JPH07213295A - 微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法 - Google Patents
微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法Info
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- JPH07213295A JPH07213295A JP6013397A JP1339794A JPH07213295A JP H07213295 A JPH07213295 A JP H07213295A JP 6013397 A JP6013397 A JP 6013397A JP 1339794 A JP1339794 A JP 1339794A JP H07213295 A JPH07213295 A JP H07213295A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】微生物の作用によって３，４−キシレノールを
位置選択性的に、酸化することによる医薬、香科、農薬
等の原科として有用な４−ヒドロキシ−２−メチル安息
香酸の製造方法。 【構成】微生物シュードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）種を用いて、３，４−キシレノールの４位のメ
チル基のみを選択的に酸化して４−ヒドロキシ−２−メ
チル安息香酸に変換する４−ヒドロキシ−２−メチル安
息香酸の製造方法。
位置選択性的に、酸化することによる医薬、香科、農薬
等の原科として有用な４−ヒドロキシ−２−メチル安息
香酸の製造方法。 【構成】微生物シュードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）種を用いて、３，４−キシレノールの４位のメ
チル基のみを選択的に酸化して４−ヒドロキシ−２−メ
チル安息香酸に変換する４−ヒドロキシ−２−メチル安
息香酸の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物を用いて、３，４
−キシレノールの４位のメチル基のみを選択的に酸化し
て、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を製造する方
法に関する。さらに詳しく述べると、シュードモナス・
プチダＫＳ−０１６０、シュードモナス・プチダＫＳ−
０１８０の培養液に３，４−キシレノールを存在させ
て、培養液中に変換生成され蓄積した４−ヒドロキシ−
２−メチル安息香酸を採集することからなる、４−ヒド
ロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法に関する。
−キシレノールの４位のメチル基のみを選択的に酸化し
て、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を製造する方
法に関する。さらに詳しく述べると、シュードモナス・
プチダＫＳ−０１６０、シュードモナス・プチダＫＳ−
０１８０の培養液に３，４−キシレノールを存在させ
て、培養液中に変換生成され蓄積した４−ヒドロキシ−
２−メチル安息香酸を採集することからなる、４−ヒド
ロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまでに、３，４−キシレノールから
の微生物変換反応による４−ヒドロキシ−２−メチル安
息香酸の生成は、シュードモナス（Pseudomonas ) 属の
細菌の３，４−シレノール代謝中間体として検出してい
る例（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（1957），66，227 ）が、
知られているが、この研究は３，４−キシレノールの分
解が４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を経て進行し
ていることを明らかにしているに過ぎない。また、反応
時に加える３，４−キシレノールの濃度が０．０４重量
％以下と低濃度でないとその微生物に与える毒性のため
に反応が進行しなかった。
の微生物変換反応による４−ヒドロキシ−２−メチル安
息香酸の生成は、シュードモナス（Pseudomonas ) 属の
細菌の３，４−シレノール代謝中間体として検出してい
る例（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（1957），66，227 ）が、
知られているが、この研究は３，４−キシレノールの分
解が４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を経て進行し
ていることを明らかにしているに過ぎない。また、反応
時に加える３，４−キシレノールの濃度が０．０４重量
％以下と低濃度でないとその微生物に与える毒性のため
に反応が進行しなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このため、微生物、酵
素の持つ反応特異性を用いてより効率的に４−ヒドロキ
シ−２−メチル安息香酸を生産するために、より高い濃
度の３，４−キシレノールに対して耐性をもつ微生物の
必要性が高まっている。本発明の目的は、反応選択性の
高い微生物変換反応を利用して、４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸を製造する新規な方法を提供することで
ある。
素の持つ反応特異性を用いてより効率的に４−ヒドロキ
シ−２−メチル安息香酸を生産するために、より高い濃
度の３，４−キシレノールに対して耐性をもつ微生物の
必要性が高まっている。本発明の目的は、反応選択性の
高い微生物変換反応を利用して、４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸を製造する新規な方法を提供することで
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学合成
法よりも反応選択性の高い微生物の酵素を用いた酸化反
応に着目した。すなわち、微生物に増殖を支える基質を
与えて増殖させ、この培養液に３，４−キシレノールを
共存させて、この３，４−キシレノールを酸化・変換さ
せるコ・オキシデーション（Co‐oxidation ）の方法に
よって４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を生成さ
せ、得られた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を分
解させることなく著量蓄積させる方法を完成することを
目的とした。そこで、本発明者らは、コ・オキシデーシ
ョンにより３，４−キシレノールから４−ヒドロキシ−
２−メチル安息香酸を生産する能力を持つ微生物を検索
した結果、シユードモナス属に属する細菌菌株に、３，
４−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチル安息香
酸に変換する菌抹を見いだし、本発明を完成した。
法よりも反応選択性の高い微生物の酵素を用いた酸化反
応に着目した。すなわち、微生物に増殖を支える基質を
与えて増殖させ、この培養液に３，４−キシレノールを
共存させて、この３，４−キシレノールを酸化・変換さ
せるコ・オキシデーション（Co‐oxidation ）の方法に
よって４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を生成さ
せ、得られた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を分
解させることなく著量蓄積させる方法を完成することを
目的とした。そこで、本発明者らは、コ・オキシデーシ
ョンにより３，４−キシレノールから４−ヒドロキシ−
２−メチル安息香酸を生産する能力を持つ微生物を検索
した結果、シユードモナス属に属する細菌菌株に、３，
４−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチル安息香
酸に変換する菌抹を見いだし、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、微生物シュードモナ
ス・プチダ種を用いて、３，４−キシレノールの４位の
メチル基のみを選択的に酸化して４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸に変換する４−ヒドロキシ−２−メチル
安息香酸の製造方法を提供する。また、微生物シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０株、シュードモナス・プ
チダＫＳ‐０１８０株を用いて、３，４−キシレノール
を４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する４−
ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法を提供す
る。さらに、その微生物菌体を培養して、３，４−キシ
レノールを添加した培地で培養する４−ヒドロキシ−２
−メチル安息香酸の製造方法を提供する。また、その微
生物の菌体を培養して増殖させた後、３，４−キシレノ
ールを添加して培養を継続し、３，４−キシレノールを
４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する４−ヒ
ドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法を提供する。
ス・プチダ種を用いて、３，４−キシレノールの４位の
メチル基のみを選択的に酸化して４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸に変換する４−ヒドロキシ−２−メチル
安息香酸の製造方法を提供する。また、微生物シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０株、シュードモナス・プ
チダＫＳ‐０１８０株を用いて、３，４−キシレノール
を４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する４−
ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法を提供す
る。さらに、その微生物菌体を培養して、３，４−キシ
レノールを添加した培地で培養する４−ヒドロキシ−２
−メチル安息香酸の製造方法を提供する。また、その微
生物の菌体を培養して増殖させた後、３，４−キシレノ
ールを添加して培養を継続し、３，４−キシレノールを
４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する４−ヒ
ドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法を提供する。
【０００６】以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方
法は、シュードモナス属に属する菌株、特に、シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０株、シュードモナス・プ
チダＫＳ‐０１８０株の菌体のコ・オキシデーション作
用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質
を共存させ、微生物の増殖は、変換させたい物質とは別
の増殖に必要な炭素源、窒素源で行ない、増殖した微生
物が培養液中に共存した出発物質を酸化変換させること
である。本発明では、微生物シュードモナス属に属する
菌株を用いて工業的規模で、３，４−キシレノールを４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に酸化することがで
きる。特に、シュードモナス・プチダＫＳ−０１６０
株、シュードモナス・プチダＫＳ−０１８０株を用い
て、３，４−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチ
ル安息香酸に酸化することである。
本発明の４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方
法は、シュードモナス属に属する菌株、特に、シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０株、シュードモナス・プ
チダＫＳ‐０１８０株の菌体のコ・オキシデーション作
用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質
を共存させ、微生物の増殖は、変換させたい物質とは別
の増殖に必要な炭素源、窒素源で行ない、増殖した微生
物が培養液中に共存した出発物質を酸化変換させること
である。本発明では、微生物シュードモナス属に属する
菌株を用いて工業的規模で、３，４−キシレノールを４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に酸化することがで
きる。特に、シュードモナス・プチダＫＳ−０１６０
株、シュードモナス・プチダＫＳ−０１８０株を用い
て、３，４−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチ
ル安息香酸に酸化することである。
【０００７】本発明で使用する菌株は、シュードモナス
・プチダ種に属すると同定される細菌であって、３，４
−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸
に変換する能力のある菌株であればよい。特に、シュー
ドモナス・プチダＫＳ‐０１６０株、シュードモナス・
プチダＫＳ‐０１８０株が好ましい。したがって、土壌
から単離した菌株で、バージーズ・マニュアル・オブ・
システマチツク・バクテリオロジー（Bergey's Mannual
of Systematic Bacteriology）、Voｌ．1, 141〜199
（1984）に記載の基準により、シュードモナス属の菌株
であると同定した菌株であってもよい。また微工研など
の機関から入手したものであってもよい。シュードモナ
ス・プチダＫＳ−０１６０株は、平成４年３月１７日付
で、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、Ps
eudomonas putida ＫＳ−０１６０という識別のための
表示で寄託・保管されており、その寄託番号は、微工研
菌寄第１２８７９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８７９）であ
る。シュードモナス・プチダＫＳ‐０１８０株は、平成
４年３月１７日付で、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、Pseudomonas putida ＫＳ−０１８０と
いう識別のための表示で寄託・保管されており、その寄
託番号は、微工研菌寄第１２８８０号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２８８０）である。シュードモナス・プチダＫＳ−０
１６０株およびシュードモナス・プチダＫＳ０１８０株
の単離・同定は、特願平４−145729号および特願平４−
145730号に記載の通りである。本発明は、これらの記載
を引用して本明細書の範囲とする。
・プチダ種に属すると同定される細菌であって、３，４
−キシレノールを４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸
に変換する能力のある菌株であればよい。特に、シュー
ドモナス・プチダＫＳ‐０１６０株、シュードモナス・
プチダＫＳ‐０１８０株が好ましい。したがって、土壌
から単離した菌株で、バージーズ・マニュアル・オブ・
システマチツク・バクテリオロジー（Bergey's Mannual
of Systematic Bacteriology）、Voｌ．1, 141〜199
（1984）に記載の基準により、シュードモナス属の菌株
であると同定した菌株であってもよい。また微工研など
の機関から入手したものであってもよい。シュードモナ
ス・プチダＫＳ−０１６０株は、平成４年３月１７日付
で、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、Ps
eudomonas putida ＫＳ−０１６０という識別のための
表示で寄託・保管されており、その寄託番号は、微工研
菌寄第１２８７９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８７９）であ
る。シュードモナス・プチダＫＳ‐０１８０株は、平成
４年３月１７日付で、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、Pseudomonas putida ＫＳ−０１８０と
いう識別のための表示で寄託・保管されており、その寄
託番号は、微工研菌寄第１２８８０号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２８８０）である。シュードモナス・プチダＫＳ−０
１６０株およびシュードモナス・プチダＫＳ０１８０株
の単離・同定は、特願平４−145729号および特願平４−
145730号に記載の通りである。本発明は、これらの記載
を引用して本明細書の範囲とする。
【０００８】本発明の製造方法は、微生物を増殖させる
工程および微生物を利用して３，４−キシレノールを４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する工程を包
含する。また、微生物を増殖させる工程（増殖工程）と
微生物を利用して３，４−キシレノールを４−ヒドロキ
シ−２−メチル安息香酸に酸化する工程（変換工程）
は、別々の工程であっても、同時に行なわれる工程であ
ってもよい。本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖さ
せる（増殖工程）のための培地としては、通常の細菌用
培地を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる
培地で、かつ微生物による酸化反応を進行させるもので
あれば、いかなる組成の培地も使用できる。この時に用
いる培地は、培地成分として、適切な炭素源、窒素源お
よび無機塩などを含有しうる。また、本発明の変換工程
に使用する培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いても
よく、また異なる培地を用いてもよい。培地成分に、前
記菌体を増殖するための培地に含まれる成分と同じ成分
を含み得る。
工程および微生物を利用して３，４−キシレノールを４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変換する工程を包
含する。また、微生物を増殖させる工程（増殖工程）と
微生物を利用して３，４−キシレノールを４−ヒドロキ
シ−２−メチル安息香酸に酸化する工程（変換工程）
は、別々の工程であっても、同時に行なわれる工程であ
ってもよい。本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖さ
せる（増殖工程）のための培地としては、通常の細菌用
培地を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる
培地で、かつ微生物による酸化反応を進行させるもので
あれば、いかなる組成の培地も使用できる。この時に用
いる培地は、培地成分として、適切な炭素源、窒素源お
よび無機塩などを含有しうる。また、本発明の変換工程
に使用する培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いても
よく、また異なる培地を用いてもよい。培地成分に、前
記菌体を増殖するための培地に含まれる成分と同じ成分
を含み得る。
【０００９】炭素源としては、本発明の菌株が利用でき
る任意の炭索源を使用できる。かかる炭素源としてリボ
ース、グルコース、フルクトース、マンノースなどの糖
類、大豆油、オリーブ油などの脂質、メタノール、エタ
ノール、グリセロール（グリセリン）などのアルコー
ル、コハク酸、マロン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸な
どの有機酸、廃糖蜜などの農産物残渣が例示できる。菌
体増殖用の培地の場合には、上述したような本発明の菌
体が利用しうる１種または２種以上の有機化合物を任意
に炭素源として利用できる。また、変換培養用の培地の
場合には増殖に使用したすべての炭素源が利用できる、
グルコース、グリセリンなど本発明に使用する細菌の利
用しやすい有機化合物や単糖類が望ましい。炭素源の含
有量は、炭素源の種類によっても異なるが、培地中０．
２重量％以上、特に０．２〜１０重量％であるのが菌体
を充分に増殖させる点で望ましい。
る任意の炭索源を使用できる。かかる炭素源としてリボ
ース、グルコース、フルクトース、マンノースなどの糖
類、大豆油、オリーブ油などの脂質、メタノール、エタ
ノール、グリセロール（グリセリン）などのアルコー
ル、コハク酸、マロン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸な
どの有機酸、廃糖蜜などの農産物残渣が例示できる。菌
体増殖用の培地の場合には、上述したような本発明の菌
体が利用しうる１種または２種以上の有機化合物を任意
に炭素源として利用できる。また、変換培養用の培地の
場合には増殖に使用したすべての炭素源が利用できる、
グルコース、グリセリンなど本発明に使用する細菌の利
用しやすい有機化合物や単糖類が望ましい。炭素源の含
有量は、炭素源の種類によっても異なるが、培地中０．
２重量％以上、特に０．２〜１０重量％であるのが菌体
を充分に増殖させる点で望ましい。
【００１０】窒素源としては、とくに限定されないが、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、尿素などの有機窒素源、および硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源が利
用できる。また、窒素源の含有量は、培養液に対して、
０．１〜１０重量％、特に、０．２〜５重量％であるの
が、菌体を充分に増殖させる点で好ましい。有機窒素源
を用いた場合、これには炭素源も含まれているので、別
の炭素源を新たに加えることは増殖用培地の場合には必
すしも必要ではない。
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、尿素などの有機窒素源、および硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源が利
用できる。また、窒素源の含有量は、培養液に対して、
０．１〜１０重量％、特に、０．２〜５重量％であるの
が、菌体を充分に増殖させる点で好ましい。有機窒素源
を用いた場合、これには炭素源も含まれているので、別
の炭素源を新たに加えることは増殖用培地の場合には必
すしも必要ではない。
【００１１】無機塩類としては各種の硫酸塩、リン酸
塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カ
リウム塩などが使用できる。具体的には、硫酸鉄、リン
酸１水素２ナトリウム、リン酸２水素１カリウム、炭酸
ナトリウム、塩化カルシウム等が挙げられる。無機塩類
の好ましい添加量は、０．１〜１０重量％、特に、リン
酸１水素２ナトリウムの場合、０．２〜１．０重量％で
あるのが、菌体を充分に増殖させる点で好ましい。さら
に、微量の重金属塩、例えば鉄塩、マンガン塩、銅塩、
亜鉛塩、モリプデン塩、コパルト塩などを培地に含有さ
せてもよい。
塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カ
リウム塩などが使用できる。具体的には、硫酸鉄、リン
酸１水素２ナトリウム、リン酸２水素１カリウム、炭酸
ナトリウム、塩化カルシウム等が挙げられる。無機塩類
の好ましい添加量は、０．１〜１０重量％、特に、リン
酸１水素２ナトリウムの場合、０．２〜１．０重量％で
あるのが、菌体を充分に増殖させる点で好ましい。さら
に、微量の重金属塩、例えば鉄塩、マンガン塩、銅塩、
亜鉛塩、モリプデン塩、コパルト塩などを培地に含有さ
せてもよい。
【００１２】培養方法としては、通常の振盪培養法、深
部通気攪拌培養法などの方法により行なうことができ
る。培養温度は20〜37℃、pHは中性付近が望ましい。培
養日数は反応の進行に応じて決めることができるが、通
常は菌体増殖に１日、基質の変換に１〜２日であるのが
好ましい。基質の変換が１日未満であると、酸化中間体
である、４−ヒドロキシ−２−メチルベンジルアルコー
ル、４−ヒドロキシ−２−メチルベンズアルデヒドが生
じる。また、変換から３日以上であると、微生物の２次
代謝産物が増えるため、生成物の分離が難しくなり不利
である。また必要に応じて、脂肪酸エステル系、シリコ
ン系などの消泡剤を添加してもよい。
部通気攪拌培養法などの方法により行なうことができ
る。培養温度は20〜37℃、pHは中性付近が望ましい。培
養日数は反応の進行に応じて決めることができるが、通
常は菌体増殖に１日、基質の変換に１〜２日であるのが
好ましい。基質の変換が１日未満であると、酸化中間体
である、４−ヒドロキシ−２−メチルベンジルアルコー
ル、４−ヒドロキシ−２−メチルベンズアルデヒドが生
じる。また、変換から３日以上であると、微生物の２次
代謝産物が増えるため、生成物の分離が難しくなり不利
である。また必要に応じて、脂肪酸エステル系、シリコ
ン系などの消泡剤を添加してもよい。
【００１３】本発明の製造方法に用いる３，４−キシレ
ノールは、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、ま
た、菌体の増殖培養後に添加してもよい。さらに増殖培
養時および増殖培養後の両方に添加してもよい。また、
菌体の増殖培殖後に添加する場合、３，４−キシレノー
ルを添加する時期は、菌体濃度が、660nm の吸光度で、
１．０から10．０、特に２．０〜８．０の時に添加する
のが変換速度を確保するために望ましい。３，４−キシ
レノールの添加方法としては、一度に、あるいは少しづ
つ添加してもよいし、その添加時期は、菌体増殖の開始
点で加えてもよく、また、経時的に添加する場合、増殖
後１日目、２日目に等量に分割して添加してもよい。添
加する３，４−キシレノールの培養液中の濃度は、１重
量％以下、特に０．５重量％以下であることが好まし
く、さらに０．１〜０．２重量％であるのが好ましい。
３，４−キシレノールの培養液中の濃度が、０．１重量
％未満では反応の効率が悪く、１重量％超では、微生物
が充分に作用しなくなるので好ましくない。さらに３，
４−キシレノールが０．１〜０．２重量％、特に０．１
〜０．１５重量％となるように連続的に添加してもよ
い。３，４−キシレノールを添加する時期を、菌体増殖
前にするのと増殖後にするのでは、菌体の増殖後に添加
したほうが５〜１０％変換率（４−ヒドロキシ−２−メ
チル安息香酸の収率）が高い。
ノールは、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、ま
た、菌体の増殖培養後に添加してもよい。さらに増殖培
養時および増殖培養後の両方に添加してもよい。また、
菌体の増殖培殖後に添加する場合、３，４−キシレノー
ルを添加する時期は、菌体濃度が、660nm の吸光度で、
１．０から10．０、特に２．０〜８．０の時に添加する
のが変換速度を確保するために望ましい。３，４−キシ
レノールの添加方法としては、一度に、あるいは少しづ
つ添加してもよいし、その添加時期は、菌体増殖の開始
点で加えてもよく、また、経時的に添加する場合、増殖
後１日目、２日目に等量に分割して添加してもよい。添
加する３，４−キシレノールの培養液中の濃度は、１重
量％以下、特に０．５重量％以下であることが好まし
く、さらに０．１〜０．２重量％であるのが好ましい。
３，４−キシレノールの培養液中の濃度が、０．１重量
％未満では反応の効率が悪く、１重量％超では、微生物
が充分に作用しなくなるので好ましくない。さらに３，
４−キシレノールが０．１〜０．２重量％、特に０．１
〜０．１５重量％となるように連続的に添加してもよ
い。３，４−キシレノールを添加する時期を、菌体増殖
前にするのと増殖後にするのでは、菌体の増殖後に添加
したほうが５〜１０％変換率（４−ヒドロキシ−２−メ
チル安息香酸の収率）が高い。
【００１４】さらに、増殖工程および変換工程を、３，
４−キシレノールを添加する時期の組み含わせで考える
と、以下の組み合わせが例示される。 １）３，４−キシレノールを、増殖工程の開始点で加
え、増殖工程と変換工程を同時に行う。 ２）微生物を増殖させた後、３，４−キシレノールを加
えて、変換反応を行う。３，４−キシレノールの添加
は、反応工程の途中または、開始点と途中の両方で行
う。 ３）３，４−キシレノールの添加を増殖工程と変換工程
とに各々少なくとも１回以上行い、増殖工程の後に菌体
を培地から分離して変換反応の培地に移植する。
４−キシレノールを添加する時期の組み含わせで考える
と、以下の組み合わせが例示される。 １）３，４−キシレノールを、増殖工程の開始点で加
え、増殖工程と変換工程を同時に行う。 ２）微生物を増殖させた後、３，４−キシレノールを加
えて、変換反応を行う。３，４−キシレノールの添加
は、反応工程の途中または、開始点と途中の両方で行
う。 ３）３，４−キシレノールの添加を増殖工程と変換工程
とに各々少なくとも１回以上行い、増殖工程の後に菌体
を培地から分離して変換反応の培地に移植する。
【００１５】上述の変換工程の培地は、増殖工程に用い
た培地と同様の培地であってもよく、また、本発明の菌
体が有する変換作用を妨げない溶液、例えば、各種緩衝
液、生理食塩水のような溶液であってもよい。リン酸緩
衝液を使用する場合、用いるリン酸緩衝液の濃度は、
０．０５〜１．０Ｍであるのが、変換率の点で好まし
い。また、リン酸緩衝液を使用する場合、炭素源とし
て、グリセリン、グルコース、フルクトース等を添加す
るのが好ましく、窒素源は添加しなくてもよいが、窒素
源として、尿素、酵母エキス、コーンスティープリカー
等を添加してもよい。緩衝液で反応させる場合は、窒素
源はなくても変換可能である。この場合、炭素源の添加
量は、培地中の炭素源の濃度が０．１〜１．０重量％に
なるように添加するのが、変換反応時間を短くすませる
ことができる点で好ましい。また、窒素源の添加量は、
培地中の窒素源の濃度が０〜１．０重量％になるように
添加するのが、変換反応時間を短くすませることができ
る点で好ましい。また前記２）の方法では、菌体を増殖
後、３，４−キシレノールを添加して培養を継続するこ
とが望まれる。
た培地と同様の培地であってもよく、また、本発明の菌
体が有する変換作用を妨げない溶液、例えば、各種緩衝
液、生理食塩水のような溶液であってもよい。リン酸緩
衝液を使用する場合、用いるリン酸緩衝液の濃度は、
０．０５〜１．０Ｍであるのが、変換率の点で好まし
い。また、リン酸緩衝液を使用する場合、炭素源とし
て、グリセリン、グルコース、フルクトース等を添加す
るのが好ましく、窒素源は添加しなくてもよいが、窒素
源として、尿素、酵母エキス、コーンスティープリカー
等を添加してもよい。緩衝液で反応させる場合は、窒素
源はなくても変換可能である。この場合、炭素源の添加
量は、培地中の炭素源の濃度が０．１〜１．０重量％に
なるように添加するのが、変換反応時間を短くすませる
ことができる点で好ましい。また、窒素源の添加量は、
培地中の窒素源の濃度が０〜１．０重量％になるように
添加するのが、変換反応時間を短くすませることができ
る点で好ましい。また前記２）の方法では、菌体を増殖
後、３，４−キシレノールを添加して培養を継続するこ
とが望まれる。
【００１６】変換反応の終了後、生成した４−ヒドロキ
シ−２−メチル安息香酸の培養液からの分離・精製は、
一般の有機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カ
ラムクロマトグラフィー、中和、濃縮、結晶化等の当業
者に周知の手段を適宜組み合わせることにより行なうこ
とができる。例えば、培養液から菌体などの固体を遠心
分離によって除去した後、上清を濃縮し、ついで濃縮液
を酸性にして、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を
沈澱させて固液分離する方法、あるいは上清を酸性にし
た後に、ジエチルエーテル、酢酸エチル、トルエン、ク
ロロホルムなどの有機溶媒あるいはこれらの混合溶媒に
よって抽出することにより分離する方法がある。このよ
うにして得られた粗精製物を各種クロマトグラフィー、
再結晶あるいはこれらを組み合わせることによって精製
することができる。本発明の方法により製造される４−
ヒドロキシ−２−メチル安息香酸は、医薬原料、香料中
間体、農薬原料等として有用である。
シ−２−メチル安息香酸の培養液からの分離・精製は、
一般の有機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カ
ラムクロマトグラフィー、中和、濃縮、結晶化等の当業
者に周知の手段を適宜組み合わせることにより行なうこ
とができる。例えば、培養液から菌体などの固体を遠心
分離によって除去した後、上清を濃縮し、ついで濃縮液
を酸性にして、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を
沈澱させて固液分離する方法、あるいは上清を酸性にし
た後に、ジエチルエーテル、酢酸エチル、トルエン、ク
ロロホルムなどの有機溶媒あるいはこれらの混合溶媒に
よって抽出することにより分離する方法がある。このよ
うにして得られた粗精製物を各種クロマトグラフィー、
再結晶あるいはこれらを組み合わせることによって精製
することができる。本発明の方法により製造される４−
ヒドロキシ−２−メチル安息香酸は、医薬原料、香料中
間体、農薬原料等として有用である。
【００１７】
【実施例】以下に、実施例を示し、本発明をさらに詳細
に説明するが、これによって、本発明がいかなる限定を
受けるものではない。培地は、下記の組成の培地
（Ｉ）、（ＩＩ）を使用した。 培地（Ｉ） リン酸１水素２ナトリウム ３．０ｇ リン酸２水素１カリウム ２．０ｇ 礒酸マグネシウム・７水和物 ０．２ｇ 炭酸ナトリウム ０．１ｇ 塩化カルシウム・２水和物 １０ｍｇ 硫酸鉄・７水和物 ５ｍｇ グリセリン ２．０ｇ 尿素 ２．０ｇ 酵母エキス １．０ｇ イオン交換水 １Ｌ ───────────────────────── ｐＨ ６．８ （p Ｈ調製後、１２０℃、１．２Ｋｇ／c m2、20分間滅
菌して使用）
に説明するが、これによって、本発明がいかなる限定を
受けるものではない。培地は、下記の組成の培地
（Ｉ）、（ＩＩ）を使用した。 培地（Ｉ） リン酸１水素２ナトリウム ３．０ｇ リン酸２水素１カリウム ２．０ｇ 礒酸マグネシウム・７水和物 ０．２ｇ 炭酸ナトリウム ０．１ｇ 塩化カルシウム・２水和物 １０ｍｇ 硫酸鉄・７水和物 ５ｍｇ グリセリン ２．０ｇ 尿素 ２．０ｇ 酵母エキス １．０ｇ イオン交換水 １Ｌ ───────────────────────── ｐＨ ６．８ （p Ｈ調製後、１２０℃、１．２Ｋｇ／c m2、20分間滅
菌して使用）
【００１８】培地（ＩＩ） 培地（Ｉ）に、培地（Ｉ）中の濃度が０．２重量％にな
るように３，４−キシレノールを添加した培地
るように３，４−キシレノールを添加した培地
【００１９】（実施例１）上記培地（Ｉ）５０mlにシュ
ードモナス・プチダKS‐0160を１白金耳接種し、３０
℃、ｐＨ６８、１８０ｒｐｍで１夜振盪培養した。得ら
れた培養液の５mlを上記培地（Ｉ）５０mlを仕込んだ３
００ml容フラスコに接種して１日間振盪培養を行なっ
た。培養条件は、温度３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐ
ｍ であった。この培養液に１００mgの３，４−キシレ
ノールを添加して、３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍ
で２４時間振盪培養を行なった。培養終了後、遠心分離
によって菌体を除去し、上清を１Ｎ塩酸でｐＨ２とした
後、塩化ナトリウムで飽和し酢酸エチル３０mlで３回抽
出した。有機層を３０ml飽和塩化ナトリウムで２回洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、濾過、減圧濃縮し
粗精製物を得た。この粗精製物を分離用薄層クロマトグ
ラフィーにより精製し、７６mg（６１％）の固体を得
た。この物質は、この固体をエタノール：キシレン
（１：１）の混合溶媒から再結晶し、得られた結晶の融
点、元素分析、1 Ｈ−NMR 分析、ＩＲ分析することによ
り、４−ヒトロキシ−２−メチル安息香酸であると同定
した。また、反応時間を短くすることにより、酸化中間
体である、４−ヒドロキシ−２−メチルベンジルアルコ
ール、４−ヒドロキシ−２−メチルベンズアルデヒドも
検出された。
ードモナス・プチダKS‐0160を１白金耳接種し、３０
℃、ｐＨ６８、１８０ｒｐｍで１夜振盪培養した。得ら
れた培養液の５mlを上記培地（Ｉ）５０mlを仕込んだ３
００ml容フラスコに接種して１日間振盪培養を行なっ
た。培養条件は、温度３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐ
ｍ であった。この培養液に１００mgの３，４−キシレ
ノールを添加して、３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍ
で２４時間振盪培養を行なった。培養終了後、遠心分離
によって菌体を除去し、上清を１Ｎ塩酸でｐＨ２とした
後、塩化ナトリウムで飽和し酢酸エチル３０mlで３回抽
出した。有機層を３０ml飽和塩化ナトリウムで２回洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、濾過、減圧濃縮し
粗精製物を得た。この粗精製物を分離用薄層クロマトグ
ラフィーにより精製し、７６mg（６１％）の固体を得
た。この物質は、この固体をエタノール：キシレン
（１：１）の混合溶媒から再結晶し、得られた結晶の融
点、元素分析、1 Ｈ−NMR 分析、ＩＲ分析することによ
り、４−ヒトロキシ−２−メチル安息香酸であると同定
した。また、反応時間を短くすることにより、酸化中間
体である、４−ヒドロキシ−２−メチルベンジルアルコ
ール、４−ヒドロキシ−２−メチルベンズアルデヒドも
検出された。
【００２０】（実施例２）実施例１で使用したものと同
じ組成の培地（Ｉ）に対して、０．２重量％の３，４−
キシレノールを添加した培地（ＩＩ）５０mlにシュード
モナス・プチダKS−0180株を１白金耳接種して、３０
℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで一夜培養した培養液５
ｍｌを、上記培地（ＩＩ）５０ｍｌを仕込んだ３００ｍ
ｌ容フラスコに接種して、３０℃、ｐＨ６．８、１８０
ｒｐｍで、４８時間振盪培養を行った。得られた培養液
からの４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の分離・精
製は遠心分離によって菌体を除き、上清に塩酸を加えｐ
Ｈ１とした後、この酸性溶液よりジエチルエーテルで４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を抽出分離し、抽出
液を減圧濃縮することにより粗結晶を得た。この粗結晶
を実施例１と同様にエタノール：キシレン（１：１）混
合溶媒から再結晶することにより白色結晶７０mg（５６
％）を得た。
じ組成の培地（Ｉ）に対して、０．２重量％の３，４−
キシレノールを添加した培地（ＩＩ）５０mlにシュード
モナス・プチダKS−0180株を１白金耳接種して、３０
℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで一夜培養した培養液５
ｍｌを、上記培地（ＩＩ）５０ｍｌを仕込んだ３００ｍ
ｌ容フラスコに接種して、３０℃、ｐＨ６．８、１８０
ｒｐｍで、４８時間振盪培養を行った。得られた培養液
からの４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の分離・精
製は遠心分離によって菌体を除き、上清に塩酸を加えｐ
Ｈ１とした後、この酸性溶液よりジエチルエーテルで４
−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸を抽出分離し、抽出
液を減圧濃縮することにより粗結晶を得た。この粗結晶
を実施例１と同様にエタノール：キシレン（１：１）混
合溶媒から再結晶することにより白色結晶７０mg（５６
％）を得た。
【００２１】（実施例３）上記培地（Ｉ）５０mlにシュ
ードモナス・プチダKS‐0180を１白金耳接種し、３０
℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで１夜振盪培養した。得
られた培養液の５mlを培地（Ｉ）５０mlを仕込んだ３０
０ml容フラスコに接種して１日振盪培養を行なった。培
養条件は、温度３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍであ
った。この培養液を遠心分離（8000ｒｐｍ，１０分）し
て菌体を分離採取した。得られた菌体は１／１５Ｍのリ
ン酸緩衝液で３回洗浄し、１／１５Ｍリン酸緩衝液２５
ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液を得た。さらに、５０mgのグ
リセリンと５０mgの３，４−キシレノールとを１／15Ｍ
リン酸緩衝液２５ｍｌに溶解し、この菌体懸濁液に添加
して２４時問、３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで反
応を行なった。反応終了後、遠心分離によって菌体を除
去し上清を１Ｎ塩酸でｐＨ２とした後、塩化ナトリウム
で飽和し、酢酸エチル３０mlで３回抽出した。有機層を
３０ml飽和塩化ナトリウムで２回洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウムで脱水し、濾過、減圧濃縮し、粗精製物を得
た。この粗精製物を分離用薄層クロマトグラフィーによ
り、精製し、４０mgの固体を得た。この粗結晶を実施例
１と同様にエタノール：キシレン（１：１）混合溶媒か
ら再結晶することにより白色結晶３８mg（６１％）を得
た。
ードモナス・プチダKS‐0180を１白金耳接種し、３０
℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで１夜振盪培養した。得
られた培養液の５mlを培地（Ｉ）５０mlを仕込んだ３０
０ml容フラスコに接種して１日振盪培養を行なった。培
養条件は、温度３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍであ
った。この培養液を遠心分離（8000ｒｐｍ，１０分）し
て菌体を分離採取した。得られた菌体は１／１５Ｍのリ
ン酸緩衝液で３回洗浄し、１／１５Ｍリン酸緩衝液２５
ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液を得た。さらに、５０mgのグ
リセリンと５０mgの３，４−キシレノールとを１／15Ｍ
リン酸緩衝液２５ｍｌに溶解し、この菌体懸濁液に添加
して２４時問、３０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍで反
応を行なった。反応終了後、遠心分離によって菌体を除
去し上清を１Ｎ塩酸でｐＨ２とした後、塩化ナトリウム
で飽和し、酢酸エチル３０mlで３回抽出した。有機層を
３０ml飽和塩化ナトリウムで２回洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウムで脱水し、濾過、減圧濃縮し、粗精製物を得
た。この粗精製物を分離用薄層クロマトグラフィーによ
り、精製し、４０mgの固体を得た。この粗結晶を実施例
１と同様にエタノール：キシレン（１：１）混合溶媒か
ら再結晶することにより白色結晶３８mg（６１％）を得
た。
【００２２】（実施例４）微生物シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１６０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１８０を用いた以外は、実施例１と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸６８
ｍｇ（５５％）を得た。
ダＫＳ−０１６０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１８０を用いた以外は、実施例１と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸６８
ｍｇ（５５％）を得た。
【００２３】（実施例５）微生物シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１８０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１６０を用いた以外は、実施例２と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸６３
ｍｇ（５０％）を得た。
ダＫＳ−０１８０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１６０を用いた以外は、実施例２と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸６３
ｍｇ（５０％）を得た。
【００２４】（実施例６）微生物シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１８０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１６０を用いた以外は、実施例３と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸３４
ｍｇ（５５％）を得た。
ダＫＳ−０１８０の代わりに、シュードモナス・プチダ
ＫＳ−０１６０を用いた以外は、実施例３と同じ条件で
培養を行い、４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸３４
ｍｇ（５５％）を得た。
【００２５】
【発明の効果】本発明の方法により、３，４−キシレノ
ールから微生物の作用によって位置選択的に、酸化する
ことにより、医薬、香科、農薬等の原科として有用な４
−ジドロキシ−２−メチル安息香酸を製造することがで
きる。
ールから微生物の作用によって位置選択的に、酸化する
ことにより、医薬、香科、農薬等の原科として有用な４
−ジドロキシ−２−メチル安息香酸を製造することがで
きる。
Claims (5)
- 【請求項１】微生物シュードモナス・プチダ種を用い
て、３，４−キシレノールの４位のメチル基のみを選択
的に酸化して４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸に変
換することを特徴とする４−ヒドロキシ−２−メチル安
息香酸の製造方法。 - 【請求項２】前記微生物シュードモナス・プチダ（Pseu
domonas putida）種が、シュードモナス・プチダＫＳ−
０１６０である請求項１に記載の４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸の製造方法。 - 【請求項３】前記微生物シュードモナス・プチダ（Pseu
domonas putida）種が、シュードモナス・プチダＫＳ−
０１８０である請求項１に記載の４−ヒドロキシ−２−
メチル安息香酸の製造方法。 - 【請求項４】前記微生物を、３，４−キシレノールを添
加した培地で培養する請求項１〜３のいずれかに記載の
４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法。 - 【請求項５】前記微生物を培養して増殖させた後、３，
４−キシレノールを添加し、４−ヒドロキシ−２−メチ
ル安息香酸を得る請求項１〜３のいずれかに記載の４−
ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6013397A JPH07213295A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | 微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6013397A JPH07213295A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | 微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213295A true JPH07213295A (ja) | 1995-08-15 |
Family
ID=11831988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6013397A Withdrawn JPH07213295A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | 微生物を用いた４−ヒドロキシ−２−メチル安息香酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07213295A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7863027B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| KR20210136990A (ko) | 2019-03-06 | 2021-11-17 | 혼슈우 카가쿠고교 가부시키가이샤 | 4－히드록시－2－메틸안식향산의 제조방법 |
-
1994
- 1994-02-07 JP JP6013397A patent/JPH07213295A/ja not_active Withdrawn
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7863027B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7867739B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7867737B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7867738B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7875443B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-01-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7919287B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-04-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7919288B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-04-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7919286B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-04-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7927846B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-04-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| US7927847B2 (en) | 2007-10-31 | 2011-04-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for enzymatically converting glycolonitrile to glycolic acid |
| KR20210136990A (ko) | 2019-03-06 | 2021-11-17 | 혼슈우 카가쿠고교 가부시키가이샤 | 4－히드록시－2－메틸안식향산의 제조방법 |
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