JPH0378104B2

JPH0378104B2 -

Info

Publication number: JPH0378104B2
Application number: JP5365083A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Inoe; Yoshiharu Kimura; Tomokazu Sato
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1983-03-31
Filing date: 1983-03-31
Publication date: 1991-12-12
Also published as: JPS6047677A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はノカルデイア属に属する新規な微生物
に関する。ジカルボン酸は合成樹脂、高級潤滑油、可塑
剤、香料等の製造原料として有用な物質である
が、合成法により製造されていたジカルボン酸は
炭素数にも限度があり、炭素数12個以上のジカル
ボン酸を製造することは困難であつた。そこで近
年、微生物を利用した発酵法によるジカルボン酸
の製造法が注目されてきた。従来、微生物によるジカルボン酸の製造法とし
てはキヤンデイダ（Candida）属（特公昭50−
19630号等）、ピキア（Pichia）属（特公昭45−
24392号等）等の酵母によるものが多く、細菌に
よるものではコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属（特公昭56−17075号等）
しか見出されていなかつた。そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑み、ノ
ルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を対
応するジカルボン酸に変換する能力を有する菌を
自然界より広く検索した結果、ノカルデイア
（Nocardia）属に属する微生物の中に斯かる能力
を有するものがあることを見出し、本発明を完成
した。すなわち、本発明はノカルデイア属に属し、ノ
ルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を資
化してジカルボン酸を生産する能力を有する新規
なノカルデイア・エスピー・KSM−Ｂ−21（微工
研菌寄第7006号）に関するものである。次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌
学的性質を詳述する。 (a) 形態若い細胞は、菌糸状に育成し分枝が観察され
る。菌糸は培養の進行に従つて球菌状あるいは
桿菌状に分断する。菌糸の直径は1.5μ (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース．硝酸塩寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。にぶい光沢があ
る。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。にぶい光沢があ
る。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。但し、光沢はな
い。 (4) スターチ寒天培地：：生育は貧弱であり、コロニーの色は白色で
ある。光沢がなく、乾いた感じのコロニーで
ある。 (5) チロシン寒天培地：育成は中程度であり、コロニーの色は肌色
ないし淡オレンジ色である。にぶい光沢があ
る。 (6) 栄養寒天培地：生育は豊富であり、コロニーの色は肌色な
いしうすピンク色である。光沢がある。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、コロニーの色はピ
ンク色ないしうすオレンジ色である。光沢は
にぶい。 (8) オートミール寒天培地：育成は中程度であり、コロニーの色は白
色。コロニーは、光沢がある。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度16〜38℃（最適27〜34℃） PH5.0〜9.2（最適6.0〜8.3） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：＋イノシトール：＋Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニツト：＋ (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：− （ガスは生成しない）ソルビトール：− （ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso−DAP 糖：アラビノース、ガラクトース (g) ５−フルオロウラシル耐性（40mg／18）：耐
性あり (h) 分離源：土壌以上の菌学的性質を有する菌についてバージエ
イのマニユアル（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology）第８版（1975年）
に基づいて検索した結果、本菌株はノカルデイア
（Nocardia）属に属する新菌株と認め、ノカルデ
イア・エスピー・KSM−Ｂ−21（Nocardiasp.
KSM−Ｂ−20）と命名した。なお、本菌株は、
微工研菌寄第7006号として工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパ
ラフイン含有培地を用い常法で行なつた。本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用す
る菌株が良好に生育し、ノルマルパラフイン、脂
肪酸又は脂肪酸誘導体からのジカルボン酸の生産
を順調に行なわしめるために適当な炭素源、窒素
源あるいは有機栄養源、無機塩などからなる。炭
素源としては、炭水化物（例えば、グルコース、
フラクトース、シユクロース、マンニトール等）、
有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸、脂肪酸及
びそのエステル等）、炭化水素（例えば、ｎ−ド
デカン、ｎ−ヘキサデカン等）など資化されるも
のならばいずれも使用できる。また、窒素源ある
いは有機栄養源としては、例えば、硝酸ナトリウ
ム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩
類、酵母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられ
る。また、無機塩としては各種リン酸塩、硫酸マ
グネシウムなどが使用できる。さらに微量の重金
属塩類が使用されるが、天然物を含む培地では必
ずしも添加を必要としない。また栄養要求を必要
とする変異株を用いる場合には、その栄養要求を
満たす物質を培地に添加しなければならない。培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種
し、28〜35℃で３〜５日振盪又は通気撹拌すれば
良い。PHは6.5〜８程度に調整すると良い結果が
得られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合
には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界
面活性剤を培地に添加することも可能である。叙上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液より
分離する場合は、通常の固液分離手段が用いられ
る。このように分離された生菌体及びその処理物
（凍結乾燥菌体等）も酵素源としてもちいること
ができる。ノルマルパラフイン、脂肪酸又は脂肪酸誘導体
を反応基質として本菌株を上記の如く培養すると
ジカルボン酸が生産される。該基質は炭素数６〜
22のものが適当であり、脂肪酸誘導体としては脂
肪酸の低級アルキルエステルが好ましい。これらの培養液から目的物質であるジカルボン
酸の採取および精製は、一般の有機化合物の採取
および精製の手段に準じて行うことができる。た
とえば培養液から菌体等を除去したろ液もしくは
培養液そのものを酸性とし、エチルエーテル、酢
酸エチル又はクロロホルム−メタノール混液等の
有機溶媒で抽出する。この抽出物をカラムクロマ
トグラフイーあるいは再結晶などの方法を用いて
ジカルボン酸を単離することができる。以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１採取した土壌サンプル約0.5ｇを滅菌水10mlに
懸濁し充分撹拌後、この土壌懸濁液0.2mlを下記
組成の液体培地（）10ml（50ml容試験管にて）
接種し、30℃にて４日間振盪培養を行なう。

【表】上記培養により増殖を示した培養液は、滅菌水
により適度に希釈した後、肉汁寒天培地（栄研化
学製；普通寒天培地）に移し、30℃にて２日間培
養し、生じた複数のコロニーが相互間に相異しな
いことを肉眼的及び顕微鏡的に確認できるまで、
肉汁寒天培地への移植を繰り返す。上記コロニーのうち10個のコロニーをそれぞれ
下記組成の斜面寒天培地（）に接種し、30℃で
３日間培養し、10本の斜面培地上の菌株が肉眼的
及び顕微鏡的に同一菌株であることを確認し、ま
た、これら10菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質が同一であることを確認した。

【表】

【表】上記菌株の培地上の性状及び生理学的性質は前
述した通りである。上記試験の結果、各10本の培
養菌はすべて自然界より純粋に分離された単一菌
株であることが判る。次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株から一白金耳を、滅菌した10％グリセリン水溶
液（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに懸濁
し、−80℃にて凍結保存する。かくして３ケ月凍
結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金
耳を肉汁寒天培地に蘇生後、前記と同条件下に各
培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果、
凍結前とは変化が認められなかつた。また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り
返した菌株について同様に、各培地上での性状及
び生理学的性質を調べた結果、変化は認められな
かつた。次いで、本菌株を利用してジカルボン酸を製造
した例を参考例として挙げる。参考例１パルミチン酸メチル50ｇ、リン酸二アンモニウ
ム10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウ
ム（７水塩）0.2ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）0.02
ｇ、硫酸亜鉛（７水塩）0.016ｇ、硫酸マンガン
（４〜６水塩）0.016ｇ、酵母エキス２ｇを水道水
１に溶かしPHを7.0に調製した。この液体培地
５mlを50ml容振盪試験官に仕込み、120℃で15分
間蒸気滅菌した後、ノカルデイア・エスピー・
KSM−Ｂ−21（Nocardia・sp.KSM−Ｂ−21）
を一白金耳接種し、30℃で96時間振盪培養した。培養終了後、この培養液に9N硫酸１mlを加え
PHを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：１）混液20mlで抽出した。この抽出液を減
圧下濃縮した後メタノール−BF₃触媒でメチル化
し、ガスクロマトグラフイーにて生成物の定量を
行なつた。その結果を第１表に示す。なお生成物はガス−マス（GC−MS）により
α、ω−テトラデカンジカルボン酸であることが
確認された。図１にα、ω−テトラデカンジカル
ボン酸のジメチルエステル（測定にあたつてエス
テル化したもの）のマスパターンを示した。

【表】【図面の簡単な説明】

図１は本発明の参考例１の生成物および標準物
質のマスパターンの概略図である。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の性質を有する微工研菌寄第7006号とし
て寄託された新規なノカルデイア・エスピー・
KSM−Ｂ−21株。 (a) 形態若い細胞は、菌糸状に育成し分枝が観察され
る。菌糸は培養の進行に従つて球菌状あるいは
桿菌状に分断する。菌糸の直径は1.5μ (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース．硝酸塩寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。にぶい光沢があ
る。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。にぶい光沢があ
る。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は白色
ないしクリーム色である。但し、光沢はな
い。 (4) スターチ寒天培地：：生育は貧弱であり、コロニーの色は白色で
ある。光沢がなく、乾いた感じのコロニーで
ある。 (5) チロシン寒天培地：育成は中程度であり、コロニーの色は肌色
ないし淡オレンジ色である。にぶい光沢があ
る。 (6) 栄養寒天培地：生育は豊富であり、コロニーの色は肌色な
いしうすピンク色である。光沢がある。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、コロニーの色はピ
ンク色ないしうすオレンジ色である。光沢は
にぶい。 (8) オートミール寒天培地：育成は中程度であり、コロニーの色は白
色。コロニーは、光沢がある。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度16〜38℃（最適27〜34℃） PH5.0〜9.2（最適6.0〜8.3） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：＋イノシトール：＋Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニツト：＋ (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：− （ガスは生成しない）ソルビトール：− （ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso−DAP 糖：アラビノース、ガラクトース (g) ５−フルオロウラシル耐性（40mg／18）：耐
性あり