DE3785266T2 - Stamm zur massenproduktion von epsilon-poly-l-lysin, methode, um diesen stamm zu gebrauchen, und methode zur herstellung von epsilon-poly-l-lysin. - Google Patents

Stamm zur massenproduktion von epsilon-poly-l-lysin, methode, um diesen stamm zu gebrauchen, und methode zur herstellung von epsilon-poly-l-lysin.

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DE3785266T2 DE8787111253T DE3785266T DE3785266T2 DE 3785266 T2 DE3785266 T2 DE 3785266T2 DE 8787111253 T DE8787111253 T DE 8787111253T DE 3785266 T DE3785266 T DE 3785266T DE 3785266 T2 DE3785266 T2 DE 3785266T2
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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen Stamm, der ε-Poly-L-lysin (im folgenden als εPL abgekürzt) in Massen erzeugt, ein Verfahren zur Verwendung des Stammes und ein Verfahren zur Erzeugung von εPL. εPL ist eine hochmolekulare Verbindung, wie in der folgenden Gleichung beschrieben ist, worin die Aminogruppen der ε-Positionen von L-Lysin mit den benachbarten Carboxylgruppen von L-Lysin unter Bildung einer Amidbindung verknüpft werden.
  • Da dieses Material ein Polymeres von L-Lysin ist, das eine essentielle Aminosäure ist, besitzt es eine hohe Sicherheit und eigene physikalische Eigenschaften wegen seines hohen Kationengehalts. Folglich kann seine Verwendung in Toilettenartikeln, Schönheitsmitteln, Futtermittelzusatzstoffen, Arzneimitteln, landwirtschaftlichen Hilfsstoffen, Lebensmittelzusatzstoffen, elektronischen Materialien etc. unter Verwendung dieser Eigenschaften erwartet werden.
  • Bis jetzt wurde dieses Material durch Züchten des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-.D (Hinterlegungsnr. des Mikrcorganismus 3834 bei FRI), der ein εPL erzeugendes Bakterium der Gattung Streptomyces ist, in einem Kulturmedium, dessen Abtrennung von den erhaltenen Kulturmaterialien und dessen Reinigung (japanische Patentpublikation 59-20359).
  • Jedoch wurde εPL zu höchstens 0,5 g pro Liter Kulturlösung aus dem genannten Stamm erzeugt. Folglich waren die Produktionskosten dieses Materials hoch und dessen breite Verwendung behindert.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen Stamm zur Massenproduktion von εPL erhalten, diesen wiederholt erforscht, um εPL in großen Mengen unter Verwendung dieses Stammes zu erzeugen und sind so zu der folgenden Erfindung gelangt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Stammvariante, die εPL in Massen produziert, bereit, die die Variante FERM BP 1109, abgeleitet von Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ist, und die gegenüber S-Aminoethyl-L-Cystein und Glycin tolerant ist. Ferner wird erfindungsgemäß ein Stamm, der εPL in Massen produziert, bereitgestellt, der die Variante FERM BP 1110, erhalten durch Amplifikationsbehandlung eines Plasmids von Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D mit Chloramphenicol, sowie ein Verfahren zur Verwendung der Variante FERM BP 1109, bei dem man die Variante FERM BP 1109 in einem Kulturmedium züchtet, das erzeugte ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung speichert und das gespeicherte ε-Poly-L-lysin aus der Kulturlösung gewinnt, sowie ein Verfahren zur Verwendung der Variante FERM BP 1110, bei dem man die Variante FERM BP 1110 in einem Kulturmedium züchtet, das erzeugte ε-Poly-L- lysin in der Kulturlösung speichert, und das gespeicherte ε-Poly-L-lysin aus der Lösung gewinnt. Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Erzeugung von εPL bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Stamm, der εPL erzeugt, einer Variationsbehandlung unterworfen wird, die erhaltene Stammvariante in einem Kulturmedium dem L-Lysin oder L-Lysin und ein oder mehrere Zucker zugesetzt sind, gezüchtet wird, εPL in Massen erzeugt wird und in der Kulturlösung gespeichert wird und das gespeicherte εPL aus der Lösung gewonnen wird.
  • Die Stammvariante ist ein Stamm, der εPL in großen Mengen erzeugt. Bevorzugt ist sie eine Stammvariante, die gegenüber einem L-Lysin-Analogon des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D oder eines durch Plasmid-Amplifikation behandelten Stammes des gleichen Bakteriums tolerant ist.
  • Das L-Lysin-analoge Material ist bevorzugt S-Aminoethyl-L- cystein oder ein Additiv aus S-Aminoethyl-L-cystein und einem oder mehreren Materialien, ausgewählt aus der Gruppe L- Threonin, Glycin, L-Homoserin und L-Methionin.
  • Ferner ist der durch Plasmid-Amplifikation behandelte Stamm des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ein Stamm, der durch Amplifikationsbehandlung eines Plasmids erhalten wurde und ein durch Plasmid-Amplifikation behandelter Stamm 50833 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1110 bei FRI), erhalten durch Chloramphenicol-Behandlung, kann als Beispiel angeführt werden.
  • Die folgende Beschreibung dient der näheren Erläuterung der Erfindung.
  • Als erstes wird ein Verfahren zum Erhalt des erfindungsgemäßen Stammes beschrieben. Die Stammvarianten, die gegenüber einem L-Lysin-Analogon, wie S-Aminoethyl-L-cystein tolerant sind, werden beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
  • Sporen des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D werden in Tris-Maleinsäure-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin wird der Lösung zugesetzt.
  • Nach Schütteln der Lösung werden die Sporen durch Zentrifugation gewonnen, mit sterilisiertem Wasser gewaschen und in ein Kulturmedium inokuliert. Durch Schütteln des Mediums werden Bakterien gezüchtet. Das Kulturmedium, das die Bakterien enthält (nachstehend wird das Medium als Kulturlösung bezeichnet), wird verdünnt. Dann werden S-Aminoethyl- L-cystein oder ein Additiv von S-Aminoethyl-L-cystein und einem oder mehreren Materialien, ausgewählt aus der Gruppe Glycin, L-Threonin, L-Homoserin und L-Methionin, einem Agar-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehende Medium zugesetzt.
  • In diesem Fall kann S-Aminoethyl-L-cystein in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mg pro ml des Agar-Kulturmediums, bevorzugt 2 mg, oder ein Additiv, enthaltend S-Aminoethyl- L-cystein in der gleichen Konzentration und eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der vorstehenden Gruppe, in einer Konzentration von 0,2 bis 5 mg pro ml des Agar- Kulturmediums, bevorzugt 1 mg, verwendet werden. Die vorstehende verdünnte Kulturlösung wird auf dieses Agar-Kulturmedium aufgebracht. Nach Inkubation des so behandelten Agar-Kulturmediums werden S-Aminoethyl-L-cystein-Stammvarianten als Kolonien erhalten. Der Stamm, der in dem Agar- Kulturmedium, das S-Aminoethyl-L-cystein allein enthält, gezüchtet wird, ist eine tolerante Stammvariante 81512. Der Stamm, der in dem Agar-Kulturmedium, das S-Aminoethyl-L-Cystein und Glycin enthält, gezüchtet wird, ist eine tolerante Stammvariante 11011AA-1 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1109 bei FRI). Ferner ist der Stamm, der in dem Agar-Kulturmedium, das S-Aminoethyl-L-cystein und L-Threonin enthält, gezüchtet wird, eine tolerante Stammvariante 81502.
  • Als nächstes werden die durch Plasmid-Amplifikation behandelten Stämme durch Amplifikationsbehandlung eines Plasmids, beispielsweise nach dem folgenden Verfahren, erhalten. Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D- Stämme oder Variantenstämme mit S-Aminoethyl-L-cystein-Toleranz werden in ein Kulturmedium inokuliert. Nach Schütteln des Mediums wird Chloramphenicol dem Medium zugesetzt und es wird weitergezüchtet. Die gezüchteten Bakterien werden durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und auf ein Agar-Kulturmedium aufgebracht. Nach statischer Züchtung wird ein herkömmliches Agar-Kulturmedium, das Staphylococcus aureus enthält, auf das genannte Medium überschichtet. Nach weiterer Züchtung sind die erzeugten großen Stämme von Staphylococcus aureus mit Grenzen, die das Wachstum behindern, die gewünschten durch Plasmid-Amplifikation-behandelten Stämme, die εPL in Massen produzieren können, nämlich der durch Plasmid-Amplifikation behandelte Stamm 50833 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1110 bei FRI). Unter diesen Stammvarianten sind die mykologischen Eigenschaften des Stammes 11011A-1 und des Stammes 50833 wie folgt:
    • 1. Morphologische Eigenschaften:
  • Mit einem Mikroskop wurden ein Luftmycel und ein Substratmycel bei dem Stamm 11011A-1 und dem Stamm 50833, die auf einem Saccharose-Nitrat-Agar-Kulturmedium bei 30ºC 10 Tage lang gezüchtet wurden, beobachtet. Das Ergebnis ist wie folgt.
  • 1) Verzweigung und Morphologie der Sporogenese-Mycelien: einfache Verzweigung und geschlossen spiralförmig.
  • 2) Sporenanzahl: mehrere Zehnergruppen.
  • 3) Oberflächenstruktur und Sporengröße: stachelig, etwa 1,2 bis 1,5 u und rund oder ovale Form.
  • 4) Vorliegen von begeißelten Sporen, Bakterien, Zellkernen und Sporangien: keine.
  • 5) Insertionsposition des Sporophors: auf dem Luftmycel.
    • 2. Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Kulturmedien
  • Die Eigenschaften der Stämme auf den folgenden verschiedenen Kulturmedien sind als Beobachtungsergebnisse nach 10- bis 14tägiger Züchtung bei 30ºC gezeigt.
  • a) Stamm 11011A-1 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1109 bei FRl) Kulturmedium Substrat-Mycel Luft-Mycel lösliches Pigment Saccharose-Nitrat-Agar Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Asparagin-Agar Tyrosin-Agar Nähragar Hefe-Maltose-Agar Hafermehl-Agar blaß-gelb blaß-gelb, dann gelb-braun blaß-braun blaß-gelb gefältelt grau-braun weiß pulverförmig schlechtes Wachstum des Luft-Mycels weiß reichlich pulverförmig weiß reichlich weiß-pulverförmig, grau-braune Flecken weiß, dann grau-braun keines braun
  • b) Stamm 50833 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1110 bei FRI) Kulturmedium Substrat-Mycel Luft-Mycel lösliches Pigment Saccharose-Nitrat-Agar Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Asparagin-Agar Tyrosin-Agar Nähragar Hefe-Maltose-Agar Hafermehl-Agar blaß-gelb blaß-braun blaßgelb, dann gelb-braun braun blaß-gelb gefältelt grau-braun weiß pulverförmig schlechtes Wachstum des Luft-Mycels weiß, reichlich pulverförmig weiß, reichlich weiß-pulverförmig, grau-braune Flecken weiß, dann grau-braun keines
    • 3. Physiologische Eigenschaften
  • Die physiologischen Eigenschaften des Stammes 11011A-1 und des Stammes 50833 sind wie folgt:
  • 1) Bereich der Wachstumstemperaturen etwa 15 bis 40ºC. Optimale Wachstumstemperatur: etwa 30ºC.
  • 2) Verflüssigung von Gelatine, Hydrolyse von Stärke und Peptonisierung von Magermilch: alle positiv.
  • 3) Coagulation von Magermilch: negativ.
  • 4) Bildung eines meraninartigen Pigments: ein braunes Pigment wird auf dem Tyrosin-Agar-Kulturmedium gebildet.
  • 5) Zusammensetzung der Zellwände: das analytische Ergebnis, das nach dem Verfahren von Becker et al. (Applied Microbiology, 13, 236 (1965)) erhalten wurde, zeigt, daß die Art der Diaminopimelinsäure in der Zusammensetzung der Zellwände vom L- L-Typ war.
  • 4. Assimilierbarkeit verschiedener Kohlenstoffquellen auf dem Pridham-Gottliep-Agar-Kulturmedium:
  • L-Arabinose -
  • D-Xylose -
  • D-Glucose +
  • D-Fructose +
  • L-Rhamnose -
  • D-Galactose +
  • Saccharose -
  • Raffinose -
  • D-Mannit +
  • i-Inosit +
  • Salicin -
  • Anmerkung: +: assimiliert, -: dissimiliert
  • Wie vorstehend beschrieben, sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Stammvarianten ähnlich den Eigenschaften des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D, der ein Ausgangsstamm ist.
  • Dann wird εPL erfindungsgemäß unter Verwendung der Stammvarianten, die nach den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden, hergestellt. Ferner bedeutet % in dieser Beschreibung Gewicht (g)/Volumen (ml)%, außer anders angegegben. Zuerst werden die erhaltenen Stammvarianten in ein Kulturmedium, z.B. unter Zusatz von L-Lysin oder L-Lysin und einem oder mehreren Zuckern inokuliert und gezüchtet. Das aus dem Kulturmedium, das die Kulturmaterialien (nachstehend als Kulturlösung abgekürzt) enthält, erhaltene εPL wird abgetrennt und gereinigt. Jedes beliebige Kulturmedium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Vitamine enthält, kann verwendet werden. Obwohl nicht-einschränkend, ist ein Medium, das 5% Glucose oder 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat, L-Lysin oder Pepton als Stickstoffquelle enthält, bevorzugt. Im Verlauf der Züchtung können die Kohlensttoffquelle und die Stickstoffquelle sukzessive oder kontinuierlich dem Kulturmedium zugesetzt werden.
  • Wenn L-Lysin und Zucker der Kulturlösung zugesetzt werden, können L-Lysin und Zucker jederzeit vom Beginn bis zum Ende der Züchtung, bevorzugt mitten in der Züchtung, wenn der pH-Wert sich absenkt, zugesetzt werden. Als zuzusetzendes L-Lysin kann L-Lysin-Monohydrochlorid im Bereich von 0,05 bis 2%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Kulturlösung, bevorzugt 0,5%, verwendet werden. Hinsichtlich der Zucker können ein oder mehrere Zucker, ausgewählt aus Gruppe Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke, Galactose etc. und Glycerin im Bereich von 0,5 bis 5%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Kulturlösung, bevorzugt 2,5% Glucose, verwendet werden.
  • Bei sukzessiver Zugabe werden L-Lysin und die Zucker zugesetzt, wenn die Zuckerkonzentration der Kulturlösung unter einem fixierten Prozentsatz erniedrigt wird. Beispielsweise werden bevorzugt 2,5% Glucose und 0,5% L-Lysin zugesetzt, wenn die Zuckerkonzentration unter 0,1% erniedrigt wird.
  • In kontinuierlicher Zugabe können eine Glucoselösung und eine L-Lysin-Lösung durch einen Kulturtank geleitet werden und die Kulturlösung kann eliminiert werden, um beispielsweise die Glucosekonzentration, z.B. bei 1% und beispielsweise die L-Lysin-Konzentration, z.B. bei 0,2% der Kulturlösung zu halten. Ferner kann ein Entschäumungsmittel der Kulturlösung zugesetzt werden.
  • Man kann den pH-Wert auf 4,0 zu Beginn der Züchtung fallenlassen und ihn dann bei 4,0 durch Zugabe einer Alkalilösung, wie einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung halten. Nach Entfernen der gezüchteten Bakterien durch Zentrifugation oder mit einem Filter aus der Kulturlösung wird das Filtrat gereinigt, entfärbt und konzentriert. εPL wird aus der konzentrierten Lösung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Ethanol etc. auskristallisiert.
  • Die Wirkungen der vorliegenden Erfindung sind wie folgt.
  • Die erfindungsgemäßen Stammvarianten besitzen die Fähigkeit, εPL in Massen zu produzieren. Durch Züchten der Stammvarianten erzeugen die Stämme mehr εPL als die bekannten Stämme. Ferner können erfindungsgemäß, wenn die Stammvarianten der Stämme, die εPL produzieren, gezüchtet werden, εPL in großen Mengen durch Zugabe von L-Lysin oder L- Lysin und einem oder mehreren Zuckern zu der Kulturlösung produzieren. Folglich können die Produktionskosten von εPL stark im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erniedrigt werden.
    • Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher.
    • Beispiel 1 Erhalt von Stammvarianten, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant sind:
  • Sporen des Stammes Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D in Mengen eines Platinohrenstäbchens wurden in Tris-Maleinsäure-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin wurde der Lösung zugesetzt. Nach 30minütigem Schütteln der Lösung bei 30ºC wurden die Sporen mit einer Zentrifuge gewonnen, mit sterilisiertem Wasser gewaschen und in 5 ml des Kulturmediums mit pH 6,8, das 5% Glucose, 1% Ammoniumsulfat, 0,5% Hefeextrakt, 0,136% Kaliumdihydrogenphosphathepathydrat, 0,158% Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat, 0,05% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,004% Zinksulfatheptahydrat, 0,003% Eisen- (II)-Sulfatheptahydrat (das Medium wird nachstehend als das erste Kulturmedium abgekürzt) enthält, inokuliert. Durch Schüttelzüchtung bei 30ºC für einen ganzen Tag und eine Nacht wurden die Bakterien gezüchtet.
  • Die Kulturlösung wurde 5000fach durch Zugabe der MS-Lösung, die 0,05% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5% Natriumchlorid und 0,05% Tween 80 (Warenzeichen) enthält, verdünnt. Dann wurde die verdünnte Kulturlösung auf das Agar-Kulturmedium, das die gleichen Komponenten wie das erste Kulturmedium hatte, und zusätzlich S-Aminoethyl-L-cystein oder S-Aminoethyl-L-cystein in einer Konzentration von 2 mg pro ml des Agar-Kulturmediums und Lycin oder Threonin in einer Konzentration von 1 mg pro ml des Agar-Kulturmediums enthielt, aufgebracht. Das so versehene Agar-Kulturmedium wurde 48 Stunden bei 30ºC inkubiert, um die Stämme als Kolonien zu züchten, und Stammvarianten, die gegenüber S-Aminoethyl-L- cystein tolerant waren, wurden erhalten.
  • In diesem Falle war der Stamm, der von dem Agar-Kulturmedium, dem nur S-Aminoethyl-L-cystein zugesetzt wurde, erhalten wurde, der Stamm 81512. Einer der von dem Agar-Kulturmedium, dem S-Aminoethyl-L-cystein und Glycin zugesetzt worden waren, erhaltenen Stämme, war der Stamm 11011A-1 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1109 bei FRI). Der von dem Agar-Kulturmedium, dem S-Aminoethyl-L-cystein und L- Threonin zugesetzt worden waren, erhaltene Stamm war der Stamm 81502.
    • Produktion von εPL:
  • S-Aminoethyl-L-cystein-tolerante Stämme 81512 in Mengen eines Platinohrenstäbchens wurden in 5 ml des Kulturmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie das obige erste Kulturmedium inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC 8 Tage lang gezüchtet. Am Ende der Züchtung wurde die Konzentration von εPL in der Kulturlösung nach dem Verfahren von Itzhaki bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 0,67 g.
    • Beispiele 2 und 3
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, daß die Stammvariante 81512, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant ist, gegen die Stammvariante 11011A-1, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein und Glycin tolerant ist (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1109 bei FRI) (Beispiel 2) und die Stammvariante 81502, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein und L-Threonin tolerant ist (Beispiel 3), ausgetauscht wurde, wurde εPL erzeugt und dessen Konzentration wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 bestimmt.
  • Die Ausbeuten an εPL pro Liter Kulturlösung betrugen 0,88 g (Beispiel 2) bzw. 0,72 g (Beispiel 3).
    • Beispiel 4 Erhalt von durch Plasmid-Amplifikation-behandelten Stämmen
  • Die Stammvariante, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant ist, und die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 5 ml Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das erste Kulturmedium, wie in Beispiel 1 beschrieben, inokuliert.
  • Nach 2tägigem Schütteln des Kulturmediums bei 30ºC wurde Chloramphenicol in Mengen von 50 bis 500 mg pro 11 Kulturlösung, bevorzugt 100 mg, der Lösung zugesetzt und die Züchtung wurde weitere 5 bis 10 Stunden, bevorzugt 8 Stunden, fortgesetzt. Die gezüchteten Bakterien wurden durch Zentrifugation gewonnen, mit sterilisiertem Wasser und einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und auf ein Agar-Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das erste Kulturmedium einschließlich 1,7% Agar aufgebracht. Nach 8tägiger statischer Züchtung bei 30ºC wurde ein herkömmliches Agar-Kulturmedium, das Staphylococcus aureus enthielt, auf das Medium überschichtet. Nach weiterer Züchtung für eine Nacht waren die erzeugten großen Stämme von Staphylococcus aureus mit Grenzen zur Behinderung des Wachstums die mittels Plasmid-Amplifikation-behandelten Stämme, die in großem Umfang εPL produzieren konnten. Einer dieser Stämme war der Stamm 50833 (Mikroorganismen-Hinterlegungsnr. 1110 bei FRI).
    • Erzeugung von εPL:
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß der Stamm 81512 gegen den erhaltenen durch Plasmid-Amplifikation behandelten Stamm 50833 ausgetauscht wurde, wurde εPL erzeugt, und dessen Konzentration wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 1,8 g.
    • Vergleichsbeispiel 1
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß der Stamm der Stammvariante 81512, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant ist, gegen den Stamm Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ausgetauscht wurde, wurde εPL erzeugt und dessen Konzentration wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 0,20 g.
    • Beispiel 5
  • Es wurde wie in Beispiel 4 beschrieben vorgegangen, jedoch mit der Ausnahme, daß die Produktion an εPL wie folgt durchgeführt wurde.
  • Die mittels Plasmid-Amplifikation behandelten Stämme 50833 in Mengen eines Platinohrenstäbchens wurden in 5 ml des Kulturmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie das obige Kulturmedium einschließlich 0,5% L-Lysin-Monohydrochlorid inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC 8 Tage lang gezüchtet. Am Ende der Züchtung wurde die Konzentration an εPL in der Kulturlösung nach dem Verfahren von Itzhaki bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 1,85 g.
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie in Beispiel 5 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß der durch Plasmid-Amplifikation behandelte Stamm 50833 gegen den Stamm Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ausgetauscht wurde, wurde εPL produziert und dessen Konzentration wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 5 bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 0,16 g.
    • Beispiel 6
  • Zu 1,5 Liter des Kulturmediums, das die gleichen Komponenten wie das erste Kulturmedium, das im Beispiel 1 beschrieben ist, enthielt, wurden 0,05 Vol.-% eines Entschäumungsmittels eines Polyoxyalkylenglycolderivats zugesetzt. 50 ml Kulturlösung, in der die Stammvarianten 11011A-1, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant waren, vorgezüchtet wurden, wurden in das Medium inokuliert und die Stämme wurden unter Schütteln bei 600 UpM bei 30ºC in einer Luftflußrate von 2 l/min gezüchtet.
  • Nach 24 Stunden wurden 5% Glucose und 1% Ammoniumsulfat steril dem Medium zugesetzt. Nach Erniedrigen des pH-Werts wurden 6N Natriumhydroxid zugesetzt, während der pH-Wert automatisch und kontinuierlich mit einem Gerät zur Kontrolle des pH-Werts kontrolliert wurde, so daß er nicht unter 4,0 fiel. Nach Züchten wurden die Bakterien durch Zentrifugation entfernt und εPL in der Kulturlösung wurde mit einem Anionen-Austauscherharz von IRA-402, einem Kationen- Austauscherharz von IRC-50 und Aktivkohle von Carboraffin 50w gereinigt. Die Reinheit des so erhaltenen εPL betrug 99,9 Gew.-% und die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 4,77 g.
    • Vergleichsbeispiel 3
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 6 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß die Stammvariante 11011A-1, die gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein tolerant ist, gegen den Stamm Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ausgetauscht wurde, wurde εPL erzeugt. Die Reinheit des so erhaltenen εPL betrug 97,8 Gew.-% und die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 0,56 g.
    • Beispiel 7
  • Zu 1,5 Liter des Kulturmediums, das die gleichen Komponenten wie das erste Kulturmedium, das in Beispiel 1 beschrieben ist, enthielt, wurden 0,05 Vol.-% eines Entschäumungsmittels eines Polyoxyalkylenglycolderivats zugesezt. 50 ml der Kulturlösung, in der die durch Plasmid-Amplifikation behandelten Stämme 50833 vorgezüchtet worden waren, wurden in das Medium inokuliert und die Stämme wurden unter Belüften und Rühren bei 30ºC 8 Tage lang gezüchtet. Wenn der pH- Wert der Kulturlösung sich zu erniedrigen begann, wurden 2,5% Glucose und 0,5% L-Lysin-Monohydrochlorid steril dem Medium zugesetzt. Danach wurde, um die Glucosekonzentration der Kulturlösung nicht unter 2% zu erniedrigen, 2,5% Glucose steril sukzessive zugesetzt. Nach Erniedrigen des pH- Werts wurden 6N Natriumhydroxid zugesetzt, während der pH- Wert automatisch und kontinuierlich mit einem Gerät zur Kontrolle des pH-Werts kontrolliert wurde, so daß er nicht unter 4,0 fiel.
  • Nach der Züchtung wurden die Bakterien mit einer Zentrifuge entfernt und die Konzentration an εPL in der Kulturlösung wurde nach dem Verfahren von Itzhaki bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 20,3 g
    • Vergleichsbeispiel 4
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 7 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß der durch Plasmid-Amplifikation behandelte Stamm 50833 gegen den Stamm Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D ausgetauscht wurde, wurde die Konzentration an εPL nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 7 bestimmt.
  • Die Ausbeute an εPL pro Liter Kulturlösung betrug 0,20 g.
    • Beispiel 8
  • Zu 1,5 Liter des Kulturmediums, das die gleichen Komponenten wie das erste Kulturmedium, das in Beispiel 1 beschrieben ist, enthielt, wurden 0,05 Vol.-% eines Entschäumungsmittels eines Polyoxyalkylenglycolderivats zugesetzt. 50 ml der Kulturlösung, in der die durch Plasmid-Amplifikation behandelten Stämme 50833 vargezüchtet worden waren, wurden in das Medium inokuliert und die Stämme wurden unter Schütteln bei 600 UpM bei 30ºC in einer Luftflußrate von 2 l/min gezüchtet.
  • Nach 24 Stunden, als der pH-Wert der Kulturlösung begann, sich zu erniedrigen, wurden eine Glucoselösung und eine L- Lysin-Lösung durch den Kulturtank geleitet, um die Konzentrationen von 1% Glucose und 0,2% L-Lysin zu halten, und die Kulturlösung wurde evakuiert. Nachdem der pH-Wert sich erniedrigte, wurden 6N Natriumhydroxid zugesetzt, während der pH-Wert automatisch und kontinuierlich mit einem Gerät zur Kontrolle des pH-Werts kontrolliert wurde, so daß er nicht unter 4,0 fiel.
  • Nach der Züchtung wurden die Bakterien mit einer Zentrifuge entfernt, und εPL in der Kulturlösung wurden mit einem Anionen-Austauscherharz IRA-402, einem Kationen-Austauscherharz von IRC-50 und Aktivkohle von Carboraffin 50w gereinigt. Dann wurde εPL mit Alkohol kristallisiert. Die Reinheit des so erhaltenen εPL betrug 99,9 Gew.-%, und die Ausbeute betrug 5,02 g.

Claims (7)

1.Stamm zur Massenproduktion von ε-Poly-L-lysin, da durch gekennzeichnet, daß er die Variante FERM BP 1109, abgeleitet von Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D, ist, und daß er gegenüber S-Aminoethyl-L-cystein und Giycin tolerant ist.
2. Stamm zur Massenproduktion von ε-Poly-L-lysin, dadurch gekennzeichnet, daß er die Variante FERM BP 1110 ist, erhalten durch Amplifikationsbehandlung eines Plasmids von Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346-D mit Chloramphenicol.
3. Verfahren zur Verwendung der Variante FERM BP 1109, welche ε-Poly-L-lysin in Massen produziert, dadurch gekennzeichnet, daß man die Variante FERM BP 1109 in einem Kulturmedium züchtet, das so erzeugte ε-Poly-L- lysin in der Kulturlösung speichert und das gespeicherte ε- Poly-L-lysin aus der Lösung gewinnt.
4. Verfahren zur Verwendung der Variante FERM BP 1110, die ε-Poly-L-lysin in Massen produziert, dadurch gekennzeichnet, daß man die Variante FERM BP 1110 in einem Kulturmedium züchtet, das so erzeugte ε-Poly-L- lysin in der Kulturlösung speichert und das gespeicherte ε- Poly-L-lysin aus der Lösung gewinnt.
5. Verfahren zur Erzeugung von ε-Poly-L-lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man die Variante FERM BP 1110 in einem Kulturmedium, dem L-Lysin und ein oder mehrere Zucker zugesetzt sind, züchtet, das in Massen erzeugte ε- Poly-L-lysin in der Kulturlösung speichert und das gespeicherte ε-Poly-L-lysin aus der Lösung gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe von L-Lysin und Zuckern zu dem Kulturmedium sukzessive durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe von L-Lysin und Zuckern zu dem Kulturmedium kontinuierlich durchgeführt wird.
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