
希薄であるため濃縮コストが大きくなるという問題点が
あり、且つ炭素源としてｎ−パラフィンを用いる方法で
は、ｎ−パラフィンが不溶性のため、高回転の機械的撹
拌又は、界面活性剤の添加により油滴を分散させて培養
を行う必要が生じ、基質供給速度が制限され、高い生産
性が確保できないなどの問題点を有している。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる問題点を解決し、より効率の良
い発酵法によるDNAの製造方法を完全にさせるため検討
を重ねた結果、 従来のようにDNAを菌体外、即ち培地中に蓄積させる
のではなく、シュードモナス属に属し、DNAを生産能を
有する微生物を適切な条件で培養することにより菌体形
成と同時に菌体内にDNAを蓄積できることを見出し、本
発明を完成した。 すなわち本発明はシュードモナス属に属し、デオキシ
リボ核酸を生産する能力を有する微生物を、炭素源に酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜から選ばれた１種以上の天
然炭素源を炭素重量として２〜５％、窒素源に酵母エキ
ス、ペプトン、コーンスティーブリカー、大豆かすから
選ばれた１種以上の天然有機窒素源を窒素重量として0.
1％以上、無機質としてマグネシウムを0.004％以上含む
培地を用い、酸素充足条件下に培養して、菌体内に多量
のデオキシリボ核酸を生成蓄積せしめたのち、集菌した
菌体よりデオキシリボ核酸を採取することを特徴とする
デオキシリボ核酸の製造法を提供するものである。 本発明に於て、特に重要なのは菌体内にDNAを蓄積せ
しめる点であり、これを行うための培地及び培養条件で
ある。 すなわち、本発明にあっては、シュードモナス属に属
する微生物を、炭素源に酵素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜
から選ばれた１種以上の天然炭素源を炭素重量として２
〜５％、窒素源に酵母エキス、ペプトン、コーンスティ
ーブリカー、大豆かすから選ばれた１種以上の天然有機
窒素源を窒素重量として0.1％以上、マグネシウムを0.0
04％以上含む培地を用い、酸素充足条件下に培養するこ
とにより、培養の初期（対数増殖期後期から定常初期ま
でをいう）において、菌体形成と同時に菌体内に多量の
DNAを生成蓄積せしめる点が特に重要である。 この菌体内のDNAは、培養液から集菌した菌体を熱ア
ルカリ等で処理することで、容易に高濃度溶液として得
られるもので回分培養のみならず連続培養も可能とする
ものである。 次に、本発明で用いる微生物について具体的に説明す
る。 （Ａ） 生産菌 本発明で使用される菌は、シュードモナス属に属し、
菌体内にDNAを高濃度に蓄積するものであればよく、そ
の種（species）は問わない。具体的にはシュードモナ
ス・エルギノーサ（P.aeruginosa）KYU−１（微工研菌
寄第9701号）、シュードモナス・エルギノーサIFO334
5、シュードモナス・フルオレッセンス（P.fluorescen
s）IFO3081、シュードモナス・メラノゲナム（P.melano
genum）IFO12020、シュードモナス・オーレオファシエ
ンス（P.aureofaciens）IFO3521、シュードモナス・ポ
リカラー（P.polycolor）等が示される。特に、シュー
ドモナス・エルギノーサKYU−１は、菌体内に多量のDNA
を生成蓄積する。 シュードモナス・エルギノーサKYU−１は本発明者ら
によって、福岡市大字箱崎地内の空気中より分離された
もので、以下に示す菌学的性質を有する。 （ａ） 形態 細胞の形および大きさ:0.5〜0.6×1.5〜1.6μの短
桿菌 細胞の多形性：なし 運動性、鞭毛の着生状態：運動性あり、単極毛 胞子：なし グラム染色性：陰性 抗酸性：なし （ｂ） 生育状態 肉汁寒天平板培養：生育良好、白色光沢あり、水溶
性蛍光色素（ピオシアニン）産生 肉汁寒天斜面培養：生育良好、白色光沢あり、 肉汁液体培養：表面発育なし、濁度A660＝３〜５ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチン液化 リトマス・ミルク：アルカリ反応 （ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の完全：培養３時間後に試薬を添加すると桃
赤色を呈し、６時間後には赤褐色を呈するとともに赤褐
色の沈澱（亜硝酸塩）を生成。さらに20時間後にはガス
を発生し、呈色反応は認められない。 脱窒反応：あり インドールの生成：あり 硫化水素の生成：あり クエン酸の利用：クエン酸資化 無機窒素源の利用：亜硝酸資化、アンモニウム塩資
化 色素の生成：水溶性蛍光色素（ピオシアニン）産生 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲:5℃における生育なし、42℃における生
育あり、至適温度37℃ 11 酸素に対する態度：好気性 12 Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による）：糖を酸化
的に分解する 13 糖類から酸およびガスの生成の有無：グルコースか
ら酸化的にグルコン酸、２−ケトグルコン酸を生成 14 Tween 80の加水分解：陽性 以上の菌学的性状から本菌株はシュードモナス・エル
ギノーサと同定された。なお、本菌株はシュードモナス
・エルギノーサKYU−１と命名し、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した（微工研寄第9701号）。 （Ｂ） 培地 本発明で用いられる培地は、該微生物が良好に生育す
るとともに、菌体内にDNAを生成蓄積するために必要な
炭素源、窒素源、無機質およびその他の栄養素等を含む
ものであり、炭素源、窒素源ともに資化されたものであ
れば特に限定されない。具体的には、炭素源としては酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜から選ばれた１種以上の天
然炭素源が特に良好であり、炭素重量として２〜５％含
むことが望ましい。窒素源としては酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティーブリカー、大豆かすから選ばれた１
種以上の天然有機窒素源が特に良好であり、窒素重量と
して0.1％以上含むことが望ましい。また無機質の主な
ものを元素としてあげるとリン、マグネシウム、マンガ
ン、鉄、カリウム、亜鉛、コバルト、ニッケル等が例示
されるが、特にマグネシウムは必須であり、0.004％以
上含むことが望ましい。 （Ｃ） 培養条件 DNAを効率よく生成するとともに、生成したDNAを菌体
内に蓄積するためには、通気撹拌を行う深部培養でなけ
ればならず、また、培養中は溶存酸素濃度がその臨界酸
素分圧以上を保つように、酸素充足条件となるような高
撹拌、高通気を行う。pHは７付近に制御し、温度を20〜
40℃に保つことにより培養の初期に菌体内でのDNAの生
成蓄積が進行する。 培養は回分培養でもよいが、連続培養がより適してお
り、容易に連続化することが可能である。当然生産性の
点でも連続培養の方がすぐれている。 （Ｄ） DNAの分離採取 DNAの分離採取は、まず遠心分離等の手段により培地
から菌対を単離し、この菌体を少量の水に懸濁する。次
にこの懸濁水のpHを約12に調整したのち、加熱して溶菌
させDNAの高濃度溶液を得る。この溶菌操作は通常は約9
0℃で１時間程度を要するが、これに限定されない。ま
た、このさいリゾチームや界面活性剤等を使用すること
も可能である。次いで、DNA高濃度溶液を濾過して固形
不純物を除いたのち、溶液に対して２倍容のエタノール
を加えることによりDNAを不溶化し、遠心分離等の手段
により粗DNAを単離する。このようにして得られた粗DNA
は常法により精製するか、そのままデオキシリボヌクレ
オキド類の原料として使用することもできる。 ［実 施 例］ 以下実施例で本発明を具体的に説明する。 実施例 １ シュードモナス・エルギノーサKYU−１を肉エキス1.0
％、ペプトン1.0％、食塩0.5％、寒天1.5％、pH7.0の組
成を有する斜面培地において、30℃で24時間培養後、酵
母エキス1.0％、ペプトン1.0、食塩0.5％、ブドウ糖0.5
％、pH7.0の組成を有する培地5mlを入れた試験管に植菌
して、30℃で15時間振とう培養し、シードとした。この
シード培養液をブドウ糖5.0％、尿素0.4％、コーンステ
ィープリカー粉末1.5％、H3PO40.3％、KCl0.05％、MgSO
4・7H2O0.04％、pH7.0の組成を有する培地50mlを入れた
坂口フラスコへ2.5ml植菌し、30℃にてpitch50mm、140s
trokes/minの往復振とう培養を行ったところ、48時間後
に乾燥菌体重量が16mg/mlに達し、この時点で、菌体内
に1.14mg/mlのDNAが生産されていた。この培養液50mlを
10,000rpmで５分間遠心分離して菌体を分離し、これを
0.3N NaOH水溶液5mlに懸濁し、90℃で１時間加熱して
溶菌した。この溶液をpH5.0に調整後、エタノール10ml
を加えてDNAを不溶化し、10,000rpmで５分間遠心分離し
て、粗DNA57mg（純度約70％）を単離した。収率は培地
に使用したブドウ糖に対し1.6％であった。 実施例 ２ シュードモナス・エルギノーサKYU−１を用い、実施
例１と同様にしてシード培養液を調製し、下記の組成を
有する培地300ml張込みのミニジャーファーメンター
へ、15ml植菌した。 Ａ培地 ブドウ糖 5.0 ％ 尿 素 0.4 ％ コーンスティープリカー粉末 1.5 ％ H3PO4 0.3 ％ KCl 0.05％ MgSO4・7H2O 0.04％ Ｂ培地 ブドウ糖 10.0 ％ 尿 素 0.8 ％ コーンスティープリカー粉末 3.0 ％ H3PO4 0.6 ％ KCl 0.1 ％ MgSO4・7H2O 0.04％ 培養温度は30℃、pHはアンモニアガス吹込みで7.0に
制御、撹拌は1,500rpm、通気は常圧化1/2VVMで培養し
た。その結果DO2は、常時連続発酵の定常状態の間、Ａ
培地、Ｂ培地共に臨界溶存酸素濃度以上に保たれ、酸素
供給が生育およびDNA生成を律速することはなかった。
最初に希釈率0.1hr-1でＡ培地を用いて連続培養を行っ
たところ、90時間後に定常状態に達したが、そのとき流
出液は、乾燥菌体重量15mg/ml、菌体内DNA1.05mg/mlで
あった。そこで希釈率を0.08hr-1、培地をＢ培地に変え
て、更に同様のpHおよび通気撹拌条件で培養を続けたと
ころ、培地を変えてから70時間後に定常状態に達し、流
出液の乾燥菌体重量28mg/ml、菌体内DNA1.96mg/mlとな
った。次に10時間分の連続培養抜出し液（300ml）を7,0
00rpmで10分間遠心分離して菌体を分離し、これを0.3N
NaOH水溶液30mlに懸濁し、90℃で１時間加熱して溶菌
した。この溶液をpH5.0に調製後、エタノール60mlを加
えてDNAを不溶化し、7,000rpmで10分間遠心分離して粗D
NA670mg（純度70％）を単離した。この連続培養のDNA生
産性を培養液量、単位時間当たりに換算すると0.156g/
・hrとなる。収率は培地にフィードしたブドウ糖に対
して1.6％であった。 ［発明の効果］ 本発明は、シュードモナス属に属し、DNA生産能を有
する微生物を培養することにより、菌体形成と菌体内DN
A生成蓄積を同時に進行せしめることにより従来の菌体
外へDNAを蓄積させる方法に於て定常期後期まで培養を
続ける必要があったのに対し、対数増殖期後期〜定常期
初期という短時間で培養を終了とすることが可能となっ
た。すなわち本発明の特長は菌体形成と菌体内DNA生成
が同時におこるgrowth associated型をとることによ
り、従来困難であった連続培養を可能にするものであ
り、工業的にきわめてすぐれた発酵法によるDNA製造法
を具現化したものである。
Aという）の製造法に関するものであり、更に詳しくは
シュードモナス（Pseudomonas）属に属し、DNA生産能を
有する微生物を培養し、菌体内に多量に生成蓄積せしめ
たDNAを、分離採取するDNAの製造法に関する。 ［従来の技術］ 本発明で得られるDNAは、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤な
どの医薬品の重要な合成原料として有用な物質である。 従来、このDNAを製造する方法としては、魚類白子を
原料として抽出精製する方法が一般的である。また、発
酵法によるDNAの製造法も知られており、例えば、アー
スロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス属、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ミクロコッ
カス（Micrococcus）属、コリネバクテリウム（Coryneb
acterium）属、カンディダ（Candida）属またはアスペ
ルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、該微生
物の資化しうる炭素源含有培地を用いて好気的に培養し
て、培地中にDNAを生成させる方法（特公昭55−35106号
公報）、シュードモナス属に属する細菌をｎ−パラフィ
ンを炭素源とする培地で培養し、菌体外にDNAを蓄積さ
せる方法〔アグリカルチァル・バイオロジカル・ケミス
トリー（Agricultural Biological Chemistry）第36
巻、第133頁（1972年）および第38巻、第293頁（1974
年）〕、シュードモナス属に属する微生物を酢酸および
／または酢酸塩を主たる炭素源とする培地にキレート剤
を添加し、培養方法として培養初期は好気的条件下で培
養し、対数期に静置培養条件下に移す方法を採用するこ
とにより、DNAを菌体外に蓄積させる方法（特開昭55−4
8399号公報）、アシネトバクター（Acinetobacter）属
に属する微生物を培養して、培養物からDNAを採取する
方法（特開昭61−115497号公報）が知られている。 ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、DNAの製造法として、魚類白子より抽
出精製する方法は、抽出操作のさいのDNAの損失、夾雑
物との分離・精製操作の煩雑さ、原料である魚類の白子
の入手が季節により制約される等の問題点を有する。ま
た、発酵法による製造法は、一般に得られるDNA溶液が
希薄であるため濃縮コストが大きくなるという問題点が
あり、且つ炭素源としてｎ−パラフィンを用いる方法で
は、ｎ−パラフィンが不溶性のため、高回転の機械的撹
拌又は、界面活性剤の添加により油滴を分散させて培養
を行う必要が生じ、基質供給速度が制限され、高い生産
性が確保できないなどの問題点を有している。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる問題点を解決し、より効率の良
い発酵法によるDNAの製造方法を完全にさせるため検討
を重ねた結果、 従来のようにDNAを菌体外、即ち培地中に蓄積させる
のではなく、シュードモナス属に属し、DNAを生産能を
有する微生物を適切な条件で培養することにより菌体形
成と同時に菌体内にDNAを蓄積できることを見出し、本
発明を完成した。 すなわち本発明はシュードモナス属に属し、デオキシ
リボ核酸を生産する能力を有する微生物を、炭素源に酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜から選ばれた１種以上の天
然炭素源を炭素重量として２〜５％、窒素源に酵母エキ
ス、ペプトン、コーンスティーブリカー、大豆かすから
選ばれた１種以上の天然有機窒素源を窒素重量として0.
1％以上、無機質としてマグネシウムを0.004％以上含む
培地を用い、酸素充足条件下に培養して、菌体内に多量
のデオキシリボ核酸を生成蓄積せしめたのち、集菌した
菌体よりデオキシリボ核酸を採取することを特徴とする
デオキシリボ核酸の製造法を提供するものである。 本発明に於て、特に重要なのは菌体内にDNAを蓄積せ
しめる点であり、これを行うための培地及び培養条件で
ある。 すなわち、本発明にあっては、シュードモナス属に属
する微生物を、炭素源に酵素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜
から選ばれた１種以上の天然炭素源を炭素重量として２
〜５％、窒素源に酵母エキス、ペプトン、コーンスティ
ーブリカー、大豆かすから選ばれた１種以上の天然有機
窒素源を窒素重量として0.1％以上、マグネシウムを0.0
04％以上含む培地を用い、酸素充足条件下に培養するこ
とにより、培養の初期（対数増殖期後期から定常初期ま
でをいう）において、菌体形成と同時に菌体内に多量の
DNAを生成蓄積せしめる点が特に重要である。 この菌体内のDNAは、培養液から集菌した菌体を熱ア
ルカリ等で処理することで、容易に高濃度溶液として得
られるもので回分培養のみならず連続培養も可能とする
ものである。 次に、本発明で用いる微生物について具体的に説明す
る。 （Ａ） 生産菌 本発明で使用される菌は、シュードモナス属に属し、
菌体内にDNAを高濃度に蓄積するものであればよく、そ
の種（species）は問わない。具体的にはシュードモナ
ス・エルギノーサ（P.aeruginosa）KYU−１（微工研菌
寄第9701号）、シュードモナス・エルギノーサIFO334
5、シュードモナス・フルオレッセンス（P.fluorescen
s）IFO3081、シュードモナス・メラノゲナム（P.melano
genum）IFO12020、シュードモナス・オーレオファシエ
ンス（P.aureofaciens）IFO3521、シュードモナス・ポ
リカラー（P.polycolor）等が示される。特に、シュー
ドモナス・エルギノーサKYU−１は、菌体内に多量のDNA
を生成蓄積する。 シュードモナス・エルギノーサKYU−１は本発明者ら
によって、福岡市大字箱崎地内の空気中より分離された
もので、以下に示す菌学的性質を有する。 （ａ） 形態 細胞の形および大きさ:0.5〜0.6×1.5〜1.6μの短
桿菌 細胞の多形性：なし 運動性、鞭毛の着生状態：運動性あり、単極毛 胞子：なし グラム染色性：陰性 抗酸性：なし （ｂ） 生育状態 肉汁寒天平板培養：生育良好、白色光沢あり、水溶
性蛍光色素（ピオシアニン）産生 肉汁寒天斜面培養：生育良好、白色光沢あり、 肉汁液体培養：表面発育なし、濁度A660＝３〜５ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチン液化 リトマス・ミルク：アルカリ反応 （ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の完全：培養３時間後に試薬を添加すると桃
赤色を呈し、６時間後には赤褐色を呈するとともに赤褐
色の沈澱（亜硝酸塩）を生成。さらに20時間後にはガス
を発生し、呈色反応は認められない。 脱窒反応：あり インドールの生成：あり 硫化水素の生成：あり クエン酸の利用：クエン酸資化 無機窒素源の利用：亜硝酸資化、アンモニウム塩資
化 色素の生成：水溶性蛍光色素（ピオシアニン）産生 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲:5℃における生育なし、42℃における生
育あり、至適温度37℃ 11 酸素に対する態度：好気性 12 Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による）：糖を酸化
的に分解する 13 糖類から酸およびガスの生成の有無：グルコースか
ら酸化的にグルコン酸、２−ケトグルコン酸を生成 14 Tween 80の加水分解：陽性 以上の菌学的性状から本菌株はシュードモナス・エル
ギノーサと同定された。なお、本菌株はシュードモナス
・エルギノーサKYU−１と命名し、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した（微工研寄第9701号）。 （Ｂ） 培地 本発明で用いられる培地は、該微生物が良好に生育す
るとともに、菌体内にDNAを生成蓄積するために必要な
炭素源、窒素源、無機質およびその他の栄養素等を含む
ものであり、炭素源、窒素源ともに資化されたものであ
れば特に限定されない。具体的には、炭素源としては酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜から選ばれた１種以上の天
然炭素源が特に良好であり、炭素重量として２〜５％含
むことが望ましい。窒素源としては酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティーブリカー、大豆かすから選ばれた１
種以上の天然有機窒素源が特に良好であり、窒素重量と
して0.1％以上含むことが望ましい。また無機質の主な
ものを元素としてあげるとリン、マグネシウム、マンガ
ン、鉄、カリウム、亜鉛、コバルト、ニッケル等が例示
されるが、特にマグネシウムは必須であり、0.004％以
上含むことが望ましい。 （Ｃ） 培養条件 DNAを効率よく生成するとともに、生成したDNAを菌体
内に蓄積するためには、通気撹拌を行う深部培養でなけ
ればならず、また、培養中は溶存酸素濃度がその臨界酸
素分圧以上を保つように、酸素充足条件となるような高
撹拌、高通気を行う。pHは７付近に制御し、温度を20〜
40℃に保つことにより培養の初期に菌体内でのDNAの生
成蓄積が進行する。 培養は回分培養でもよいが、連続培養がより適してお
り、容易に連続化することが可能である。当然生産性の
点でも連続培養の方がすぐれている。 （Ｄ） DNAの分離採取 DNAの分離採取は、まず遠心分離等の手段により培地
から菌対を単離し、この菌体を少量の水に懸濁する。次
にこの懸濁水のpHを約12に調整したのち、加熱して溶菌
させDNAの高濃度溶液を得る。この溶菌操作は通常は約9
0℃で１時間程度を要するが、これに限定されない。ま
た、このさいリゾチームや界面活性剤等を使用すること
も可能である。次いで、DNA高濃度溶液を濾過して固形
不純物を除いたのち、溶液に対して２倍容のエタノール
を加えることによりDNAを不溶化し、遠心分離等の手段
により粗DNAを単離する。このようにして得られた粗DNA
は常法により精製するか、そのままデオキシリボヌクレ
オキド類の原料として使用することもできる。 ［実 施 例］ 以下実施例で本発明を具体的に説明する。 実施例 １ シュードモナス・エルギノーサKYU−１を肉エキス1.0
％、ペプトン1.0％、食塩0.5％、寒天1.5％、pH7.0の組
成を有する斜面培地において、30℃で24時間培養後、酵
母エキス1.0％、ペプトン1.0、食塩0.5％、ブドウ糖0.5
％、pH7.0の組成を有する培地5mlを入れた試験管に植菌
して、30℃で15時間振とう培養し、シードとした。この
シード培養液をブドウ糖5.0％、尿素0.4％、コーンステ
ィープリカー粉末1.5％、H3PO40.3％、KCl0.05％、MgSO
4・7H2O0.04％、pH7.0の組成を有する培地50mlを入れた
坂口フラスコへ2.5ml植菌し、30℃にてpitch50mm、140s
trokes/minの往復振とう培養を行ったところ、48時間後
に乾燥菌体重量が16mg/mlに達し、この時点で、菌体内
に1.14mg/mlのDNAが生産されていた。この培養液50mlを
10,000rpmで５分間遠心分離して菌体を分離し、これを
0.3N NaOH水溶液5mlに懸濁し、90℃で１時間加熱して
溶菌した。この溶液をpH5.0に調整後、エタノール10ml
を加えてDNAを不溶化し、10,000rpmで５分間遠心分離し
て、粗DNA57mg（純度約70％）を単離した。収率は培地
に使用したブドウ糖に対し1.6％であった。 実施例 ２ シュードモナス・エルギノーサKYU−１を用い、実施
例１と同様にしてシード培養液を調製し、下記の組成を
有する培地300ml張込みのミニジャーファーメンター
へ、15ml植菌した。 Ａ培地 ブドウ糖 5.0 ％ 尿 素 0.4 ％ コーンスティープリカー粉末 1.5 ％ H3PO4 0.3 ％ KCl 0.05％ MgSO4・7H2O 0.04％ Ｂ培地 ブドウ糖 10.0 ％ 尿 素 0.8 ％ コーンスティープリカー粉末 3.0 ％ H3PO4 0.6 ％ KCl 0.1 ％ MgSO4・7H2O 0.04％ 培養温度は30℃、pHはアンモニアガス吹込みで7.0に
制御、撹拌は1,500rpm、通気は常圧化1/2VVMで培養し
た。その結果DO2は、常時連続発酵の定常状態の間、Ａ
培地、Ｂ培地共に臨界溶存酸素濃度以上に保たれ、酸素
供給が生育およびDNA生成を律速することはなかった。
最初に希釈率0.1hr-1でＡ培地を用いて連続培養を行っ
たところ、90時間後に定常状態に達したが、そのとき流
出液は、乾燥菌体重量15mg/ml、菌体内DNA1.05mg/mlで
あった。そこで希釈率を0.08hr-1、培地をＢ培地に変え
て、更に同様のpHおよび通気撹拌条件で培養を続けたと
ころ、培地を変えてから70時間後に定常状態に達し、流
出液の乾燥菌体重量28mg/ml、菌体内DNA1.96mg/mlとな
った。次に10時間分の連続培養抜出し液（300ml）を7,0
00rpmで10分間遠心分離して菌体を分離し、これを0.3N
NaOH水溶液30mlに懸濁し、90℃で１時間加熱して溶菌
した。この溶液をpH5.0に調製後、エタノール60mlを加
えてDNAを不溶化し、7,000rpmで10分間遠心分離して粗D
NA670mg（純度70％）を単離した。この連続培養のDNA生
産性を培養液量、単位時間当たりに換算すると0.156g/
・hrとなる。収率は培地にフィードしたブドウ糖に対
して1.6％であった。 ［発明の効果］ 本発明は、シュードモナス属に属し、DNA生産能を有
する微生物を培養することにより、菌体形成と菌体内DN
A生成蓄積を同時に進行せしめることにより従来の菌体
外へDNAを蓄積させる方法に於て定常期後期まで培養を
続ける必要があったのに対し、対数増殖期後期〜定常期
初期という短時間で培養を終了とすることが可能となっ
た。すなわち本発明の特長は菌体形成と菌体内DNA生成
が同時におこるgrowth associated型をとることによ
り、従来困難であった連続培養を可能にするものであ
り、工業的にきわめてすぐれた発酵法によるDNA製造法
を具現化したものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12P 19/34
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．シュードモナス属に属し、デオキシリボ核酸を生産
する能力を有する微生物を、炭素源に酵素糖化液、酸糖
化液、廃糖蜜から選ばれた１種以上の天然炭素源を炭素
重量として２〜５％、窒素源に酵母エキス、ペプトン、
コーンスティーブリカー、大豆かすから選ばれた１種以
上の天然有機窒素源を窒素重量として0.1％以上、無機
質としてマグネシウムを0.004％以上含む培地を用い、
酸素充足条件下に培養して、菌体内に多量のデオキシリ
ボ核酸を生成蓄積せしめたのち、集菌した菌体よりデオ
キシリボ核酸を採取することを特徴とするデオキシリボ
核酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62289492A JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62289492A JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01132395A JPH01132395A (ja) | 1989-05-24 |
| JP2800005B2 true JP2800005B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=17743976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62289492A Expired - Lifetime JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2800005B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPQ366799A0 (en) | 1999-10-26 | 1999-11-18 | University Of Melbourne, The | Emphasis of short-duration transient speech features |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933226A (ja) * | 1982-08-19 | 1984-02-23 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗腫瘍活性物質ｐｄ−０１とその製法およびその製剤 |
-
1987
- 1987-11-18 JP JP62289492A patent/JP2800005B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933226A (ja) * | 1982-08-19 | 1984-02-23 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗腫瘍活性物質ｐｄ−０１とその製法およびその製剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01132395A (ja) | 1989-05-24 |
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