JPS63207378A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な微生物、具体的には、置換および非置
換のいずれの縮合多環芳香族炭化水素化合物をも酸化的
に資化して、有用化合物に転換する能力を示す、シュー
ドモナス・スツッチェリ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
５ｔｕｔｚｅｒｉ）種に属する新規な細菌菌株に関する
。

（従来の技術） 従来、芳香族炭化水素、特にコールタール中に含まれて
いる縮合多環芳香族炭化水素化合物（例、ナフタレン、
アントラセン、フェナントレン、あるいはこれらのアル
キル置換化合物など）に対する微生物の作用に関しては
、環境汚染防止の観点から、微生物の異化作用によるこ
れらの化合物の分解について多くの研究がなされており
、芳香族炭化水素化合物の分解性菌としてシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｓ＋ｏｎａｓ）属およびアルカリゲネ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する細菌を中心に
多数の細菌が知られている。

一方、微生物培養により得られる省エネルギー的な物質
変換能、すなわち資化作用に着目すると、コールタール
中に含まれる種々の物質を原料とし、これを微生物の資
化作用により有用物質に転換できれば、資源エネルギー
の有効利用の面で大変有利かつ重要であると考えられる
。しかし、芳香族炭化水素化合物、特に多環芳香族炭化
水素化合物は、脂肪族化合物と比較して微生物による酵
素反応を受けにくいために、多環芳香族炭化水素化合物
を原料とした微生物学的手法による有用物質の生成に関
する研究はそれほど多くない。

多環芳香族炭化水素化合物の微生物学的資化に関する従
来技術としては、ナフタレンから微生物作用により医薬
品等の原料であるサリチル酸を製造することが古くから
知られている（特公昭４３−２０７０４号公１ｍ）、ま
た、最近になり、シュードモナス属の細菌を利用してビ
フェニルをヒドロキシ化し、フェニルフェノールを生成
することも提案されている（特公昭６０−３８１１６号
公報）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の従来の微生物学的な多環芳香族炭化水素化合物の
製造例にあっては、原料となる芳香族炭化水素化合物が
置換基を持たない２環式化合物といった比較的簡単な構
造の物質である。これに置換基が導入された物質を原料
とした場合には、微生物中の酵素が基質特異性を示すた
めに、非置換化合物と同様に酵素反応を生じさせること
は容易ではない、また、フェナントレン、アントラセン
などの３環以上の縮合多環炭化水素化合物の酵素反応も
、同様の理由から容易ではない。

本発明の目的は、芳香族炭化水素化合物、特にコールタ
ール中に含まれる芳香族成分のうち、アルキル置換基を
有する多環芳香族炭化水素化合物、あるいはアントラセ
ン、フェナントレンなどの３環縮合環を有する炭化水素
化合物を基質とした場合にも成育し、これらの化合物を
別の存用化合物に転換させる能力を有する新規微生物を
提供することである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記のような能力を有する微生物を自然
界より検索した結果、シュードモナス属に属する細菌菌
種にこのような能力をもつものがあることを見出し、本
発明を完成させた。

すなわち、本発明により、シュードモナス属に属する細
菌菌株であって、非置換ナフタレン、１−もしくは２−
メチルナフタレン、２．３−ジメチルナフタレンなどの
本菌株が資化できるアルキル置換ナフタレン類、さらに
はフェナントレン、アントラセンなどの３環縮合環芳香
族炭化水素化合物を酸化的に資化する能力を有する、新
規菌株シェードモナス・スツソチェリ　（Ｐｓｅｕｄｏ
＋ｗｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）　　５Ａ　（微工研
菌寄第９１１８号）が提供される。

本発明者らが分離した本発明に係る新規菌株の菌学的性
質を次に記載する。

シェードモ　ス・スツ・チェＩ５への　　・（ａｌ形態 ■細胞の形と大きさ：桿菌、約０．６ｘ１．７　ｐｇ■
運動性の有無と鞭毛の着生状態：有り、極鞭毛（１本） ■細胞の多形性および胞子の有無：共に無し■グラム染
色性：陰性 山）各種培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養： （ｉ）　　不定形、黄褐色、コロニー全体がしわ状、固
着性（分離直１！ｔ） （ｉｉ　）円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色（植継
時） ■肉汁寒天斜面培養：生育良好、淡黄褐色、コロニーの
外側に透明帯、周縁部がしわ状■肉汁液体培ＩＩ：生育
やや不良、菌属形成、沈渣有り ■肉汁ゼラチン穿刺培養二表層部で生育、液化しない ■リドマス・ミルク：リドマスを還元、アルカリ性化（
微弱） （Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性（窒素ガス発生）■亜硝酸塩の還
元二陽性 ■ＭＲテスト：陰性 ■ｖｐテスト：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■硫化水素の生成：陰性（ＴＳＩ培地）■澱粉の加水分
解：陽性 ■脱窒反応：陽性 ■プロトカテキン酸の開裂：オルト開裂［相］アルギニ
ンジヒドロラーゼ：陰性■色素：生成せず ■リパーゼ：陽性 ■ウレアーゼ：陰性 ■カタラーゼ：陽性 ［相］オキシダーゼ：陽性 ［相］生育範囲 温度：１０〜４１℃ ｐＨ：６〜９ ０グルコン酸の酸化二′ＩＩ１．陽性 ［相］アセトアミドの加水分解：陰性 ０酸素に対する態度：好気的 ００−Ｆテスト二酸化的 ０＊ｍからの酸の生成（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法）
二〇ポリーβ−ヒドロキシ酪酸の蓄積ニー〇炭素化合物
の資化性（飯塚・駒形法）　：（作用） 本発明者らは、置換および非置換の縮合多環芳香族炭化
水素類を酸化的に資化する能力を有する本発明の細菌菌
株について、上記の菌学的性質に基づきバーシーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティｙり・バクテリオロジ−
（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）＋　Ｖｏｌ、
　ｌ　（１９８４）に記載の基準に従って公知の菌株と
の異同を検討した結果、シュードモナス・スツッチェリ
種に属する新規な菌株と認め、シュードモナス・スツッ
チェリ５Ａと命名した。この菌株は微工研菌寄第９１１
８号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託・保
管されている。

本発明の細菌菌株の培養に使用する培地は、この菌株が
良好に成育し、かつ原料となる芳香族化合物を基質とし
て十分に微生物反応を進行させるものであれば、いかな
る組成の培地であってもよく、また、菌体増殖用と反応
用に異なる２種類の培地を用いてもよい。

この時に用いる培地は、培地成分として、適当な炭素源
、窒素源および無機塩などを含有しうる。

炭素源としては、反応用の培地の場合、原料となる縮合
多環芳香族炭化水素化合物を単独で利用できる。所望に
より、さらに、本発明の菌株が利用できる任意の炭素源
を追加の炭素源として併用しうる。かかる追加の炭素源
として利用できる有機物には、上記の菌学的性質におい
て示したように、グリセリン、エタノールなどの有機化
合物、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、マロ
ン酸、クエン酸などの有機酸が挙げられる。追加の炭素
源として好適な有機化合物の例はグリセリンである０国
体増殖用の培地の場合には、縮合多環芳香族炭化水素化
合物に限らず、上述したような本発明の菌株が利用でき
る１種または２種以上の炭素化合物を任意に炭素源とし
て利用できる。

窒素源としては、特に限定されないが、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、およびペ
プトンなど有機窒素源が利用できる。有機窒素化合物を
用いる場合、これには炭素も含まれているので、別の炭
素源は増殖用培地の場合には必ずしも必要でない。

無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグネシウム
などが使用できる。さらに、微量の重金属塩（例、鉄塩
、マンガン塩など）を培地に含有させてもよい。

培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌培養法な
どの方法により行うことができる。培養温度は２５〜３
５℃、ｐＨは中性付近、培養日数は反応の進行に応じて
決めることができるが、通常は５〜１０日が適当である
。この時に、原料となる芳香族化合物は水に難溶性であ
るために、ポリオキシエチレンソルビタンなどの各種の
界面活性剤を培地に添加することも可能である。また、
必要に応じて、消泡剤を添加してもよい。

培養終了後、培養液からの目的物の分離・精製は、一般
の有機化合物の分離・精製と同様に行うことができる。

２，３−ジメチルナフタレンを基質とした場合の反応生
成物は、４．５−ジメチル−２−ヒドロキシ安息香酸で
あるが、これは次のような方法によって分離・精製でき
る。培養液から菌体を遠心分離によって除いた後、酸性
とし、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒によっ
て抽出する。得られた抽出液からカラムクロマトグラフ
ィーあるいは再結晶などの方法によって目的物を単離で
きる。その他の原料から得られた反応生成物の分離・精
製も、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、中和、濃
縮、結晶化などの当業者に周知の手段を適宜組合わせる
ことにより実施できる。

本発明によるシュードモナス・スツッチェリ種に属する
新規菌株は、後出の参考例に例示するように、ナフタレ
ン、２，３−ジメチルナフタレン、１−メチルナフタレ
ン、２−メチルナフタレン、フェナントレン、アントラ
センなどの本菌株が資化可能な非置換もしくはアルキル
置換縮合多環芳香族炭化水素化合物に酸化的に作用して
、開環および酸化反応により、環の一つ少ない１．２−
ヒドロキシ酸などのヒドロキシル基とカルボキシル基が
それぞれ芳香環の隣接炭素原子に結合した化合物に変喚
させることができる。上に列挙した縮合多環芳香族炭化
水素化合物を基質として本発明の菌株を培養した場合に
得られる生成物は、それぞれ、サリチル酸（０−ヒドロ
キシ安息香酸）、４．５−ジメチル−２−ヒドロキシ安
息香酸、３−メチル−２−ヒドロキシ安息香酸、４−メ
チル−２−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシ−２−
ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸である。

これらの芳香族ヒドロキシ酸は、医薬品、農薬、染料な
どの原料として有用である。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

災隻■土 茨城系鹿島で採取した土壌（約０．５　ｇ）を１０ｃｄ
の滅菌水に懸濁し、十分に攪拌した後、放置した。

得られた土壌懸濁液上清（１−）を、０６１％の２゜３
−ジメチルナフタレンを加えた下記組成のＳＮ培地から
なる分離用培地（５０ａＪ）に加え、３０℃で７日間振
盪培養した（集積培養１）、ＳＮ培地は、ｐＨ調節後に
濾過および滅菌してから使用した。

５下ｌ１ｌ（社）１店 硫酸アンモニウム　　　　　５ｇ リン酸水素２カリウム　　　２ｇ リン酸２水素ナトリウム　　２ｇ 硫酸マグネシウム・７水塩　０．１　ｇ硫酸第一鉄・７
水塩　　　　０．１ｇ 硫酸マンガン・７水塩　　　０．１ｇ 酵母エキス　　　　　　　１０　　ｍｇイオン六　　　
　　　　　　ｌ　！ Ｈ８ 集積培養！で得られた培養液の上滑（１−）を、０．１
％の２．３−ジメチルナフタレンおよび０．０１％のグ
リセリンを添加したＳＮ培地に加え、集積培養■と同様
の培養条件で培養した（集積培養■）この集積培養■で
得られた培養液の１白金耳を滅菌水で希釈した後、ＳＣ
Ｄ寒天培地（大五栄養■製）上に展開し、３０℃で２日
間培養した。生じたコロニーの形状・色合い等の外観を
目視により識別し、６種類の菌株を得た。これらの菌株
をそれぞれ集積培養■と同様の培地に植菌し、３０℃で
の培養を続けて２，３−ジメチルナフタレンに対する反
応性を検討し、この化合物を変換させる能力を有する磁
５菌を得た。Ｎ１１Ｌ５菌を肉汁培地で培養後、この培
養液の１白金耳を滅菌水で希釈してから、再度ＳＣＤ寒
天培地上に展開し、３０℃で２日間培養した。得られた
コロニーを観察することによって、２種類の菌株（５Ａ
および５Ｂ）を得た０両者の２．３−ジメチルナフタレ
ンに対する反応性の検討より、この化合物の変換能力を
有するＩｈ５Ａ菌を得た。この菌株を、上記のようにシ
ュードモナス・スツッチェリ５Ａと命名した。

次の参考例は、本発明の新規菌株の培養による酵素反応
の例を示すものである。

髪支斑上 本参考例は、本発明の菌株を利用した２、３−ジメチル
ナフタレンの４，５−ジメチル−２−ヒドロキシ安息香
酸への変換を例示する。

実施例１に示したＳＮ培地に０．０１％のグリセリンを
添加した菌体増殖用培地５０　ｃｄに、実施例１の方法
で得られたシュードモナス・スツッチェリ５Ａの菌株１
白金耳を接種し、３０℃で１夜培養した。得られた培養
液を３．５１の同様な培地を仕込んだ容ｉＩ５！のジャ
ー・ファーメンタ−に添加し、同時に基質として２，３
−ジメチルナフタレン０．２％を添加して培養を行った
。培養条件は、温度３０℃、ｐＨ７，６、攪拌数２０Ｏ
ｒｐｍ、通気Ｉｔ　１　ｖ／ｖ／Ｍであった。２．３−
ジメチルナフタレンの代謝産物は接種後７日目より急激
に増加したため、さらに１０日間の培養を続けた。

培養終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧下で１
００−に濃縮し、１００　ｄの酢酸エチルで３回抽出を
行った。酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、アセトン
：水の１：１混合溶媒により再結晶させて、３４５■の
精製物を得た。また、水層は塩酸によりｐＨ１とした後
、酢酸エチルにより上と同様に抽出処理し、蒸発乾固後
にＩＮ　ｌＩＣ２、エタノールの１：１混合溶媒より再
結晶させて、４０３■の結晶を得た。高速液体クロマト
グラフィー（＋（ＰＬＣ）分析において、この２種類の
生成物は同一物質であった。

得られた物質は、元素分析およびＮＭＲ測定によって、
４．５−ジメチル−２−ヒドロキシ安息香酸と確認され
た。

元素分析値（ＣＪ＋。０．） 計算値：　　Ｃ６５，０５％、Ｈ６，０６％実測値：Ｃ
６５，１５％、ＩＩ　６．１５％１３Ｃ−ＮＭＲ（単位
：ＰｐＨ％測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄｈ）メチル基：　　　
　　１８．３．１９．８カルボキシル基？　１７１．８ 芳香環：　　　　　１１０．０．１１７．６，１２７．
０，１３０．１゜１４５．３．１５９．３ １考■１ 本参考例は、本発明の菌株を利用したｌ−メチルナフタ
レンの３−メチル−２−ヒドロキシ安息香酸（３−メチ
ルサリチル酸）への変換を例示する。

実施例１に示したＳＮ培地に０．０５％のグリセリンを
添加した培地５０　ｃｄを使用し、シュードモナス・ス
ツソチェリ５Ａ菌株を３０℃で振盪培養した。

１夜培養後、基質として１−メチルナフタレン５０■を
添加し、酵素反応を開始した。基質添加後８日目に培養
液中の３−メチルサリチル酸の生成量は８３■／ｌであ
った。

培養液からの３−メチルサリチル酸の分離・精製は次の
ようにして行った。培養液を８０℃で３０分間熱処理し
た後、遠心分離によって菌体および変性タンパク質を除
去した。上滑に硫酸を加えてｐＨを１とした後、この酸
性溶液よりクロロホルムで３−メチルサリチル酸を抽出
分離し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を得
た。この粗結晶をｎ−ヘキサンより再結晶することによ
って白色針状結晶を得た。

得られた白色針状結晶は、元素分析および融点によって
３−メチルサリチル酸とｉｎ　認された。

元素分析値（ＣｓＨ＊Ｏｓ） 計算値：Ｃ６３，１５％、Ｉｆ　５．３０％実測値：　
Ｃ６３，２６％、Ｉ（５，２９％融点：１６７〜１６９
℃（文献値：１６７℃）豊考開１ 本参考例は、本発明の菌株を利用した２−メチルナフタ
レンの４−メチル−２−ヒドロキシ安息香酸（４−メチ
ルサリチル酸）への変換を例示する。

基質として２−メチルナフタレン５０■を使用して、参
考例２と同様の方法によりシュードモナス・スツッチェ
リ５Ａを培養し、酵素反応を実施した。基質添加後７日
目の培養液中の４−メチルサリチル酸の生成量は６１３
■／１であった。

生成物の分離・精製は参考例２と同様の方法により行い
、白色針状結晶を得た。得られた物質は、元素分析およ
び融点により、４−メチルサリチル酸と確認された。

元素分析値（ＣＪｓＯｓ） 計算値：　　Ｃ６３，１５％、Ｈ５，３（１％実測値：
　Ｃ６２，５１％、Ｈ５，３６％融点＝１７４〜１７６
℃（文献値：１７７℃）を支斑生 本参考例は、本発明の菌株を利用したフェナントレンの
１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換を例示する。

基質としてフェナントレン５０■を使用して、参考例２
と同様の方法によりシュードモナス・スツッチェリ５Ａ
を培養し、酵素反応を実施した。

基質添加後８日目の培養液中の１−ヒドロキシ−２−ナ
フトエ酸の生成量は１８３■／！であった。

生成物の分離・精製は参考例２と同様の方法により行い
、白色針状結晶を得た。得られた物質は、元素分析およ
びＮＭＲにより、ｌ−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と確
認された。

元素分析値（ＣＩＩＨ１０３） 計算値：　Ｃ７０，４５％、Ｈ４，１２％実測値：　Ｃ
６９，５０％、１１４．１５％”Ｃ−ＮＭＲ（単位：ｐ
Ｉ）１１％測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄｉ）カルボキシル基：
　１７２．８ 芳香環！　　　　　１６０．２，１３６．６，１２９．
４，１２７．６゜１２５．９．１２４．８．１２４．０
．１２２．９゜１１８．３．１０５．９ 奎考■工 本参考例は、本発明の菌株を利用したアントラセンの３
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換を例示する。

基質としてアントラセン５０■を使用して、参考例２と
同様の方法によりシュードモナス・スツッチェリ５Ａを
培養し、酵素反応を実施した。基質添加後８日目の培養
液中の３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成量は２３
■／ｌであった。

次に示す高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）お
よび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析の結果から
、この酵素酸化反応の生成物は３−ヒドロキシ−２−ナ
フトエ酸であることが確認された。

ＨＰＬＣ（ｔ＋＋）　　　８，８３　　　　　　８．８
４ＴＬＣ＊（Ｒｒ）　　０．０６（０，２４）Ｆ　　　
Ｏ，０６（０，２４）Ｆ本参考例は、本発明の菌株を利
用したナフタレンの０−ヒドロキシ安息香酸（サリチル
酸）への変換を例示する。

基質としてナフタレン５０■を使用して、参考例２と同
様の方法によりシュードモナス・スツッチェリ５Ａを培
養し、酵素反応を実施した。基質添加後７日目の培養液
中のサリチル酸の生成量は、ＨＰＬＣ分析の結果、３８
０■／βであった。

（発明の効果） 本発明による新規微生物、シュードモナス・スツッチェ
リ５Ａ菌株は、上に例示したように、非置換ナフタレン
のみならず、従来は酵素反応を受けさせにくかったメチ
ル置換などのアルキル置換ナフタレンや縮合３環芳香族
化合物（フェナントレン、アントラセン）を基質として
培養することができ、それにより、従来は高温・高圧下
で化学的に合成されていた医農薬品、染料などの原料と
して有用な各種の芳香族ヒドロキシ酸を、経済的な微生
物酸化作用により生産することが可能となる。

また、上記の基質はコールタールに含まれる成分である
ので、本発明によりコールタール成分の有効利用も図ら
れる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュードモナス・スツッチェリ種に属する細菌菌株であ
   って、非置換およびアルキル置換縮合多環芳香族炭化水
   素化合物を酸化的に資化する能力を有する、微工研菌寄
   第９１１８号として寄託された新規菌株シュードモナス
   ・スツッチェリ５Ａ菌。