JPS61115497A - 核酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸の製造法に関し、更に詳しくはアシネトバ
クタ−属に屈するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）及びリ
ボ核酸（ＲＮＡ　）生産性微生物を培養し、これを採取
する核酸の製造法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

従床、核酸は微生物、動物、植物の細胞を破壊し、エタ
ノールで沈澱させ、プロテアーゼ若しくは溶剤によって
蛋白質を除去する方法により製造されてきた。

しかしながら、轟該製造法は核酸の損失、細胞破壊残渣
に起因する夾雑物が多いこと、また袖山操作が困難であ
ること等の問題点を有していた。

斯かる従来の核酸製造法における問題点を回避する方法
として発ひ法による核酸の製造法が提案されている（特
公昭５５−３５１０６号、特公昭５２−２８８７７号）
。この発酵法による核酸の製造法は各単位操作も容易で
あり、核酸の損失も少なく、夾雑物も容易に除去できる
等の利点を有しており、発酵法に利用しうる新規微生物
の探索が望まれてい九。

〔問題点を解決する念めの手段〕

本発明者らは、核酸を生産する微生物を鋭意探索したと
ころ、アシネトバクタ−かに属する新規微生物が斯様な
能力を有することを児い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、アシネトバクタ−属に属する核酸
生産性微生物を培養し、培養物から核酸を採取する核酸
の製造法を提供するものである。

本発明で使用する微生物としては、アシネト・々フタ−
＆に屈し核酸生産能を有するもＪ゛であればいずれをも
使用でき、例えばアジネトバクター−ニスｅ　−（Ａｅ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、　）ＫＳＭ−１５（微
工研菌寄第７６２２号）が挙げられる。

このアシネトバクタ−・ニスｆ−ＫＳＭ−１５は、本発
明者らが中国産大同炭中より分離したものであって、以
下に示す菌学的性質を有する。

（＆）形態 ■　細胞の形及び大きさ　　直径１〜２μの球菌状■　
細胞の多形成　　　　　特に認められない。

■　運動性　　　　　　　− ■胞子　　　− ■　ダラム染色性　　　　　　− ■　抗酸性　　　　　　　　− （ｂ）生育状態 ■　肉汁寒天平板培養 ３０℃２４時間培養で表面に光沢のあるクリーム色の直
径０．５〜ｌ　ｍｍの円形コロニーを作る。

（２）肉汁寒天斜面培養 ３０°Ｃ２４時間で培地表面に生育が認められる。

■　肉汁液体培養 生育する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 表面付近に生育するがゼラチンは液化しない、 ■　リドマス・ミルク 変化しない。

（Ｃ）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元　　　　　　　− ■　脱窒反応　　　　　　　　　− ■　ＭＲテスト　　　　　　　　＋ ■　ｖｐテスト　　　　　　　　− ■　インドールの生成　　　　　− ■　硫化水素の生成　　　　　　− ■　デン粉の加水分解　　　　　− ■　クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地　　　　　　　十 Ｃｈｒ　１ｓｔｓｎｓｅｎの培地　　　　十■　無機窒
素源の利用 硝酸塩　　　　　　　　　　　十 アンモニウム塩　　　　十 Ｃ葡　色素の生成　　　　　− ０ウレアーゼ　　　　　　＋ （１２オキシダーゼ　　　　　− （ｉ３）　　カタラーゼ　　　　　　　＋■　生育の範
囲 ｐＨ４〜９．５（至適５〜８．５） 温度２０〜４０℃（至適２６〜３７℃）ｉ５＋　　酸素
に対する態度　好気性 ＠ｏ−ｙテスト　酸化 Ｑｆ＋　　糖類の酸化及びガスの生成 酸化　ガスの生成 （１）Ｌ−アラビノース　　　　　　　十　　　　　−
（２）Ｄ−キシロース　　　　　　　　　十　　　　　
−（３）Ｄ−グルコース　　　　　　　　＋　　　　　
−（４）Ｄ−マンノース　　　　　　　十　　　　　−
（５）Ｄ−７ラクトース　　　　　−−（６）Ｄ−ガラ
クトース　　　　　十　　　　−（７）　　麦芽糖　　
　　　　　　−−（８）　　ショ糖　　　　　　　−− （９）乳糖　　　　十　　− αＧ　　トレハロース　　　　　　　−−ＱＩＪ　　　
Ｄ−ソルビット　　　　　　−−α３Ｄ−マンニット　
　　　　　−− ａ３　　イノジット　　　　　　　　−−α滲　グリセ
リン　　　　　　　−− αタ　デン粉　　　　　　　　　−− （ｄ）その他　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１■　溶血性　　　　＋（馬鹿液カンテン）■　
マロン酸の利用　十 ■　セラーの試験培地　凝水付近が黄色、斜面は青色と
なる。

■　菌体外デオキシリボ核酸の生産　　十以上の菌学的
性状から、本ＫＳＭ　−１５株はアシネトバクタ−属に
属すると判断される。

また、かかる菌学的性状を有する菌についてマニュアル
・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー第２版（Ｍａ
　ｎｕ　ａ　ｌ　ｏｆ　ＣＬＩＮＩＣＡＬＭｒＣＲＯＢ
ＩＯＬＯＧＹ　　２ｎｄ　Ｅｄｉ　ｔｉｏｎ　）及びパ
ーシーズｊ　マニ！　フル第８版（Ｂｅ　ｒｇｙ’　ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｓｔｈ　Ｅｄｌｔｌｏｎ　）
に従って検索すると、近似した微生物としてアシネトバ
クタ−・カルコアセチカス （Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｅｏａｃｅＮｅ
ｕｓ　）が認められる。

しかし、アシネトバクタ−・カルコアセチカスとして発
酵研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ　０ｓａｋａ＋　ＩＦＯ）で保存されている
ＩＦＯ第１２５５２号、ＩＦＯ第１３００６号の２菌株
には、核酸の生産能がほとんど認められなカ一つたこと
から、アシネトバクタ−・エスピーＫＳＭ−１５（微工
研菌寄第７６２２号）はこれらの菌とは明らかに相違す
る。

そこで、本発明者らはＫＳＭ−１５株をアシネトバクタ
−属に属する新規微生物と判断し、アシネトバクタ−・
エスピー　ＫＳＭ−１５と命名し、前記した如く工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。

このアシネトバクタ−・エスピー　ＫＳＭ−１５は中国
産大同炭から、例えば実施例に記載した如くの方法によ
り分離される。

本発明に係る核酸生産性微生物の培養は、該微生物が良
好に生育し、核酸を順調に生産するために必要な炭素源
、窒素源、無機物、必要な栄養素等を含有する合成培地
又は天然培地中で行なわれる。

すなわち、炭素源としては、グルコース、キシロース、
アラビノース等の炭水化物；ｎ−ドデカン、ｎ−ヘキサ
ン、ｎ−ヘキサデカン等の炭化水素；Ｃ１ｏ〜２゜の脂
肪酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸：油脂、石炭等が
使用できる。

♀炭源あるいは有機栄養源としては、例えばアンモニア
、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の無機窒素源化合物類、グルタミン酸等のアミ
ノ酸類、酵母エキス、肉エキス、コーンステイープリカ
ー等の有機窒素源物質が挙げられる。また無機塩として
はリン酸１カリウム、リン酸２力リウム等各種リン酸塩
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、炭
酸カルシウム等が使用できる。更Ｋ、微量の重金屈叩が
使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも添加を必
要としない。栄養要求を必要とする変異株を用いる場合
には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなけれ
ばならない。

培養は振盪培養あるいけ深部通気撹拌培養等の好気的条
件下において、培地ｐＨを３〜９の範囲好ましくは中性
付近に調整し、温度２０〜４０℃で実施するのが望まし
いが、この条件以外であっても菌が生育する条件であれ
ば特に制限されない。斯くして培養を行なうと、通常、
培養を開始して０．５〜６日間で培養液中にデオキシリ
ボ核酸及びリボ核酸の蓄積が認められる。

生産されたデオキシリボ核酸及びリボ核酸は、培養終了
後、菌体等の沈澱物を除去した培養液を、公知の核酸精
製法に従って溶媒沈澱、除蛋白操作、塩析法等で処理す
ることにより採取することができる。

〔作用〕

本発明で使用するアシネトバクタ−属に属する微生物は
、後記実施例に示す如く核酸生産能を有する、 〔発明の効果〕 核酸の製造法として近年開発された発酵法は、微生物等
の細胞から抽出分離する従来の製造法に比べ分離単位操
作も容易で核酸損失も少なく、かつ夾雑物も容易に除去
できるという特長を有する。本発明は、アシネトバクタ
−和に属する微生物が核酸生産能を有するという新知見
に基づくもので、上記発酵法の特長を生かした核酸の効
率よい製造を可能ならしめるものである。

また、本発明で得られる核酸は、酸化チタン、ベンゾシ
ンイエロー等の水不溶性物質の分散安定化に優れた〃Ｊ
果を有する。

〔実施ｆ１１〕 次に実施例及び参考例を挙けて本発明を説明する。

参考例１ （ｉ）　　中国産大同炭微粉末７０％懸濁液の小ス、Ｑ
−テル１杯分（約０．５ｆ）を１ｏｒＩｔｌの滅菌水Ｋ
Ｍ、濁し、充分攪拌した後放置する。かくして得られる
懸濁液の上前の１００倍希釈液０、１　ｍｌ　’に下記
組成の分離用寒天培地（予め滅菌し、無菌シャーレに分
注し固化させたもの）に塗布し、３０℃で２日間培養し
た。

（分離用寒天培地の組成） ペプトン　　　　　２０９ 食塩　　５ｆ 寒天　　　１５２ 精肥水　　　　　　１０００ｍ／ （ｐＨ６，８） （ｉ）　　上記培養により生育してきたコロニーヲ−白
金耳採り、滅菌水で１００倍希釈した。次いでこの希釈
液０．１　ｍｌを再び分離用寒天培地と同一！ｌ１ＩＪ
′Ｒの培地に移し、３０℃で３日間培養し、生じた複数
のコロニーが相互間に相異しないことを肉眼的及び顕微
的に確認した。

上記コロニーのうち１０個のコロニーを各々分離用寒天
培地と同組成の斜面寒天培地に接種し、３０℃で３日間
培養した。１０本の斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微
鏡的に同一菌株であることを確認し、さらにこれらｌＯ
菌株の各培地上の性状及び生理学的性質が同一であるこ
とを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質は前述した通りである。

上記試験の結果、各１０本の培養菌はすべて自然界より
純粋に分離された単一菌株であることが判る。

（涌）　　次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の
菌株より一白金耳を滅菌した１０％グリセリン水溶液（
２ｍｅ）の入った凍結保存用バイアルに懸濁し、−８０
℃にで凍結保存する。

かくして３ケ月凍結保存後、迅速に解凍し得　　１られ
る懸濁液の一白金耳を普通寒天培地に蘇生後前記と同条
件下に各培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果
、凍結前とは変化が認められなかった。

実施例１ アシネトバクタ−・エスピーＫｓＭ−１５ｅペゾトン２
％、食塩０．５％を含有する液体培地（滅菌前ｐＨ７，
０）１００ｍを入れた坂ロフラスコ中で２４時間振盪培
養した。次いでこの培養液をペプトン２％、グルコース
０．２５％、リン酸２カリウム０．２５％、食塩０．５
％を含有する液体培地（ｆｔ＜菌前、ＩＩ　７．０　）
１００　Ｗｌｌｅ入れた坂ロフラスコに１容量％の割合
で加え、３０℃で２日間振盪培養した。

１）　デオキシリボ核酸の分離°精製 上記培養液を遠心分離して得られた上澄液１００　ｍｅ
に、０．１モル食塩及び１％ドデシル硫酸ナトリウムを
含有する０、　１　Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ９，０）ｔ
−飽和させたフェノールを等量添加し、振う後遠心して
上層部を採取した、次いでこれに等量の９５％エタノー
ルヲ添加し、沈澱物として粗デオキシリボ核酸５０Ｆ７
を得た。

得られた粗デオキシリボ核酸は、プロテアーゼ及びリボ
ヌクレアーゼ処理を行なったのち、再びフェノール抽出
、エタノール沈澱を行なって精製デオキシリど核酸２０
ηを得た。

斯くして得られる物質がデオキシリボ核酸であることは
、■リンｔ−７〜ｌＯ％含有する、■２６０＋ｚｍに吸
光極大を有する、■ジフェニルアミンに反応する、■エ
タノールで繊維状の沈澱が表われる、０８０〜９０℃で
濃色化（Ｔｍ＝８６〜８７℃）を示す、■デオキシリボ
核酸酵素（デオキシリボヌクレアーゼ）で分解されるこ
とにより確認し友。また、グル口過法により測定した分
子量は４Ｘ１０＠〜５Ｘ１０’であった。

６ｉ）　　リボ核酸の分離・精製 （１１において、粗デオキシＩＪ　ｇ核酸の沈澱物音回
収した上澄液に、更に９５％エタノールをその２倍量加
え、沈澱物として粗すボ核配２０ηを得た。

粗リボ核酸は、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアー
ゼ処理を行ない、（１）におけると同様にしてフェノー
ル抽出、エタノール沈澱操作を行ないＭ製すボ核酸１０
’！１９を得た。

斯くして得られた物質がリボ核酸であることは、■リン
を７〜ｌＯ％含有する、■２６０ｎｍＫ吸光極大を有す
る、■オルシノールに反応する、■リボ核酸分解酵素（
リボヌクレアーゼ）で分解されることにより確認した。

また、グル口過法により測定した分子量は１．５Ｘ１０
’以下であった。

実流９１１２ アシネトバクタ−・エスピー　ＫＳＭ　−１５株を実施
例１と同様に前培養したのち、培養液を石炭（大同炭、
中国産）２５％、酵母エキス０．１％を含有する培地１
００　ｍｌ　（ｐＨ６，５）に１容量％の割合で加え、
実施例１と同様に３日間培養した。この培養上澄液１１
ｙ！／には、デオキシリボ核酸１５０ｐ？、リボ核酸５
０μｔが含まれていた。

実施例３ アシネトバクタ−・エスピー　ＫＳＭ　−１５株を実施
例１と同様に前培養したのち、培養ｉｔヘキサデカン４
％、ペプトン２％、リンｍ　Ｏ，２５％、塩化ナトリウ
ム０．５％を含有する培地（ｐＨ７，０）に１容量５％
の割合で加え、実施例１と同様に３日間培養した。この
培養上澄液１ゼにはデオキシリボ核酸１００　ｐｆ、リ
ボ核＃　５０　ｐｆが含まれていた。

ら上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アシネトバクター属に属する核酸生産性微生物を培
   養し、培養物から核酸を採取することを特徴とする核酸
   の製造法。 ２、核酸生産性微生物がアシネトバクター・エスピー（
   Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）ＫＳＭ−１５（
   微工研菌寄第７６２２号）である特許請求の範囲第１項
   記載の核酸の製造法。