JPH04248989A - ８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒド ロキシクマリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物が有する酵素反応
を利用した８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または
８−ヒドロキシクマリンの製造方法に関する。

【０００２】８−ヒドロキシカルボスチリル及び／また
は８−ヒドロキシクマリンはβ−アドレナリン作動神経
遮断作用を有する不整脈および狭心症に有効な治療薬の
合成中間体等として広く応用展開が期待される化合物で
ある。

【０００３】

【従来の技術】従来、８−ヒドロキシカルボスチリルは
（ａ）８−ヒドロキシキリノンをカ性カリを用いてアル
カリ融解して製造する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，
３６，３４９０（１９７１）　（ｂ）８−ヒドロキシキ
ノリンを過酸でＮ−オキシド化した後、無水酢酸で転位
させてアセチルオキシカルボスチリルとし、次いで加水
分解して得る方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３３，１
０８９（１９６８）（ｃ）アニシジンにβ−クロルプロ
ピオン酸ハライドを反応させて得られるＮ−アシル体を
フリーデルクラフト環化して、ヒドロキシ−３，４−ジ
ヒドロカルボスチリルを得、次いで得られる化合物をア
シル化した後、ハロゲン系酸化剤で酸化し、さらに加水
分解してヒドロキシカルボスチリルを得る方法（特開昭
５４−３０７７）（ｄ）アニシジンに塩化シンナモイル
を反応させてＮ−シンナモイルアニシジンを得、この化
合物をルイス酸の存在下、フリーデルクラフト反応によ
り閉環し、ヒドロキシカルボスチリルを得る方法（特開
昭５４−１９９８５）等が知られている。

【０００４】しかしながら（ａ），（ｂ）法では、８−
ヒドロキシキノリンの入手困難性、過酸を用いる危険性
、原料をアルカリ融解させる危険性等、種々の悪条件が
伴う上に工業的規模で反応を行った場合多大な危険を伴
い、しかも分解反応が起こり目的物を低純度、低濃度で
しか得ることができない。（ｃ），（ｄ）法では反応工
程が長く、工業的には多大な費用を必要とし、経済的に
極めて不利である。

【０００５】他方、８−ヒドロキシクマリンの製造方法
としては、従来、ｏ−バニリンとシアノ酢酸をカップリ
ングし、さらに閉環して製造する方法（Ｇａｚｚ．Ｃｈ
ｉｍ．ｉｔａｌ．，８４，８４３　（１９５４）が知ら
れているが、この方法では原料が高価な上、反応工程が
長く、工業化には多大な費用を必要とし、経済的に極め
て不利である。

【０００６】また、キノリンに対する微生物の作用につ
いては、環境汚染防止の観点からキノリンの分解につい
て多少報告されている〔Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐ
ｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ，３７０，１１８３（１９８９）〕
。しかしながら、キノリン及び／またはカルボスチリル
を炭素源として８−ヒドロキシカルボスチリル及び／ま
たは８−ヒドロキシクマリンを生産することを目的とし
た報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温
、常圧下で高い選択特異性を有する微生物酵素反応を利
用して、安価な工業原料であるキノリン及び／またはカ
ルボスチリルから８−ヒドロキシカルボスチリル及び／
または８−ヒドロキシクマリンを製造する方法を提供す
ることである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはキノリンを
微生物酸化する能力を有する微生物を自然界より探索し
たところ、福岡県北九州市のタール化学工場土壌より分
離されたシュードモナス属に属すると認められる菌株が
そのような能力を有しており、キノリン及び／またはカ
ルボスチリルを炭素源とする培地で培養すると培養物中
に８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒド
ロキシクマリンが生産されることを見いだし、本発明を
完成した。

【０００９】すなわち、本発明はシュードモナス属に属
し、キノリン及び／またはカルボスチリルを８−ヒドロ
キシカルボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリ
ンに変換する能力を有する微生物をキノリン及び／また
はカルボスチリルを主炭素源とする培地に培養するか、
該微生物の培養物またはその処理物とキノリン及び／ま
たはカルボスチリルとを水性媒体中で接触させて、菌体
外に８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒ
ドロキシクマリンを生成蓄積させ、ついで生成蓄積した
８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒドロ
キシクマリンを採取することを特徴とする８−ヒドロキ
シカルボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリン
の製造方法に関する。

【００１０】本発明に使用される微生物としては、シュ
ードモナス属に属し、８−ヒドロキシカルボスチリル及
び／または８−ヒドロキシクマリンを生産する能力を有
する菌であればいずれの微生物でもよいが、代表的な菌
として本発明者らが土壌より分離したシュードモナス・
プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　Ｎ
ＳＣＣ２０９株を例示できる。

【００１１】ＮＳＣＣ２０９株は次の菌学的性質を有し
ている。 Ｉ．形態的性質 （１）　菌形　　　　　　　　：桿菌 （２）　大きさ　　　　　　：０．５　〜０．８　μｍ
×１．０　〜２．０　μｍ（３）　運動性　　　　　　
：有り （４）　ベン毛　　　　　　：極ベン毛（５）　多形性
　　　　　　：なし （６）　胞子　　　　　　　　：なし （７）　グラム染色　　：陰性

【００１２】ＩＩ．各種培地における生育状態（１）　
肉汁寒天平板培養　　　　：生育良好、円形、淡黄褐色
（２）　肉汁寒天斜面培養　　　　：生育良好（３）　
肉汁液体培養　　　　　　　　：生育良好、白濁、被膜
形成（４）　肉汁ゼラチン穿刺培養：生育良好、表層部
で生育、ゼラチンを液化しない

【００１３】ＩＩＩ．生理学的性質 （１）　硝酸塩の還元　　　　　　　　：陽性（２）　
脱窒反応　　　　　　　　　　　　：陰性（３）　イン
ドールの生成　　　　：陰性（４）　色素の生成　　　
　　　　　　　：ＫＩＮＧＢ培地で黄緑色蛍光色素 （５）　カタラーゼ　　　　　　　　　　：陽性（６）
　オキシダーゼ　　　　　　　　：陽性（７）　ＤＮａ
ｓｅ　　　　　　　　　　：陰性（８）　アシルアミダ
ーゼ　　　　：陽性（９）　リパーゼ　　　　　　　　
　　　　：陰性（１０）　ウレアーゼ　　　　　　　　
　　：陰性（１１）　アルギニンジヒドロラーゼ　　　
　　　：陰性（１２）　リジンデカルボキシラーゼ　　
　　　　：陰性（１３）　オルニチンデカルボキシラー
ゼ　　：陰性（１４）　β−ガラクトシダーゼ：陰性（
１５）　Ｏ−Ｆテスト　　　　　　　　：酸化的（１６
）　４１℃での増殖　　　　　　：陰性（１７）　エス
クリン加水分解　　：陰性（１８）　クエン酸培地での
生育：生育する（１９）　生育の範囲　　　　　　　　
　　：温度２５〜３５℃、ｐＨ６〜９で良好に生育する
。 （２０）　酸素に対する態度　　　　：好気性（２１）
　炭素源資化性　　　　Ｄ−グルコース　　　　＋Ｄ−
フラクトース　　＋ Ｄ−キシロース　　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　＋ マルトース　　　　− ラクトース　　　　− シュクロース　　− Ｄ−マンニトール　　− ＩＶ．分離源 福岡県北九州市内タール化学工場土壌

【００１４】以上の菌学的性質をもとにバージェイ・マ
ニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第
一巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｖｏｌｕｍｅ
　１）　により同定を行うと、本菌株はシュードモナス
・プチダの菌学的性質と一致したため、シュードモナス
・プチダＮＳＣＣ２０９株と命名した。本菌株は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１９４１号
として寄託されている。

【００１５】本発明におけ８−ヒドロキシカルボスチリ
ル及び／または８−ヒドロキシクマリンの生産は前駆体
、すなわちキノリン及び／またはカルボスチリル、含有
培地で上記微生物を培養することによって行ってもよく
（以下、第１法という）、また微生物を通常の培地で培
養した後、引き続きもしくは集菌し水性媒体中で前駆体
と接触させることによって行ってもよい（以下、第２法
という）。

【００１６】まず第１法について述べる。本微生物の培
養においては通常の細菌の培養法が用いられる。炭素源
としてはキノリン及び／またはカルボスチリル、窒素源
、無機塩類、ビタミンその他の栄養因子を適当に含有す
る培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用し得る
。

【００１７】炭素源はキリノン及び／またはカルボスチ
リルのみよりなるのが好適であるが、これに加え少量の
他の炭素源、例えばグルコース、フラクトース、スクロ
ースなどの炭水化物、グリセリン、ソルビトールなどの
糖アルコール、乳酸、酢酸、フマル酸などの有機酸、メ
タノール、エタノールなどのアルコール等、を適宜用い
ることができる。かかる他の炭素源の使用量は目的物で
ある８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または８−ヒ
ドロキシクマリンの生産性に影響を及ぼさない範囲の使
用量であることが好ましく、通常キノリン及び／または
カルボスチリル１００重量部に対し５〜５０重量部であ
ることが好ましい。

【００１８】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リ
ン酸アンモニウムなどの無機窒素源、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー、酵母エキス、カザミノ酸
、大豆粉などが単独または組み合わせて用いられる。 また窒素源を加えることなく、キノリン分子内の窒素を
窒素源として利用させることも可能である。

【００１９】無機塩としては、リン酸カリウム、リン酸
ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄
、塩化第二鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリブデン酸アンモ
ニウム、ほう酸、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム等を
適宜選択して加えることができる。

【００２０】さらに生育に必要な栄養因子としては、ビ
タミン類、アミノ酸、核酸およびその塩類が例示される
。またペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、
酵母エキス、カザミノ酸などの栄養因子を含有する天然
有機栄養物を適当に添加することができる。前述の各培
地成分を適当量混合して、８−ヒドロキシカルボスチリ
ル及び／または８−ヒドロキシクマリンの生産に適当な
培地を調製する。

【００２１】培地は、好気的培養法、例えば振盪培養法
または通気攪拌培養法によって行うのが好適であるが、
適宜液体静置培養法を組み合わせることもできる。培養
温度は２０〜４０℃、特に２５〜３５℃が適当で、培地
のｐＨは６〜９であればよい。培地中のキノリン及び／
またはカルボスチリルの濃度は、通常　０．０３　〜０
．３　％（ｗ／ｖ）でよいが好ましくは、０．０５〜　
０．１％（ｗ／ｖ）　が好適である。キノリン及び／ま
たはカルボスチリルを炭素源として培地　ｐＨ７．０付
近で３０℃で振盪培養すると、８−ヒドロキシカルボス
チリル及び／または８−ヒドロキシクマリンは、培養２
日目頃から培養液中に生成蓄積される。 培養は通常４〜５日で完了するが、８−ヒドロキシカル
ボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリンの生産
量が最大に達した時点で終了する。

【００２２】次に第２法について述べる。本発明使用微
生物の培養においては通常の細菌の培養法が用いられる
。炭素源としては第１法におけるキノリン及び／または
カルボスチリルを除く他の炭素源を用いるのが通常であ
るが、キノリン及び／またはカルボスチリルの併用また
は単独使用であってもよい。窒素源、無機塩、ビタミン
その他の栄養因子としては第１法におけると同様のもの
が用いられる。

【００２３】第２法における培養も第１法と同様な好気
的培養法によって行うことができ、温度、ｐＨ条件も第
１法と同様でよい。培養は対数増殖期の後半から定常期
まで行うのが好ましく、培養時間は通常２〜５日である
。

【００２４】かくして得られる微生物の培養物をそのま
ま、または該培養物を種々処理して得られる処理物を前
駆体としてキノリン及び／またはカルボスチリルと接触
させる。処理物としては、培養物の濃縮物、培養物を遠
心分離等に付して得られる菌体、固定化菌体あるいは菌
体からの抽出酵素標品などがあげられる。

【００２５】接触反応は水性媒体中であればいずれでも
行うことができるが、好適には使用菌の培養液またはそ
の濃縮液、または集菌後水または炭素源を除いた培地（
炭素源を欠く以外前段の培養におけると同様の培地でよ
い）に懸濁した懸濁液などにキノリン及び／またはカル
ボスチリルを存在せしめ、ｐＨを６〜９に調節しつつ、
２０〜４０℃、特に２５〜３５℃で２〜５日通常振盪も
しくは通気攪拌下に反応させることにより８−ヒドロキ
シカルボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリン
を主として菌体外に蓄積させることができる。反応液中
における上記前駆体の濃度は０．０３〜０．３％（ｗ／
ｖ）　特に０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）　が適当であ
る。

【００２６】また、上記第２法は本発明使用菌を常法に
より固定化して得た固定化菌体を用いるバイオリアクタ
ー方式によって前駆体を目的物へ連続的に変換すること
によって行うこともできる。

【００２７】第１法、第２法いずれの場合にも変換反応
終了液から８−ヒドロキシカルボスチリル及び／または
８−ヒドロキシクマリンの分離は、発酵生産された有機
化合物の培養液からの分離に通常用いられる方法で行え
ばよい。例えば、菌体除去後の培養液を適当な有機溶媒
で抽出し、減圧下で濃縮する。抽出の際、使用しうる有
機溶媒として酢酸エチル、ジエチルエーテル、アセトン
、ブタノール、テトラヒドロフランなどが挙げられる。 濃縮液をさらにＴＬＣ等に付して８−ヒドロキシカルボ
スチリル及び／または８−ヒドロキシクマリンを分離す
る。なお、目的物の同定はＦＤ−ＭＳ、１　Ｈ−ＮＭＲ
、ＩＲ、ＵＶ、融点等により行うことができる。

【００２８】なお、８−ヒドロキシカルボスチリル及び
／または８−ヒドロキシクマリンとは微生物代謝経路上
いわゆる中間体と最終生成物の関係にあり、従って請求
項１中の８−ヒドロキシカルボスチリルの製造方法の発
明と８−ヒドロキシクマリンの製造方法の発明とは特許
法第３７条第２号の関係を満足すると考えられる。また
、両化合物は共に不整脈及び狭心症に有効な治療薬の合
成中間体であり、共に安価なキノリン及び／またはカル
ボスチリルから容易に製造するものであるから、上記両
発明は、産業上の利用分野及び解決しようとする課題が
同一であり、従って特許法第３７条第１号の関係をも満
足すると考えられる。

【００２９】

【実施例】次に本発明方法を実施例により具体的に説明
する。 実施例１ 種培養は、大型試験管中のキノリン　０．０３ｗ／ｖ％
を加えた表１に示す培地１０ｍｌにシュードモナス・プ
チダＮＳＣＣ２０９株（微工研菌寄第１１９４１号）を
接種し、３０℃で２日間振盪培養することにより行った
。本培養は、キノリン０．０５ｗ／ｖ　％を加えた同組
成の培地を２Ｌ容ヒダ付き三角フラスコに３５０ｍｌ分
注し、種培養液１０ｍｌを接種し、３０℃で４４時間、
回転型振盪培養機で毎分８０回転振盪培養することによ
り行った。培養終了液を１２，０００ｒｐｍ　で１０分
間遠心分離し、菌体除去後、上澄液をＨＰＬＣで分析し
たところ、上澄液中に８−ヒドロキシカルボスチリル１
６０ｍｇ／ｌ及び８−ヒドロキシクマリン１０ｍｇ／ｌ
が含有されていた。

【００３０】実施例２ 本実施例では、カルボスチリルから８−ヒドロキシカル
ボスチリルの製造例を示す。大型試験管中のカルボスチ
リル　０．０３ｗ／ｖ％を加えた、表１に示す培地１０
ｍｌにシュードモナス・プチダＮＳＣＣ２０９株を接種
し、３０℃で２日間振盪培養し、種培養液とした。本培
養は、カルボスチリル０．１ｗ／ｖ％を加えた、同組成
の培地を２Ｌ容ヒダ付き三角フラスコに３５０ｍｌ分注
し、種培養液１０ｍｌを接種し、３０℃で７４時間、回
転型振盪培養機で毎分８０回転振盪培養することにより
行った。培養終了液を８，０００ｒｐｍで１５分間遠心
分離し、菌体除去後、上澄液を２倍量の酢酸エチルで３
回抽出した。抽出後５０００ｍｌをロータリーエバポレ
ーターで濃縮乾固し、８−ヒドロキシカルボスチリルを
含む粉末４００ｍｇを得た。粉末をメタノールに溶解し
、ＴＬＣ（トルエン／酢酸エチル／酢酸＝６０／４８／
８）で展開し、８−ヒドロキシカルボスチリルに相当す
るスポットを掻き取り、酢酸エチルで抽出し、抽出液を
濃縮乾固した。ＦＤ−ＭＳ、融点、ＩＲ、ＵＶ、１　Ｈ
−ＮＭＲにより８−ヒドロキシカルボスチリルであるこ
とを確認した。最終的に培養上澄液１リットルあたり２
００ｍｇの８−ヒドロキシカルボスチリルを得た。

【００３１】

【表　　１】

【００３２】実施例３ 本実施例では、カルボスチリルから８−ヒドロキシクマ
リンの製造例を示す。大型試験管中のカルボスチリル　
０．０５ｗ／ｖ％を加えた、表１に示す培地１０ｍｌに
シュードモナス・プチダＮＳＣＣ２０９株を接種し、３
０℃で２日間振盪培養し、種培養液とした。本培養は、
カルボスチリル０．１５ｗ／ｖ％を加えた、同組成の培
地を２Ｌ容ヒダ付き三角フラスコに３５０ｍｌ分注し、
種培養液１０ｍｌを接種し、３０℃で１６０時間、回転
型振盪培養機で毎分８０回転振盪培養することにより行
った。培養終了液を８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分
離し、菌体除去後、上澄液を２〜３倍量の酢酸エチルで
３回抽出した。抽出液６０００ｍｌをロータリーエバポ
レーターで濃縮乾固し、８−ヒドロキシクマリンを含む
粉末３７０ｍｇを得た。粉末をメタノールに溶解し、Ｔ
ＬＣ（トルエン／酢酸エチル／酢酸＝６０／４８／８）
で展開し、８−ヒドロキシクマリンに相当するスポット
を掻き取り、酢酸エチルで抽出し、抽出液を濃縮乾固し
た。ＦＤ−ＭＳ、融点、ＩＲ、ＵＶ、１　Ｈ−ＮＭＲに
より８−ヒドロキシクマリンであることを確認した。最
終的に培養上澄液１リットルあたり２０ｍｇの８−ヒド
ロキシクマリンを得た。

【００３３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、医薬品合成中間
体等として有用である８−ヒドロキシカルボスチリル及
び／または８−ヒドロキシクマリンを安価な工業原料で
あるキノリン及び／またはカルボスチリルから常温常圧
下で、副生成物がなく高純度で製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　シュードモナス属に属し、キノリン及
   び／またはカルボスチリルを８−ヒドロキシカルボスチ
   リル及び／または８−ヒドロキシクマリンに変換する能
   力を有する微生物をキノリン及び／またはカルボスチリ
   ルを主炭素源とする培地に培養するか、該微生物の培養
   物またはその処理物とキノリン及び／またはカルボスチ
   リルとを水性媒体中で接触させて、菌体外に８−ヒドロ
   キシカルボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリ
   ンを生成蓄積させ、ついで生成蓄積した８−ヒドロキシ
   カルボスチリル及び／または８−ヒドロキシクマリンを
   採取することを特徴とする８−ヒドロキシカルボスチリ
   ル及び／または８−ヒドロキシクマリンの製造方法。
2. 【請求項２】　　微生物がシュードモナス・プチダＮＳ
   ＣＣ２０９株（微工研菌寄第１１９４１号）である請求
   項１の製造方法。