JPS63207391A - 芳香族化合物の微生物酸化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、フェナントレンやアントラセンといった縮合
３環式芳香族炭化水素化合物の微生物酸化によるヒドロ
キシナフトエ酸の製造方法に関する。さらに詳しく述べ
ると、本発明は新規な微生物シュードモナス・スツッチ
ェリ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ口ａＳｓｔｕｔｚｅｒｉ）　
５　Ａ菌株（徽工研菌寄第９１１８号）を、コークス製
造時に副生ずるコールタール中に含まれる成分であるフ
ェナントレンやアントラセンを含む培地で培養し、培養
液中に蓄積した酸化生成物のヒドロキシナフトエ酸を採
取することからなる、縮合３環式芳香族炭化水素化合物
の微生物酸化法に関する。

（従来の技術） 従来、ヒドロキシナフトエ酸類は、ナフトール類を原料
とし、これに二酸化炭素を高温・高圧下で作用させるコ
ルベ・シュミット法による化学合成で一最に行われてき
た。しかし、反応条件として高温・高圧を要するために
エネルギー消費量が大きく、また原料のナフトールの合
成にも多量のエネルギーを要することが問題であった。

一方、常温常圧で進行する微生物反応によるヒドロキシ
ナフトエ酸の製造方法として、シュードモナス・エスピ
ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　ＡＴＣＣ１９
２８６を用いた微生物酸化により、アントラセンから３
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を製造することが公知で
ある（米国特許第３，６３４．１９２号参照）、シかし
、この微生物は、同じ縮合３環式芳香族炭化水素である
フェナントレンに対する反応性を有していない、これは
、反応に関与する酵素の特異性によるものと思われる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、コールタール中に含まれている縮合３
環式芳香族炭化水素であるアントラセンおよびフェナン
トレンの両方の有効利用を図るために、これらのいずれ
を原料とした場合にも有用物質を製造できる微生物変換
方法を提供することである。

本発明の別の目的は、常温・常圧で進行する経済的な微
生物変換法を利用して、ヒドロキシナフトエ酸を製造す
る方法を提供することである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、微生物培養により得られる省エネルギー
的な物質変換能、すなわち資化作用に着目して、アント
ラセンおよびフェナントレンｄような３環もしくはそれ
以上の縮合多環芳香族炭化水素を基質として利用できる
微生物を求めて、各地の土壌から得られた種々の芳香族
炭化水素資化性菌を検索した結果、シュードモナス属に
属する細菌菌種に、ナフタレン類だけでなく３環芳香族
炭化水素化合物を酸化的に資化して、ヒドロキシナフト
エ酸を生産する能力を有している菌株があることを見出
し、本発明を完成した。

ここに、本発明は、シュードモナス・スツッチェリ５Ａ
菌株（徽工研菌寄第９１１８号）を、縮合３環式芳香族
炭化水素化合物を含有する培地で培養し、培養液から酸
化代謝産物のヒドロキシナフトエ酸を分離することを特
徴とする、縮合３環式芳香族炭化水素化合物の微生物酸
化方法にある。

なお、本明細書において、「縮合３環式芳香族炭化水素
化合物」とは、非置換のアントラセンおよびフェナント
レン、ならびにメチル基などのアルキル基で置換された
これらの誘導体を包含する意味である。

（作用） 本発明において利用する上記菌株の菌学的性質は次の通
りである。

シュードモナス・スツッチェリ５Ａの ｆａｔ形態 ■細胞の形と大きさ二桿菌、約０．６ｘ１．７　ｔｎ■
運動性の有無と鞭毛の着生状Ｂ：有り、極鞭毛（１本） ■細胞の多形性および胞子の有無：共に無し■グラム染
色性：陰性 （ｂｌ各種培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養： （＋）　　不定形、黄褐色、コロニー全体がしわ状、固
着性（分離直１１ｔ） （ｉｉ　）円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色（植継
時） ■肉汁寒天斜面培養：生育良好、淡黄褐色、コロニーの
外側に透明帯、周縁部がしわ状■肉汁液体培養：生育や
や不良、菌属形成、沈渣有り ■肉汁ゼラチン穿刺培養二表層部で生育、液化しない ■リドマス・ミルク；リドマスを還元、アルカリ性化（
微弱） （ｃｌ生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性（窒素ガス発生）■亜硝酸塩の還
元：陽性 ■ＭＲテスト：陰性 ■ＶＰテスト：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■硫化水素の生成：陰性（ＴＳＩ培地）■澱粉の加水分
解；陽性 ■脱窒反応：陽性 ■プロトカテキン酸の開裂：オルト開裂＠フルギニンジ
ヒドロラーゼ：陰性 ■色素：生成せず ＠リパーゼ：陽性 ■ウレアーゼ：陰性 ［相］カタラーゼ：陽性 ［相］オキシダーゼ：陽性 ［相］生育範囲 温度：１０〜４１℃ ｐＨ：６〜９ ■グルコン酸の酸化：微陽性 ［相］アセトアミドの加水分解：陰性 ［相］酸素に対する態度：好気的 ［相］Ｏ−Ｆテスト：酸化的 ［相］糖類からの酸の生成（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：０ポリ−β−ヒドロキシ醋酸の蓄積ニー〇炭素化
合物の資化性（飯塚・駒形法）　：本発明者らは、アン
トラセンおよびフェナントレンに対して微生物酸化作用
を示す上記細菌菌株について、上の菌学的性質に基づき
バーシーズ・マニュアル・オプ・システマテインク・バ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　
ｏｆ　５ｙｓｔｅ＋＊ａｔｉｃ　ＢａＣｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）、　Ｖｏｌ、　１　（１９８４）に記載の基準に
従って公知の菌株との異同を検討した結果、シェードモ
ナス・スラッチエリ種に属する新規な菌株と認め、シュ
ードモナス・スツッチェリ５Ａと命名した。この菌株は
微工研菌寄第９１１８号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託・保管されている。この新規菌株の分離
および増殖法については、特願昭６２−　　　号に説明
されているので、詳しい説明は省略する。

この細菌菌株は、上述したように、アントラセンおよび
フェナントレンを酸化的に資化して、開環および酸化反
応により、それぞれ３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸お
よび１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を蓄積した量で生
産することができる。

これらの３環化合物のアルキル置換誘導体を基質として
使用した場合には、対応するアルキル置換ヒドロキシナ
フトエ酸が生産されよう。

本発明の方法で使用する細菌菌株の培養のための培地と
しては、この菌株が良好に成育し、かつ原料となる縮合
３環芳香族炭化水素化合物を基質として十分に酵素酸化
反応を進行させるものであれば、いかなる組成の培地も
使用できる。また、菌体増殖用と微生物反応用に異なる
２種類の培地を用いてもよい。

この時に用いる培地は、培地成分として、適当な炭素源
、窒素源および無機塩などを含有しうる。

炭素源として、微生物反応用の培地の場合、原料となる
３環芳香族炭化水素化合物を単独で利用できる。所望に
より、さらに、本発明の菌株が利用できる任意の炭素源
を追加の炭素源として併用しうる。かかる追加の炭素源
として利用できる有機物には、上記の菌学的性質におい
て示したように、グリセリン、エタノールなどの有機化
合物、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、マロ
ン酸、クエン酸などの有機酸が挙げられる。追加の炭素
源として好適な有機化合物の例はグリセリンである。菌
体増殖用の培地の場合には、原料化合物に限らず、上述
したような本発明の菌株が利用できる１種または２種以
上の炭素含有材料を任意に炭素源として利用できる。

窒素源としては、特に限定されないが、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、およびペ
プトンなど有機窒素源が利用できる。有機窒素化合物を
用いた場合、これには炭素も含まれているので、別の炭
素源は増殖用培地の場合には必ずしも必要でない。

無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグネシウム
などが使用できる。さらに、微量の重金属塩（例、鉄塩
、マンガン塩など）を培地に含有させてもよい。

培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌培養法な
どの方法により行うことができる。培養温度は２５〜３
５℃、ｐ　Ｈは中性付近、培養日数は反応の進行に応じ
て決めることができるが、通常は７〜１０日が適当であ
る。この時に、原料となる３環芳香族炭化水素化合物は
水に難溶性であるために、ポリオキシエチレンソルビタ
ンなどの各種の界面活性剤を培地に添加することも可能
である。

また、必要に応じて、消泡剤を添加してもよい。

培養終了後、生成したヒドロキシナフトエ酸の培養液か
らの分離・精製は、一般の有機化合物の分離・精製と同
様に、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、中和、濃
縮、結晶化などの当業者に周知の手段を適宜組合わせる
ことにより行うことができる。たとえば、培養液から菌
体を遠心分離によって除いた後、上清を濃縮し、次いで
酸性化して生成物を沈澱させて固液分離する方法、ある
いは上記上清を酸性化した後、酢酸エチル、クロロホル
ムなどの有機溶媒による溶媒抽出で生成物を分離する方
法がある。得られた粗製物を各種のカラムクロマトグラ
フィーあるいは再結晶などの方法によって精製すること
ができる。

本発明の方法により製造されるヒドロキシナフトエ酸類
は、医薬品、農薬、染料などの原料として有用である。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

叉血炭上 本実施例は、本発明の方法によるフェナントレンから１
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への微生物変換を例示す
る。使用した培地は下記組成のものであった。

隻皿■處（重量％） 硫酸アンモニウム　　　　　０．５％ リン酸水素２カリウム　　　０．２％ リン酸２水素ナトリウム　　０．２％ 硫酸マグネシウム・７水塩　０．０１％硫酸第一鉄・７
水塩　　　　０．０１％硫酸マンガン・７水塩　　　０
．０１％酵母エキス　　　　　　　　０．００１％グ１
セ１ン　　　　　　　０．０５％ Ｈ８ （ｐ　Ｈ！Ｊ！節後、口過および滅菌して使用）上記組
成の培地５０ｄを使用し、シェードモナス・スラッチエ
リ５Ａ菌株を３０℃で振盪培養した。

１夜培養後、基質としてフェナントレン５０■を添加し
、酵素反応を開始させた。基質添加後８白目の培養液中
の１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成量は１８３■
／１であった。

培養液からの生成物の分離・精製は次のようにして行っ
た。培養液を８０℃で３０分間熱処理した後、遠心分離
によって菌体および変性タンパク質を除去した。上滑に
硫酸を加えてｐＨを１とした後、この酸性溶液よりクロ
ロホルムで１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を抽出分離
し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を得た。

この粗結晶をｎ−ヘキサンより再結晶することによって
白色針状結晶を得た。

得られた白色針状結晶は、元素分析およびＮＭＲにより
、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と確認された。

元素分析値（Ｃ＋＋ＨｅＯｓ） 計算イ直　：　　Ｃ７０，４５％、　Ｈ４，１２％実測
値：　Ｃ６９，５０％、）１４．１５％”Ｃ−ＮＭＲ（
単位：ｐｐｍ、測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄｂ）′カルボキシ
ル基：　１７２．８ 芳香環：　　　　　１６０．２，１３６．６，１２９．
４，１２７．６゜１２５．９．１２４．８．１２４．０
．１２２．９゜１１８．３．１０５．９ 尖施炎１ 本実施例は、本発明の方法によるアントラセンの３−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸への変換を例示する。

基質としてアントラセン５０■を使用して、実施例１と
同様の方法によりシュードモナス・スツッチェリ５Ａを
培養し、酵素反応を実施した。基質添加後８日月の培養
液中の３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成量は２３
ｔｗ／ｌであった。

次に示す高速液体クロマトグラフィー（ＪＩＰＬＣ）お
よび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析の結果、こ
の酵素酸化反応の生成物は３−ヒドロキシ−２−ナフト
エ酸であることが確認された。

１１ＰＬｃ（ｔ＋＋）　　　　　８．８３　　　　　　
　８．８４ＴＬＣ＊（Ｒｒ）　　０．０６（０，２４）
Ｆ　　　　Ｏ，０６（０，２４）Ｆ（発明の効果） 本発明の方法は、フェナントレンやアントラセンといっ
たコールタールに含まれる安価な成分の有効利用に寄与
し、同時に、従来は一般に高温・高圧下での反応により
化学合成されたいたヒドロキシナフトエ酸類を、微生物
酸化という常温・常圧で進行する経済的な方法により製
造することができる。このように、本発明はコールター
ル成分の有効利用と、ヒドロキシナフトエ酸の安価な製
造という二つの技術的課題を同時に解決したものである
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス・スツッチェリ５Ａ菌株（微工研
   菌寄第９１１８号）を、縮合３環式芳香族炭化水素化合
   物を含有する培地で培養し、培養液から酸化代謝産物の
   ヒドロキシナフトエ酸を分離することを特徴とする、縮
   合３環式芳香族炭化水素化合物の微生物酸化方法。
2. （２）前記芳香族炭化水素化合物がフェナントレンであ
   り、前記酸化代謝産物が１−ヒドロキシ−２−ナフトエ
   酸である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記芳香族炭化水素化合物がアントラセンであり
   、前記酸化代謝産物が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。