JPH04278096A - ３−ケトー７β−ヒドロキシコラン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウルソデオキシコール
酸から血糖低下作用、コレステロール低下作用、胆石生
成抑制作用を有し（特公昭６３−１９５７号）、また肝
臓疾患治療剤として有用（特開昭６２−６１９２０号）
な３β，７β−ジヒドロキシコラン酸の製造中間体であ
る３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸を生産する微生
物、及び該微生物を使用して３−ケト−７β−ヒドロキ
シコラン酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、３−ケト−７β−ヒドロキシコラ
ン酸を製造する方法として、ウルソデオキシコール酸の
３位のα−ヒドロキシル基を選択的に酸化する方法が知
られている（特公昭６３−１９５７号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この製
造方法は４工程からなり、各工程ごとに精製の必要があ
る点、また各工程の反応性及び選択性に問題があり、収
率や得られる製品の純度の点で満足できるものではなか
った。

【０００４】［課題を解決するための手段】本発明者ら
は、かかる現状に鑑み、微生物を用いて直接的にウルソ
デオキシコール酸から３−ケト−７β−ドロキシコラン
酸を製造する方法について鋭意研究を進めた結果、バチ
ルス属に属する新規微生物が３−ケト−７β−ヒドロキ
シコラン酸生産能を有することを発見し、本発明を完成
した。

【０００５】即ち、本発明によれば、バチルス属に属す
る３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸生産能を有する
微生物をウルソデオキシコール酸を含む栄養培地で培養
し、培養物中に３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸を
生成させ、これを採取することからなる３−ケト−７β
−ヒドロキシコラン酸の製造方法が提供される。

【０００６】本発明者らは、栃木県足利市内の土壌より
ウルソデオキシコ−ル酸を含む培地で３−ケト−７β−
ヒドロキシコラン酸を生産する能力を有する菌を分離し
、この菌株をバチルス・エスピーＴＴＵＲ１−１（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．ＴＴＵＲ１−１）と命名、平成
２年１１月２２日工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託（微工研菌寄第１１８６０号）した。

【０００７】土壌中からの菌の分離は次の方法によった
。

【０００８】土壌を５％のコール酸ナトリウムを含むホ
リコシ培地Ｉ〔グルコース１％、イ−スト・エキス０．
５％、リン酸一水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物０．０２％、炭酸ナトリウム１％、ｐＨ１
０〕に少量懸濁し、３０℃、５日間集積培養を行い、得
られた培養液の１白金耳量を５％のコ−ル酸ナトリウム
を含むホリコシ培地Ｉ寒天平板に画線培養し、菌株を純
粋分離した。これらの菌株を、各々５％のウルソデオキ
シコール酸ナトリウムを含むホリコシ培地Ｉで３０℃、
２日間培養し、その培養液中の３−ケト−７β−ヒドロ
キシコラン酸の定量を行い、３−ケト−７β−ヒドロキ
シコラン酸の変換能の高い菌株を得た。

【０００９】この菌の菌学的性質は以下の通りであり、
これらの試験及び分類方法は「バージエーズ・マニュア
ル・オブ・システマティックバクテオロジ−（ＢＥＲＧ
ＥＹ’Ｓ　　ＭＡＮＹＵＡＬ　　ＯＦ　　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」に準拠して
行ったものであり、特に記載のない限り、全て炭酸ナト
リウムを添加し、ｐＨを１０に調整した培地を使用した
。

【００１０】 ＴＴＵＲ１−１菌の菌学的性質 （１）形態 　　　　形態　　　　　　　　　　桿菌　　　　大きさ
　　　　　　　　０．３〜０．５×１．５〜３．０μ　
　　　鞭毛　　　　　　　　　　あり　　　　胞子　　
　　　　　　　　あり（卵型、細胞の末端に形成。胞子
嚢は膨潤する。）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．４〜０．７×０．８〜１．２μ　　　　グラム染
色　　　　変化 　　　　抗酸性　　　　　　　　なし

【００１１】（２）各培地における生育

【００１２】（
３）生理学的性質

【表１】

【００１３】以上の検索の結果、ＴＴＵＲ１−１菌は好
気性の有胞子細菌であることから、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属に属する微生物であることは明らかである
。しかしながら、生育の為の至適ｐＨが１０前後のアル
カリ側に存在することから一般のバチルス属微生物とは
異なる。

【００１４】また、好アルカリ性のバチルス属微生物と
して知られるバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ａｌｃａｌｏｐｈｙｌｕｓ）及びバチルス・
アルカロフィルス・サブスピーシス・ハロデュランス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｌｃａｌｏｐｈｙｌｕｓ　　ｓ
ｕｂｓｐ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）と比較して、表２に
示したような相違を認めた。特にコロニ−の形状、コロ
ニ−周辺の様子において顕著に異なっていた。

【００１５】一方、自然界より分離された好アルカリ性
バチルス属微生物のほとんどが、コロニー形状及び周辺
の様子において円形、全縁という性質を示し、ＴＴＵＲ
１−１菌の示す性質とは一致しない。

【００１６】好アルカリ性でコロニ−が不規則、かつ周
辺が裂片状の菌株としてバチルス・セレウス８−１菌（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ　　８−１，ＦＥＲ
Ｍ２８８５，特公昭５３−１３７０８号）及びバチルス
・アルカロフィルス２０２−１菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
　ａｌｃａｌｏｐｈｙｌｕｓ　　２０２−１，ＦＥＲＭ
２６７４，特公昭５３−２７７８６号）が報告されてい
るが、それらの菌とも表２に示した相違点を認めた。

【００１７】

【表２】

【００１８】従って、本菌は好気性の有胞子細菌である
が、上記の通り種々の菌学的性質、特に生育の為の至適
ｐＨが１０付近のアルカリ性側に存在し公知の菌種とは
区別されることから、本菌を新菌種として設定すること
が適当である。

【００１９】本発明によれば、バチルス属に属する３−
ケト−７β−ヒドロキシコラン酸生産能を有する微生物
をウルソデオキシコール酸を含む栄養培地で培養するこ
とにより、３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸を生成
させることができる。栄養培地中のウルソデオキシコー
ル酸濃度には、特に限定はないが、目的３−ケト−７β
−ヒドロキシコラン酸の収量、培養条件から５〜５００
ｇ／ｌ、好ましくは４０〜３００ｇ／ｌの濃度とする。

【００２０】本発明において使用することができる培地
としては、前記微生物が培養により増殖し得るものであ
れば任意のものでよく、例えば炭素源としては、グルコ
ース、フラクトース、マルトース、シュクロース、グリ
セリン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒
素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ンスティープリカー、大豆粉、菜種油粕等の有機窒素、
硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム
等の無機窒素を用いることができる。また、この他、微
量の無機金属塩類、ビタミン類、生長促進因子等を添加
することが好ましい。

【００２１】本発明方法における培養は好気的条件下に
、例えば通気攪拌や往復振盪方法によって培養すること
ができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的にい
えば、温度２０〜４０℃、ｐＨ７〜１１、１〜６日間程
度の条件で実施する。

【００２２】培養液からの目的の３−ケト−７β−ヒド
ロキシコラン酸の採取方法は通常の方法に従って行うこ
とができる。例えば、培養液を遠心分離後、上清を希塩
酸又は希硫酸で酸性にし、析出した生成物を再結晶する
方法があげられる。

【００２３】

【実施例】以下に本発明を実施例をもって説明するが、
本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものでない
ことはいうまでもない。

【００２４】生成物の同定は以下の条件による高速液体
クロマトグラフィ−により行った。 カラム；カプセルパックＣ１８カラム（タイプＡＧ１２
０，Ｓ−５μｍ，カラムサイズ４．６φ×１５０ｍｍ，
資生堂製） 移動相；メタノール／精製水／リン酸（６５／３５／０
．０２Ｍ重量比） 流速；１．７ｍｌ／ｍｉｎ 検出；ＲＩ

【００２５】〔実施例１〕グルコース１０ｇ、ペプトン
５ｇ、イースト・エキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇを精製水５０
０ｍｌに溶解し、またウルソデオキシコール酸５０ｇ、
水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナトリウム１０ｇを精製水
５００ｍｌに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間滅菌
した。冷却後混合し、培地とした（ｐＨ１０）。

【００２６】この培地２０ｍｌを試験管（３φ×１９ｃ
ｍ）に分注後、あらかじめ上記培地からウルソデオキシ
コール酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地
２０ｍｌ入りの試験管で３０℃、２０時間振盪培養して
増殖させた菌液０．１ｍｌを無菌的に接種した。その後
３０℃で６日間振盪培養した。

【００２７】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を添加して酸性にすると、３−ケト
−７β−ヒドロキシコラン酸及び未変換のウルソデオキ
シコール酸が沈澱した。この沈澱物を採取し、乾燥して
白色粉末０．９８ｇを得た。この一部をとり、高速液体
クロマトグラフィーにより、３−ケト−７β−ヒドロキ
シコラン酸とウルソデオキシコール酸の生成比率を求め
たところ、３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸７９．
５％、ウルソデオキシコール酸２０．５％であった。混
合物をメタノールから再結晶して、純粋な３−ケト−７
β−ヒドロキシコラン酸を得た。

【００２８】〔実施例２〕実施例１の振盪培養を３日間
とした以外は、実施例１と同様に操作した。３−ケト−
７β−ヒドロキシコラン酸とウルソデオキシコール酸の
生成比率は、３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸５６
．６％、ウルソデオキシコール酸４３．４％であった。

【００２９】〔実施例３〕実施例１のウルソデオキシコ
ール酸を１５０ｇ、水酸化ナトリウムを１５ｇとした以
外は、実施例１と同様に操作した。３−ケト−７β−ヒ
ドロキシコラン酸とウルソデオキシコール酸の生成比率
は、３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸５２．６％、
ウルソデオキシコール酸４７．４％であった。

【００３０】〔実施例４〕グルコース１０ｇ、ペプトン
５ｇ、イ−スト・エキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇを精製水５０
０ｍｌに溶解し、またウルソデオキシコール酸１００ｇ
、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭酸ナトリウム１０ｇを精
製水５００ｍｌに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間
滅菌した。冷却後混合し、培地とした（ｐＨ１０）。

【００３１】この培地１００ｍｌを坂口フラスコ（５０
０ｍｌ容）に分注後、あらかじめ上記培地からウルソデ
オキシコ−ル酸及び水酸化ナトリウムを除いた同一組成
の培地２０ｍｌ入りの試験管（３φ×１９ｃｍ）で３０
℃、２０時間振盪培養して増殖させた菌液０．１ｍｌを
無菌的に接種した。その後３０℃で４日間振盪培養した
。

【００３２】以下実施例と同様に処理して粗製の３−ケ
ト−７β−ヒドロキシコラン酸を得た。３−ケト−７β
−ヒドロキシコラン酸とウルソデオキシコール酸の生成
比率は、３−ケト−７β−ヒドロキシコラン酸６４．２
％、ウルソデオキシコール酸３５．８％であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　　　バチルス属に属し３−ケト−７β
   −ヒドロキシコラン酸生産能を有するバチルス・エスピ
   ーＴＴＵＲ１−１。
2. 【請求項２】　　　　バチルス属に属し３−ケト−７β
   −ヒドロキシコラン酸生産能を有する微生物をウルソデ
   オキシコール酸を含む栄養培地で培養して培養物中に３
   −ケト−７β−ヒドロキシコラン酸を生成せしめ、これ
   を採取することを特徴とする３−ケト−７β−ヒドロキ
   シコラン酸の製造方法。