JPH0378101B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はミクロコツカス属に属する新規な微生
物に関する。 従来、脂肪酸のω−末端のみを選択的に酸化す
ることは工業的には困難とされてきた。例えば、
ラクトン系ムスク（じや香合成香料）の主成分で
あるヘキサデカノライドの製造にはω−ヒドロキ
シパルミチン酸が使用されるが、ムスクが高価で
あるのは、この前駆体たるω−ヒドロキシパルミ
チン酸の製造が困難なことに起因する。即ち、パ
ルミチン酸のω−末端を選択的に酸化してω−ヒ
ドロキシパルミチン酸とすることは、合成化学上
困難である。 一方、微生物にノルマルパラフインを資化させ
てジカルボン酸を製造する際に副産物としてω−
ヒドロキシ高級脂肪酸も得られることが報告され
ている（例えば特公昭48−26238号）このように
ω−ヒドロキシ高級脂肪酸はノルマンパラフイン
のアルカン資化性菌によるジカルボン酸への代謝
中間体であるが、その著量生産は困難とされてい
る。その理由としてはω−ヒドロキシ高級脂肪酸
の生成速度に比べて、そのジカルボン酸への転化
速度の方がずつと大きいためと推測される。 また、ω−ヒドロキシ脂肪酸と同様にラクトン
系ムスクの主成分である大環状ラクトンの有用な
中間体としてはω−ハロカルボン酸がある。ω−
ハロカルボン酸はハロゲンに官能基を導入するこ
とにより種々の誘導体にも導びくこともできる。
このω−ハロカルボン酸に関しては、アルスロバ
クター属、コリネバクテリウム属、ノカルデイア
属に属し、アルキルハライドからω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する菌を培養し、ω−ハ
ロカルボン酸を生産する方法が報告されている
（特開昭57−50893号）。 そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑みアル
キル（又はアルケニル）ハライドを対応するω−
ハロカルボン酸に変換する能力を有する菌を自然
界より広く検索した結果、ミクロコツカス属に属
する微生物中に斯かる能力を有するものがあるこ
とを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明はミクロコツカス属に属し、
アルキル（又はアルケニル）ハライドを資化して
ω−ハロカルボン酸を生産する能力を有する新規
なミクロコツカス・エスピー・KSM−Ｂ−８（微
工研菌寄第7003号）に関するものである。 次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌
学的性質を詳述する。 (a) 形態 (1) 細胞の形および大きさ：球菌、直径 0.8
〜1.2μ (2) 集団：不規則連鎖及び戻状は認められない (3) 運動性：なし (4) 胞子：形成しない (5) グラム染色性：陽性 (6) 抗酸性：ほとんど認められない (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。う
す緑色で光沢を有し、凸円状 (2) 肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落
を生ずる。うす緑色の光沢を有す。 (3) 肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿
を生じない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する (5) リトマスミルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しな
い。リトマスの還元はない。 (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：還元しない (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成（TSI寒天）：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用 Koserの培地：わずかに利用する Christensenの培地：利用する (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陰性 (10)色素の生成：水溶性の緑色の色素 (11) ウレアーゼ Christensen培地：陰性 SSR培地：弱陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲： 14〜42℃（最適 28〜35℃） PH5.0〜9.5（最適6.5〜8.0） (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OFテスト：陰性 (17) 糖類からの酸、ガスの生成： Ｌ−アラビノース ：− Ｄ−キシロース ：− Ｄ−グルコース ：− Ｄ−マンノース ：− Ｄ−フラクトース ：− Ｄ−ガラクトース ：− 麦芽糖 ：− シヨ糖 ：− 乳 糖 ：− トレハロース ：− Ｄ−ソルビツト ：− Ｄ−マンニツト ：− イノシツト ：− グリセリン ：− デンプン ：− (18) ５％塩化ナトリウム耐性：生育する (19) 採集地：沖縄県石垣島平久保町の土壌か
ら分離 以上の菌学的性質を有する菌についてバージエ
イのマニユアル（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology）第８版（1975年）
に基づいて検索した結果、本菌株はミクロコツカ
ス（Micrococcus）属に属する新菌株と認め、ミ
クロコツカス・エスピー・KSM−Ｂ−８
（Micrococcus sp.KSM−Ｂ−８）と命名した。
なお、本菌株は、微工研菌寄第7003号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 分離源の土壌からの本菌株の分離はノルマルパ
ラフイン含有培地を用い常法で行なつた。 本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用す
る菌株が良好に生育し、アルキル（又はアルケニ
ル）ハライドからのω−ハロカルボン酸の生産を
順調に行なわしめるために適当な炭素源、窒素源
あるいは有機栄養源、無機塩などからなる。炭素
源としては、炭水化物（例えば、グルコース、フ
ラクトース、シユクロース、ソルビトール等）、
有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸等）、炭化
水素（例えば、ｎ−ドデカン、ｎ−ヘキサデカン
等）、アルキル（又はアルケニル）ハライドなど
資化されるものならばいずれも使用できる。ま
た、窒素源あるいは有機栄養源としては、例え
ば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモ
ニウム等の硝酸塩類、酵母エキス、肉エキス、ペ
プトンが挙げられる。また、無機塩としては各種
リン酸塩、硫酸マグネシウムなどが使用できる。
さらに微量の重金属塩類が使用されるが、天然物
を含む培地では必ずしも添加を必要としない。ま
た栄養要求を必要とする変異株を用いる場合に
は、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しな
ければならない。 培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種
し、28〜35℃で３〜５日振盪又は通気撹拌すれば
良い。PHは6.5〜８程度に調整すると良い結果が
得られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合
には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界
面活性剤を培地に添加することも可能である。 叙上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液より
分離する場合は、通常の固液分離手段が用いられ
る。このように分離された生菌体及びその処理物
（凍結乾燥菌体等）も酵素源としても用ちいるこ
とができる。 アルキル（又はアルケニル）ハライドを反応基
質として本菌株を上記の如く培養するとω−ハロ
カルボン酸が生産される。これらの培養液から目
的物質であるω−ハロカルボン酸の採取および精
製は、一般の有機化合物の採取および精製の手段
に準じて行うことができる。たとえば培養液から
菌体等を除去したろ液もしくは培養液そのものを
酸性とし、エチルエーテル、酢酸エチル又はクロ
ロホルム−メタノール混液等の有機溶媒で抽出す
る。この抽出物をカラムクロマトグラフイーある
いは再結晶などの方法を用いてω−ハロカルボン
酸を単離することができる。 以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ 採取した土壌及び土壌付着の落葉落枝の小スパ
ーテル１杯分（約0.5ｇ）を10ml滅菌水に懸濁し、
充分撹拌した後放置する。かくして得られる土壌
懸濁液上清の100倍希釈液0.1mlを下記組成のｎ−
ヘキサデカン含有の分離用寒天培地（）に直接
移し、30℃にて５日間培養する。

【表】 上記分離用寒天培地（）の調製法は、寒天と
それ以外の培地成分を別滅菌し、60℃付近に冷却
後両者を混合し、ダイナミツクシエーカーで充分
撹拌、乳化させた後、滅菌シヤーレに分注するも
のである。 上記培養により発生するコロニーの一白金耳を
滅菌水で100倍希釈し、この希釈液0.1mlを下述の
分離用寒天培地（）に移し、30℃にて３日間培
養し、生じた複数のコロニーが相互間に相異しな
いことを肉眼的及び顕微鏡的に確認する。なお、
分離用寒天培地（）は、分離用寒天培地（）
の組成よりｎ−ヘキサデカンとポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウリン酸エステルを除いた寒
天培地の底にｎ−ヘキサデカンを含浸させたろ紙
を敷いてｎ−ヘキサデカンを供給させたものであ
る。 上記コロニーのうち10個のコロニーをそれぞれ
分離用寒天培地（）と同組成の斜面寒天培地に
接種し、30℃で３日間培養し、10本の斜面倍地上
の菌株が肉眼的及び顕微鏡的に同一菌株であるこ
とを確認し、また、これら10菌株の各培地上の性
状及び生理学的性質が同一であることを確認し
た。上記菌株の各培地上の性状及び生理学的性質
は前述した通りである。 上記試験の結果、各10本の培養菌はすべて自然
界より純粋に分離された単一菌株であることが判
る。 次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株より一白金耳を滅菌した10％グリセリン水溶液
（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに懸濁し、−
80℃にて凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存
後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金耳を普
通寒天培地に蘇生後前記と同条件下に各培地上で
の性状及び生理学的性質を調べた結果、凍結前と
は変化が認められなかつた。 また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り
返した菌株について同様に、各培地上での性状及
び生理学的性質を調べた結果変化は認められなか
つた。 次いで、本菌株を利用してω−ハロカルボン酸
を製造した例を参考例として挙げる。 参考例 １ セチルクロライド50ｇ、リン酸二アンモニウム
10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム
（７水塩）0.2ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）0.02ｇ、
硫酸亜鉛（７水塩）、0.016ｇ、硫酸マンガン（４
〜６水塩）0.016ｇ、酵母エキス２ｇを水道水１
に溶かしPHを7.0に調製した。この液体培地５
mlを50ml容振盪試験管に仕込み、120℃で15分間
蒸気滅菌した後、ミクロコツカス・エスピー・
KSM−Ｂ−８（Micrococcus sp.KSM−Ｂ−８）
を一白金耳接種し、30℃で96時間振盪培養した。 培養終了後、この培養液に9N硫酸１mlを加え
PHを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：１）混液20mlで抽出した。この抽出液を減
圧下濃縮した後メタノール−BF₃触媒でメチル化
し、ガスクロマトグラフイーにて生成物のω−ク
ロルパルミチン酸の定量を行なつた。その結果を
第１表に示す。 なお、生成物はガス−マス（GC−MS）によ
りω−クロルパルミチン酸であることが確認され
た。図１にω−クロルパルミチン酸のメチルエス
テル（測定にあたつてエステル化したもの）のマ
スパターンを示した。

【表】 【図面の簡単な説明】

図１は本発明の参考例１の生成物および標準物
質のマスパターンの概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の性質を有する微工研菌寄第7003号とし
   て寄託された新規なミクロコツカス・エスピー・
   KSM−Ｂ−８株。 (a) 形態 (1) 細胞の形および大きさ：球菌、直径 0.8
   〜1.2μ (2) 集団：不規則連鎖及び戻状は認められない (3) 運動性：なし (4) 胞子：形成しない (5) グラム染色性：陽性 (6) 抗酸性：ほとんど認められない (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。う
   す緑色で光沢を有し、凸円状 (2) 肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落
   を生ずる。うす緑色の光沢を有す。 (3) 肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿
   を生じない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する (5) リトマスミルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しな
   い。リトマスの還元はない。 (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：還元しない (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成（TSI寒天）：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用 Koserの培地：わずかに利用する Christensenの培地：利用する (9) 無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陰性 (10) 色素の生成：水溶性の緑色の色素 (11) ウレアーゼ Christensen培地：陰性 SSR培地：弱陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲： 14〜42℃（最適 28〜35℃） PH5.0〜9.5（最適6.5〜8.0） (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OFテスト：陰性 (17) 糖類からの酸、ガスの生成： Ｌ−アラビノース ：− Ｄ−キシロース ：− Ｄ−グルコース ：− Ｄ−マンノース ：− Ｄ−フラクトース ：− Ｄ−ガラクトース ：− 麦芽糖 ：− シヨ糖 ：− 乳 糖 ：− トレハロース ：− Ｄ−ソルビツト ：− Ｄ−マンニツト ：− イノシツト ：− グリセリン ：− デンプン ：− (18) ５％塩化ナトリウム耐性：生育する。