JPS6349097A

JPS6349097A - イプシロン−ポリ−ｌ−リシンの製造法

Info

Publication number: JPS6349097A
Application number: JP19215886A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Morita; 裕森田; Jun Hiraki; 純平木
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1986-08-19
Filing date: 1986-08-19
Publication date: 1988-03-01
Also published as: JPH0342075B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はイプシロン−ポリ−Ｌ−リシン（以下εＰＬと
略記する）の製造法に関する。

（従来の技術とその問題点） εＰＬは以下の構造式で表されるように、Ｌ−リシンの
ε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リシンのカルボン酸と
アミド結合で結合した高分子化合物である。

当該物質は必須アミノ酸であるＬ−リシンのポリマーで
あるので安全性が高くかつカチオン含量が高いので特異
な物性を有する。従って、それらの性質を利用してトイ
レタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品
添加物、電子材料等の用途が期待できる。

従来、当該物質はストレプトマイセス属に属するεＰＬ
産生菌であるストレプトマイセス・アルプラス・サブス
ピーシーズ・リジノボリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ　５ｕｂｓｐ、　Ｉｙｓｉｎｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｕｓ）１１ｋＬ３４６−Ｄ株（微工研菌寄
第３８３４号）を培、地に培養して、得られる培養物か
ら分離精製して得られている（特公昭５９−２０３５９
号）。

しかし、この先願の菌株では培養液１１当りせいぜい０
．５ｇ程度のεＰＬの生産性しかなく、従って生産コス
トが高く、当該物質の広範な利用が妨げられていた。

本発明者らは、εＰＬを著量に生産する株を得、これを
用いてεＰＬを多量に製造する方法を提供することを目
的として研究を重ね、以下に述べる発明に到達した。

（問題点を解決するための手段）本発明はεＰＬを産生ずる菌株を変異処理して得られる
変異株を、Ｌ−リシンまたはＬ−リシンと冬唐類を添加
した培地で培養し、εＰＬを培養液中に著量に生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするεＰＬの製造
法である。

変異株はεＰＬを著量に生産する菌株でありストレプト
マイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジノボリ
メラスｍ３４６−Ｄ株のプラスミドが増幅したプラスミ
ド増幅性変異株が好ましい。

以下に本発明の詳細な説明する。

プラスミド増幅性変異株は、プラスミドを増幅させる処
理を施して得られ、例えば以下の方法で取得する。スト
レプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジ
ノポリメラスＮ１３４６Ｄ株あるいは、Ｓ−アミノエチ
ル−Ｌ−システィン耐性株を培地に接種し、振とう培養
した後にクロラムフェニコールを添加し、さらに培養を
続ける。

遠心分離して菌体を集め、洗浄した後、寒天培地に菌を
塗布する。静置培養した後、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を含む普通寒天培地
を重層し、さらに培養し生成したブドウ球菌の生育阻止
円の大きな株が、ブラズミド増幅性εＰＬ高生産株であ
る。

かかるプラスミド増幅性変異株として５０８３３株（微
工研条寄第１１１０号）をあげることができる。該５０
８３３株の菌学的性質を示すと次の通りである。

（１）形態学的性質シュークロース・硝酸塩寒天培地上で３０℃、１０日間
生育した５０８３３株の気菌糸および基生菌糸を顕微鏡
で観察した結果を次に示す。

■　胞子形成菌糸の分枝法および形態：単純分枝、閉鎖
らせん状（ｃｌｏｓｅｄ　５ｐｉｒａｌ）■　胞子の数
二　数十個 ■　胞子の表面構造および大きさ：胞子は円ないし楕円形で大きさは約１．２〜１．５μで
あり、その表面構造はスパイニー（Ｓｐｉｎｙ）である
。

■　鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在が認めら
れない。

■　胞子柄の着生位置：　気菌糸上（２）各種培地上における生育状態下記の各種培地上における性状はそれぞれ３０℃で１０
〜１４日間培養後の観察結果である。

（３）生理的性質 ■　生育温度範囲約１５〜４０°Ｃ０生￥ｉ′最適温度；３０°Ｃ付近。

■　ゼラチンの液化、でん粉の加水分解および脱脂牛乳
のペプトン化：　すべで陽性 ■　脱脂牛乳の凝固：　陰性 ■　メラニン様色素の生成チロシン寒天培地上では褐色の色素を生成する。

■　細胞壁組成細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてベ
フカ−（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法〔アプライド・マイク
ロバイオロジー第１３巻第２３６頁（１９６５年）参照
〕により分析した結果、Ｌ、　　Ｌ型であった。

（４）各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリープ
寒天培地上）Ｌ−アラビノース　　　　　　　− Ｄ−キシロース　　　　　　　　− Ｄ−グルコース　　　　　　　　十り−フラクトース　　　　　　　＋Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　− Ｄ−ガラクトース　　　　　　　＋シュークロース　　　　　　　　− ラフィノース　　　　　　　　　− Ｄ−マンニトール　　　　　　　＋ｉミーイノシトール　　　　　　＋サリシン　　　　　　　　　　　− 註）＋：同化する、　−：同化しない。

以上記述したように、プラスミド増幅性変異株５０８３
３株の菌学的性質は、原菌株であるストレプトマイセス
・アルプラス・サブスピーシーズ・リジノボリメラスＮ
ｏ、３４６−Ｄ株の菌学的性質と類似している。

次に、この方法で得られた変異株を用いて本発明方法に
より、εＰＬを製造する。尚、文中％は１−４Ｆに記さ
ないかぎり重ｉｔ　（ｇ＞　／容量（−）％である。

まず、得られた変異株をＬ−リシン、またはＬ−リシン
と＋１Ｍ　Ｅ’ｌを添加した培地に接種して培養し、培
養物を含む培地（以下、培養液という）から生成蓄積し
たεＰＬを分離・精製する。培地は炭素源、窒素源、無
機塩、ビタミンが含まれていれば、いかなるものでもよ
いが、好ましくは炭素源としてブドウｔＪ！　５％、あ
るいはグリセリン５％を含み、窒素源として硫酸アンモ
ニウム、あるいはペプトンを含むものが良い。

Ｌ−リシンとＩ！類の添加時期は培養初期でも後期でも
良いが、好ましくは中期にｐＨが下がり始めてからが良
い。添加するＬ−リシンはＬ−リシン・１塩酸塩として
培養液全体に対して０．０５から２％の範囲で用いられ
るが、好ましくはＬ−リシン・１塩酸塩を０．５％添加
するのが良い。糖類はブドウ糖、シーＩＦ！、麦芽糖、
デンプン、乳糖等のＩＪ＋＋　Ｍおよびグリセリン群か
ら選ばれた１種または２種以上を培養液全体に対して０
．５から５％の範囲で用いられるが、好ましくはブドウ
糖を２．５％添加するのが良い。

逐次添加の場合は培養液中の糖濃度が所定％以下になっ
た時に１！頚およびＬ−リシンを添加する。

例えばブドウ糖；震度が０．１％以下になった時にブド
ウ糖を２．５％、し−リシンを０．５％添加するのが良
い。

連続添加では、培養液中の糖類、例えばブドウ糖の濃度
を、例えば１％に、Ｌ−リシン濃度を、例えば０．２％
に維持するようにブドウ糖液とＬ−リシン液を培養槽に
通液し培養液を排出するのが良い。また、消泡剤を培養
液に加えても良い。

ｐ　ＴＴは培養初期はｐ　Ｈ４，０になるまで下がるに
まかせ、その後水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリで
ｐＨ４，０を維持するようにしても良い。培養液から遠
心分離機あるいはフィルターで菌体を除いた後、濾過液
をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を
除き、さらにカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し
活性炭で脱色しこれを濃縮する。？農縮液にアルコール
、アセトン等の有機）容媒を加えてεＰＬを晶析する。

（発明の効果）本発明によれば、εＰＬを産生ずる菌株の変異株を培養
する際に、培養液にし一リジンもしくはＬ−リシンと糖
類を添加することによって著量にεＰＬを産生ずること
ができる。従って、εＰＬの生産コストを従来に比べて
大幅に引き下げることができる。

（実施例）以下、本発明を実施例につき詳細に述べる。

実施例ＩＳ−アミノエチル−Ｌ−システィン耐性株の取得：ストレプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・
リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｕ
ｌｕｓ　５ｕｂｓｐ、　Ｉｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕ
ｓ）　Ｎ１１３４６−　Ｄ株の胞子ｌ白金耳量をトリス
−マレイン酸緩衝液（ｐＨ９，０）　５　ｍｌに懸濁し
、これにＮ−メチル−Ｎ＝ニトロ−Ｎ゛−ニトロソグア
ニジンを１．５ｎｗ／−の濃度になるように添加した。

これを、３０分間、３０℃で振とうした後、遠心分離機
により胞子を集め、滅菌水で洗浄し、ブドウ糖５％、硫
酸アンモニウム１％、酵母エキス０．５％、リン酸二水
素−カリウム・７水塩０．１３６％、リン酸−水素二ナ
トリウム・１２水塩０．１５８％、硫酸マグネシウム、
・７水塩０．０５％、硫酸亜鉛・７水塩０．００４％、
硫酸第一鉄・７水塩Ｑ、００３％、ｐＨ６，８の培地（
以下、上記培地と呼ぶ）５ｍｌに接種し、−昼夜３０℃
で振とう培養し、菌を生育させた。

その培養液をＭＳ溶液（組成は硫酸マグネシウム・７水
塩０．０５％、塩化ナトリウム０８５％、ツイーン８０
０．０５％）で５０００倍に希釈する。次いで、この希
釈培養液を、寒天培地１　ｍｌ当り２■の濃度になるよ
うにＳ−アミノエチル−Ｌ−システィン、またはこの濃
度になるようにＳ−７ミノエチルーＩ７−システィンお
よび寒天培地１ｒｎ１当りＩＩＴｇの濃度になるように
グリシンまたはＬ−スレオニンを添加した上記培地と同
じ組成の寒天培地に塗布した。これを、３０°Ｃで４８
時間保温し、コロニーとして生育させ、Ｓ−アミノエチ
ル−Ｌ−システィン耐性株を得た。

プラスミド増幅性変異株の取得：このようにして得られたＳ−アミノエチル−Ｌ−システ
ィン耐性株を上記培地と同じ組成の培地５−に接種する
。

これを３０℃２日間振とう培養した後に、クロラムフェ
ニコールを培養液１１当り５０から５００　ｍｇ、好ま
しくは１００■の濃度になるように添加し、さらに５か
ら１０時間、好ましくは８時間培養を続ける。遠心分離
して菌体を集め、滅菌水あるいは生理食塩水で洗浄した
後、上記培地と同じ組成分に寒天１．７％を加えた寒天
培地に菌を塗布する。

８日間３０℃で静置培養した後、ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）を含む普通寒天
培地を重層し、さらに１夜培養し生成したブドウ球菌の
生育阻止円の大きな株がプラズミド増幅性ｔＰＬ高生産
株である。この中の１株が５０８３３株（微工研条寄第
１１１０号）である。

εＰＬの生産：上記培地と同じ組成分にさらにＬ−リシン・１塩酸塩０
．５％を添加したｐＨ６，８の培地５　ｍＡにプラスミ
ド増幅性変異株５０８３３株を１白金耳面接種し、３０
℃で８日間振とう培養した。培養終了後、培養液中のε
ＰＬの濃度をイツァキ（Ｉｔｚｈａｋｉ）の方法で測定
した。

培養液１１当りのεＰＬの生産量は１．８５ｇであった
。

比較例１プラスミド増幅性変異株５０８３３株の代わりに、スト
レプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジ
ノポリメラスＴｈ３４６−Ｄ株を用いた以外は、実施例
１と同様の方法で培養し、εＰＬの濃度を同様の方法で
測定した。

培養液１１当りのεＰＬの生産量は０．１６ｇであった
。

実施例２上記培地と同じ組成の培地１．５　！！に、ポリオキシ
アルキレングリコール誘導体の消泡剤０．０５容量％を
加えたものに、プラスミド増幅性変異株５０８３３株を
前培養した培養液５０Ｉｎ１を接種し、３０℃で８日間
、通気攪拌培養したａｐＨが低下しはじめた時に、ブド
ウ糖２．５％、Ｌ−リシン・１塩酸塩０．５％を無菌的
に添加した。以後１．培養液中のブドウｔｆｆｉ　？Ｍ
ｔ度が２％以下にならないように、ブドウ糖２．５％を
無菌的に逐次添加した。ｐ　Ｈ低下後、ｐＨが４．０以
下にならないように６Ｎ水酸化ナトリウムをｐＨコント
ローラーで自動的に連続制御しながら加えた。

培養後、遠心分離機で菌体を除去し培養液中のεＰＬの
濃度をイツアキ（Ｉｔｚｈａｋｉ）の方法で測定した。

培養液ＩＩ！当りのεＰＬの生産量は２０．３ｇであっ
た。

比較例２プラスミド増幅性変異株５０８３３株の代わりに、スト
レプトマイセス・アルプラス・サブスピーシーズ・リジ
ノボリメラスｈ３４６−Ｄ、株を用いた以外は、実施例
２と同様の方法で培養し、εＰＬの濃度を同様の方法で
測定した。

培養液１１当りのεＰＬの生産量は０．２０ｇであった
・実施例３上記培地と同じ組成の培地１．５１に、ポリオキシアル
キレングリコール誘導体の消泡剤０．０５容量％を加え
たものに、プラスミド増幅性変異株５０８３３株を前培
養した培養液５０ｍ１を接種し、６００ｒｐｍ、通気量
２１　／ｍｉｎ、、　３０℃で培養した。

２４時間後に、ｐＨが低下しはじめたので、培養液中の
ブドウ糖濃度を１％に、Ｌ−リシン濃度を０．２％に維
持するようにブドウ糖液とＬ−リシン液を培養槽に通液
し培養液を排出した。ｐＨ低下後、ｐＨが４，０以下に
ならないように６Ｎ水酸化ナトリウムをｐＨコントロー
ラーで自動的に連続制御しながら加えた。

培養後、遠心分離機で菌体を除去し培養液中のεＰＬを
アニオン交換樹脂ＩＲＡ−４０２、カチオン交換樹脂Ｉ
ＲＣ−５０，活性炭カルボラフイン５０ｗで精製してア
ルコールで晶析し、純度が９９．９重量％、収量５．０
２ｇのεＰＬを得た。

昭和６２年９月２８日特許庁長官　　小　　川　　邦　　夫　　殿１、　事件
の表示　　昭和６１年特許願第１９２１５８号２、　発
明の名称イプシロン−ポリ−ルーリジンの製造法３、　補正をす
る者事件との関係　特許出願人〒５３０大阪府大阪市北区中之島三丁目６番３２号（２
０７）　　チ　　ッ　　ソ　　株　　式　　会　　社代
表者　野　　木　　貞　　雄４、代理人範囲に記載された発明の数を２に補正する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを産生する菌株を
変異処理し、得られるイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを
著量に生産する菌株を、Ｌ−リシンを添加した培地にて
培養し、培養液中にイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを著
量に生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンの製造法。
（２）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを著量に生産する
菌株がプラスミドを増幅させる処理を施した菌株である
特許請求の範囲第１項記載の製造法。
（３）プラスミドを増幅させる処理がクロラムフェニコ
ール処理である特許請求の範囲第２項記載の製造法。
（４）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを著量に生産する
菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシ
ーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ　ｓｕｂｓ
ｐ．ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）Ｎｏ．３４６−
Ｄ株のプラスミド増幅性変異株５０８３３株（微工研条
寄第１１１０号）である特許請求の範囲第３項記載の製
造法。
（５）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを産生する菌株を
変異処理し、得られるイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを
著量に生産する菌株を、Ｌ−リシンおよび糖類を添加し
た培地にて培養し、培養液中にイプシロン−ポリ−Ｌ−
リシンを著量に生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とするイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンの製造法。
（６）Ｌ−リシンおよび糖類の添加が、逐次添加である
特許請求の範囲第５項記載の製造法。
（７）Ｌ−リシンおよび糖類の添加が、連続添加である
特許請求の範囲第５項記載の製造法。
（８）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを著量に生産する
菌株がプラスミドを増幅させる処理を施した菌株である
特許請求の範囲第５項、第６項、もしくは第７項のいず
れか１項記載の製造法。
（９）プラスミドを増幅させる処理がクロラムフェニコ
ール処理である特許請求の範囲第８項記載の製造法。
（１０）イプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを著量に生産す
る菌株がストレプトマイセス・アルブラス・サブスピー
シーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ　ｓｕｂ
ｓｐ．ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）Ｎｏ．３４６
−Ｄ株のプラスミド増幅性変異株５０８３３株（微工研
条寄第１１１０号）である特許請求の範囲第９項記載の
製造法。