DE4405244B4

DE4405244B4 - Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin sowie Bakterienstamm zur Durchführung desselben

Info

Publication number: DE4405244B4
Application number: DE4405244A
Authority: DE
Inventors: Byung Lak Lim; Hong Rhym; Jin Ho Lee; Tae Yeol Choi; E Nam Hwang; Hong Kyu Choi
Original assignee: Miwon Co Ltd
Current assignee: Daesang Corp
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2014-02-19
Also published as: DE4405244A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation, welches die folgenden Schritte umfasst:
Kultivieren in einem Kulturmedium des neuen E. coli-Stammes MWOR 247, der als KCCM 10016 hinterlegt ist und welcher eine erhöhte Resistenz gegen osmotischen Druck aufweist und L-Phenylalanin erzeugen kann, und Gewinnen des L-Phenylalanins, das sich im Kulturmedium angesammelt hat.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Escherichia coli (im folgenden E. coli) gemäß Patentanspruch 1, welcher erhöht resistent gegen osmotischen Druck ist und L-Phenylalanin in einer großen Ausbeute produziert, sowie diesen E. coli-Stamm gemäß Patentanspruch 5.

L-Phenylalanin ist eine essentielle Aminosäure und kann für die synthetische Herstellung von ASPARTAM^®, einem Süßstoff, benutzt werden. Es gibt viele bekannte Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung von Mikroorganismen. Beispielsweise offenbaren die JP-PS-37-6345 und die JP-A-60-160,890 ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Verwendung von Brevibacterium- und Corynebacterium-Arten, welche Tyrosin benötigen. Die JP-A-55-165,797 offenbart ein ähnliches Verfahren durch Verwendung eines E. coli, welcher Tyrosin benötigt und welcher resistent gegen Tryptophan-Analoge und Phenylalanin-Analoge ist. Jedoch sind solche Verfahren des Standes der Technik nicht besonders geeignet für die L-Phenylalanin-Herstellung in einem industriellen Maßstab, da diese Verfahren niedrige Ausbeuten an L-Phenylalanin erzeugen.

Demgemäß ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin sowie einen Bakterienstamm zur Durchführung desselben zur Verfügung zu stellen, welche wenigstens eines der oben genannten Probleme vermeiden, die bei den herkömmlichen Verfahren auftreten.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 sowie einen Bakterienstamm gemäß Patentanspruch 5.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung von L-Phenylalanin zur Verfügung zu stellen, welches Kultivieren von E. coli in einem Kulturmedium, Belüften und Schütteln des Kulturmediums und Gewinnendes L-Phenylalanins aus dem Kulturmedium umfaßt.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, einen neuartigen E. coli-Stamm MWOR 247 (KCCM 10 016) mit einer Toleranz gegen osmotischen Druck beim Kultivieren unter Verwendung von Sorbitol oder Natriumchlorid zur Verfügung zu stellen.

Zusätzliche Merkmale und ein weiterer Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung werden aus der hierauf folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden. Man sollte jedoch verstehen, daß die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur zur Veranschaulichung dienen sollen, da verschiedene Änderungen und Modifikationen im Sinne und im Rahmen der Erfindung dem Fachmann aus der detaillierten Beschreibung deutlich werden sollten.

Mit Bezug nun im Detail auf die vorliegende Erfindung, wird dort ein Verfahren, um einen neuartigen E. coli zu erhalten, der L-Phenylalanin in einem Kulturmedium in hohen Konzentrationen produziert, und ein Verfahren für die Herstellung von L-Phenylalanin aus einem mikrobiellen Fermentationsnährmedium durch die Verwendung eines solchen neuartigen Mikroorganismus zur Verfügung gestellt.

Da L-Phenylalanin einen aromatischen Ring in seiner Formel hat ist es im Allgemeinen schwierig, eine hohe Ausbeute von dieser Aminosäure aus metabolischen synthetischen Prozessen zu erhalten.

Der neuartige Mikroorganismus, Escherichia coli MWOR 247, (hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer KCCM 10 016 am 22. Oktober 1992 bei dem Korean Culture Center of Mikroorganisms, Department of Food Engineering, College of Eng. Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Korea), gemäß der vorliegenden Erfindung, ist ausgehend von E. coli MWWJ 304 (KFCC 10737) verbessert, welcher der Ausgangsstamm von E. coli MWOR 247 (KCCM 10016) ist, und welcher am 30. August 1991 bei der Korean Federation of Culture Collection, Department of Food Engineering, College of Engineering, Yonsei University, Seoul Korea, hinterlegt wurde. Der E. coli MWWJ 304 ist ein Stamm, der resistent gegen Analoge von L-Phenylalanin und L-Tyrosin ist, und weiterhin eine temperatursensitive partielle Auxotrophie für L-Tyrosin aufweist. Der E. coli MWWJ 304 hat einige Nachteile, z.B. sinkt die Produktionsrate von L-Phenylalanin, wenn die Konzentration von L-Phenylalanin in einer Endfermentation mehr als 30 g/l erreicht.

Man nimmt an, daß die durch die Verwendung von dem E. coli-Stamm MWWJ 304 verursachten oben erwähnten Probleme wie folgt gelöst werden. Das heißt, der osmotische Druck wird während der Fermentation in der Kultur vergrößert, wenn die Konzentration von L-Phenylalanin sich vergrößert. Das Anwachsen des osmotischen Drucks wiederum bewirkt die Reduktion in der Produktion von L-Phenylalanin durch die Zellen.

Demgemäß vergrößert der neuartige Mikroorganismus E. coli MWOR 247 (KCCM 10016) die Produktivität von L-Phenylalanin unter den Bedingungen eines schrittweise wachsenden osmoti schen Drucks in der Kultur. Das heißt, der E. coli MWOR 247 hat, verglichen mit dem E. coli MWWJ 304, mehrere besondere Vorteile, wie im folgenden aufgelistet:

(a) Das Wachstum ist sehr gut unter hohem osmotischem Druck durch überschüssiges Sorbitol oder NaCl, und der Stamm kann toleranter sein gegenüber osmotischem Druck, der durch zugegebe Nährstoffe und Produkte, die sich während der Fermentation ansammeln, verursacht wird.
(b) Die Produktivität von L-Phenylalanin sinkt nicht, selbst wenn sich eine hohe Konzentration von L-Phenylalanin in der Kultur ansammelt.

Mit Bezug nun auf die vorliegende Erfindung wird dort ein Verfahren für die Herstellung von L-Phenylalanin zur Verfügung gestellt.

Nachdem der ursprüngliche Ausgangsstamm, E. coli MWWJ 304, 16-18 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 37°C in einem Kulturmedium Nr. 1 inkubiert wurde, wird eine Impföse mit der Kultur in 10 ml von Kulturmedium Nr. 2 angeimpft und 4-6 Stunden lang bei 37°C inkubiert und zentrifugiert, um die Zellen anzusammeln.

Danach werden die angesammelten Zellen mit Salzlösung gewaschen und in 8 ml 0,1 M Tris-Maleat-Pufferlösung (pH 6,0) suspendiert. 2 ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, in einer Konzentration von 100 μg/ml, werden zu 8 ml der obigen Suspension zugegeben. Nachdem die Suspension bei einer Temperatur von ca. 37 °C 30 Minuten lang horizontal geschüttelt wurde, wurden die Zellen durch Zentrifugation aus der Suspension isoliert und gewaschen. Der Stamm wird in dem Kulturmedium Nr. 3 bei einer Temperatur von ca. 37°C 48 Stunden lang kultiviert, um einen gegen osmotischen Druck resistenten Stamm zu erhalten.

Zu dieser Zeit werden E. coli MWOR-Stämme durch Selektieren von Kolonien, welche auf dem Kulturmedium Nr. 3 wachsen, erhalten. E. coli MWOR 247 wird aus diesen Stämmen über seine hohe Produktion von L-Phenylalanin im Medium Nr. 5 selektiert.

Der neuartige Stamm E. coli MWOR 247 der vorliegenden Erfindung zeigt, verglichen mit dem Ausgangsstamm E. coli MWWJ 304, physiologische Eigenschaften und eine L-Phenylalaninproduktivität wie folgt:

(1) Wachstumsvergleich mit zugesetztem Natriumchlorid oder Sorbitol.

Nachdem Natriumchlorid oder Sorbitol dem Kulturmedium Nr. 4 zugesetzt wurden, werden 40 ml der Kultur in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. 1 ml von Zellen, die 4-6 Stunden lang bei 37°C in Kulturmedium Nr. 2 kultiviert wurden, wird in den Kolben zugegeben und sie werden unter horizontalem Schütteln bei einer Temperatur von ca. 37°C 24 Stunden lang kultiviert. Danach wird eine Probe der Kultur ca. 10-fach verdünnt und die Absorption wird bei 610 nm, wie in der folgenden Tabelle I dargestellt, gemessen: Tabelle I Wachstumsvergleich mit zugesetztem Natriumchlorid oder Sorbitol

(2) Wachstumsvergleich mit zugesetztem L-Phenylalanin.

Nachdem L-Phenylalanin zu dem Kulturmedium Nr. 4 zugegeben wurde, werden 40 ml des Mediums in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Wie in dem oben beschriebenen Verfahren wird 1 ml der Zellen, welche bei 37 °C 4-6 Stunden lang in Kulturmedium Nr. 2 subkultiviert wurden, zu dem Kolben zugegeben und die Zellen werden unter horizontalem Schütteln bei 37°C 24 Stunden lang kultiviert. Danach werden Proben der Kultur ca. 10-fach verdünnt und die Absorption bei 610 nm wird gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II gezeigt: Tabelle II Wachstumsvergleich mit zugesetztem L-Phenylalanin

(3) Herstellung von L-Phenylalanin

Nach Herstellen des Kulturmediums Nr. 5 werden 40 ml des Mediums in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben. Wie in dem oben beschriebenen Verfahren wird 1 ml mit Zellen, welche 4-6 Stunden lang bei 37°C in Kulturmedium Nr. 2 subkultiviert wurden, in den Kolben zugegeben und die Zellen werden unter horizontalem Schütteln bei 37°C 48 Stunden lang kultiviert. Nachdem 2 ml 60 %ige Glucose zu dem Kulturmedium zugegeben wurden, wird die Kultur für weitere 24 Stunden fortgesetzt. Die Menge an L-Phenylalanin in der Kulturnähr lösung wird durch ein herkömmliches Verfahren getestet, welches Hochdruck-Flüssigchromatographie benutzt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III gezeigt: Tabelle III L-Phenylalanin-Erträge

(4) Wachstumsvergleich und L-Phenylalaninproduktion von sukzessive subkultiviertem E. coli MWOR 247.

Danach wird der neuartige Stamm E. coli MWOR 247 bei einer Temperatur von ca. 37°C 24 Stunden lang in dem Kulturmedium Nr. 1 inkubiert. Mit einer Impföse kultivierter Zellen wird frisches Kulturmedium Nr. 1 angeimpft. Die Kultur wird bei ca. 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Wie in der obigen Beschreibung wird das Animpfen und die Inkubation 30 mal regelmäßig wiederholt. Während des ersten, zehnten, zwanzigsten und dreißigsten Subkultivierens wird der Stamm gemäß dem Verfahren des oben beschriebenen Beispiels (3), Herstellung von L-Phenylalanin, getestet und außerdem wird die Kultur 50-fach verdünnt und die Absorption wird bei 610 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV gezeigt: Tabelle IV Wachstum und L-Phenylalaninproduktion von E. coli MWOR 247, der täglich 30 Tage lang subkultiviert wurde.

Die Zusammensetzungen der Kulturmedien, die in den obigen Beispielen zitiert wurden, sind wie folgt: (A) Kulturmedium Nr. 1

Bacto-Hefeextrakt	5 g/l
Trypton	10 g/l
Natriumchlorid	10 g/l
Agar	20 g/l

(pH 7,5, sterilisiert 15 min bei 121 °C) (B) Kulturmedium Nr. 2

Bacto-Hefeextrakt	5 g/l
Trypton	10 g/l
Natriumchlorid	10 g/l

(C) Kulturmedium Nr. 3

Glucose	2 g/l
Natriumphosphat, zweibasig	6 g/l
Kaliumphosphat, einbasig	3 g/l
Natriumchlorid	0,5 g/l
Ammoniumchlorid	1 g/l
Magnesiumsulfat	0,2 g/l
Calciumchlorid	0,01 g/l
L-Tyrosin	0,02 g/l
Sorbitol	110 g/l
Agar	20 g/l

(pH 7,0, sterilisiert 15 min bei 121°C) (D) Kulturmedium Nr. 4

Glucose	2 g/l
Natriumphosphat, zweibasig	6 g/l

Kaliumphosphat, einbasig	3 g/l
Natriumchlorid	0,5 g/l
Ammoniumchlorid	1 g/l
Magnesiumsulfat	0,2 g/l
Calciumchlorid	0,01 g/l
L-Tyrosin	0,02 g/l

(E) Kulturmedium Nr. 5

Glucose	80 g/l
Kaliumsulfat	0,5 g/l
Ammoniumsulfat	20 g/l
Natriumcitrat	0,5 g/l

Fumarsäure	0,5 g/l
Magnesiumchlorid	1 g/l
Kaliumphosphat, einbasig	1 g/l
Kaliumphosphat, zweibasig	1 g/l
Hefeextrakt	1 g/l
Glutaminsäure	0,5 g/l
Kobaltchlorid	0,1 mg/l
Zinksulfat	1 mg/l
Manganchlorid	2 mg/l
Calciumchlorid	5 mg/l
Eisenchlorid	20 mg/l
L-Tyrosin	200 mg/l
Calciumcarbonat	35 g/l

(pH 7,5, sterilisiert 15 min bei 121 °C)

Demgemäß zeigt der neuartige Mikroorganismus, E, coli MWOR 247, ein ausgezeichnetes Wachstum in Medien, die überschüssiges Sorbitol, Natriumchlorid oder L-Phenylalanin enthalten. Der neuartige Stamm zeigt ebenfalls eine ausgezeichnete Produktivität bei hohen Konzentrationen an L-Phenylalanin, die sich in der Endphase der Kultivierung ansammeln, verglichen mit dem Ausgangsstamm MWWJ 304.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird L-Phenylalanin durch Kultivieren des neuartigen Stammes E. coli MWOR 247 in einem Kulturmedium, welches Kohlenstoff, Stickstoff, anorganische Salze und organische Nahrungsquellen enthält, hergestellt. Danach sammelt sich in dem Kulturmedium L-Phenylalanin an, welches aus dem Medium über herkömmliche Ionenaustauscherharze gereinigt, mittels des herkömmlichen Verfahrens entfärbt und konzentriert wird, so daß gereinigtes L-Phenylalanin hergestellt werden kann.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich anhand der Beschreibung von Ausführungsbeispielen.

Beispiel 1
Impfmedium ist das oben beschriebene Kulturmedium Nr.2 und Kultivierungsmedium ist das oben beschriebene Kulturmedium Nr. 5.
40 ml des Impfmediums werden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und 15 Minuten lang bei 121 °C erwärmt, um es zu sterilisieren. Der neuartige E. coli Stamm MWOR 247 (KCCM 10 016) wird in den Kolben zugegeben und 8-10 Stunden lang bei 37°C kultiviert, um eine Impfkultur zu erzeugen.
40 ml des Kulturmediums werden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und wie im obigen Verfahren sterilisiert. Zu dieser Zeit wird 1 ml der Impfkultur zu dem oben sterili sierten Kulturmedium in den Kolben zugegeben und die Kultur wird 48 Stunden lang unter horizontalem Schütteln inkubiert. Dann werden 2 ml 60 %ige Glucose zu dem Kulturmedium zugegeben und die Inkubation wird unter horizontalem Schütteln für 24 Stunden fortgesetzt. Die angesammelte Menge an L-Phenylalanin beträgt 27,6 g/l.
Beispiel 2
Zellen des Stamms E. coli MWOR 247 (KCCM 10 016) werden in Kulturmedium Nr. 5 angeimpft, außer daß Calciumcarbonat ausgelassen wird und die Glucosekonzentration 100 g/l beträgt. Ein Liter dieses Kulturmediums wird in einen 2 1 Fermentationsreaktor gegeben. 40 ml der Impfkultur, welche wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wird in den Fermentationsreaktor zugegeben und bei 1000 rpm und 0,75 vvm 45 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Während des Kultivierens wird der pH durch Zugabe von Ammoniak bei 7,0 gehalten und wenn die restliche Glucosekonzentration 1% beträgt, werden 60 ml 60 %ige Glucose mit Unterbrechungen in den Fermentationsreaktor zugegeben. Drei Zugaben von Glucose wurden durchgeführt. Die Gesamtmenge an Glucose, die benutzt wurde, beträgt 170,5 g und die Menge an L-Phenylalanin, die schließlich angesammelt wurde, beträgt 44,3 g/l, was einer Ausbeute von 25,9 % (g/g) an zugesetzter Glucose entspricht. 1 Liter von zellfreiem Kulturmedium wird durch das herkömmliche Verfahren behandelt, um 39,9 Gramm L-Phenylalanin herzustellen.
Beispiel 3
20 Liter des Kulturmediums aus Beispiel 2 werden in einen 50 Liter Fermentationsreaktor gegeben und 15 Minuten lang bei 121°C sterilisiert. Danach wird eine Scale-up-Kultur wie in Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 5 Zugaben von Glucose zu dem Fermentationsreaktor durchgeführt wurden. 207,4 g/l Glucose wird benutzt und die schließlich angesammelte Menge an L-Phenylalanin beträgt 48,7 g/l. Die Ausbeute an L-Phenylalanin betrug 23,5 % (g/g) von zugesetzter Glucose.
Der E. coli-Stamm MWOR 247 ist weiterhin in der Lage bei einem osmotischen Druck einer Lösung von ca. 110 g/l an Sorbitol und/oder ca. 18 g/l an Natriumchlorid eine große Menge an L-Phenylalanin zu produzieren.
Mit dem erfindungsgemäßen E. coli-Stamm lassen sich L-Phenylalanin-Ausbeuten bis zu ca. 50 g/l, insbesondere bis zu ca. 40 g/l, vorzugsweise bis zu 30 g/l, besonders bevorzugt über 20 g/l, insbesondere ca. 20 bis 50 g/l, bevorzugt ca. 20 bis 30 g/l erzielen.
Beispielsweise kann der erfindungsgemäße E. coli-Stamm L-Phenylalanin in einer Menge, die ca. 40 g/l überschreitet, produzieren und/oder eine Resistenz gegen einen osmotischen Druck von bis zu ca. 700 mosmol/kg aufweisen.
Es ist klar, daß die Erfindung, die so beschrieben wurde, auf viele Arten variiert werden kann. Solche Variationen sollen nicht als Abweichung von dem Geist und Umfang der Erfindung betrachtet werden und es ist beabsichtigt, daß alle solche Modifikationen, die einem Fachmann klar sein würden, in dem Umfang der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen beansprucht wird, eingeschlossen sein sollen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Fermentation, welches die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren in einem Kulturmedium des neuen E. coli-Stammes MWOR 247, der als KCCM 10016 hinterlegt ist und welcher eine erhöhte Resistenz gegen osmotischen Druck aufweist und L-Phenylalanin erzeugen kann, und Gewinnen des L-Phenylalanins, das sich im Kulturmedium angesammelt hat.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der osmotische Druck der einer Lösung von ca. 110 g/l Sorbitol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der osmotische Druck der einer Lösung von ca. 18 g/l Natriumchlorid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der osmotische Druck bis zu ca. 700 mosmol/kg beträgt.
Escherichia coli-Stamm MWOR 247, hinterlegt als KCCM 10016, dadurch gekennzeichnet, dass er einerseits L-Phenylalanin in einer großen Menge produziert und andererseits eine erhöhte Resistenz gegen osmotischen Druck aufweist.