DE1642716A1

DE1642716A1 - Verfahren zur Herstellung von Citronensaeure

Info

Publication number: DE1642716A1
Application number: DE19671642716
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kimura; Katsunobu Tanaka; Ken Yamaguchi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-12-28
Filing date: 1967-12-22
Publication date: 1972-01-27
Also published as: CH496806A; BE708607A; US3691012A; GB1187610A; FR1584227A

Description

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Fermentation, bei welchem ein Bakterium, das imstande ist, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren, und das zur Gattung Arthrobacter gehört, in einem wässrigen, η-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Arthrobacter paraffineus ist das bevorzugte Bakterium. Die Zugabe von Calciumcarbonat, Harnstoff, Salzen oder Estern höherer Fettsäuren und Methanol, sowie auch verschiedener Arten von oberflächenaktiven Mitteln zu dem Medium trägt zur Erhöhung der Ausbeute an Citronensäure bei.

109885/0330

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Fermentation. Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren zurilmwandlung von Erdö'1-n-Paraffinen in Citronensäure mit Hilfe von Mikroorganismen.

Die normalerweise bei dem üblichen Citronensäure-Fermentationsverfahren verwendeten Kohlehydrat-Ausgangsmaterialien sind verhältnismäßig teuer. Überdies tritt z.B. bei Verwendung von Endmelassen als Ausgangsmaterial der Nachteil eines ungünstigen Einflusses durch das Hinzumischen von anorganischen Bestandteilen aus dem Ausgangsmaterial auf. '

Citronensäure ist eine bekannte chemische Substanz, die zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten besitzt. Z.B. findet Citronensäure als Ansäuerungsmittel in Getränken, pharmazeutischen Siruparten, Elixiitipzubereitungen, Brausepulvern und -tabletten und dgl. Verwendung. Sie wird verwendet, um den pH-Wert von Nahrungsmitteln einzustellen, sowie als synergistisches Antioxydationsmittel bei der Käseherstellung. Weitere Anwendungsmöglichkeiten bestehen z.B. in ihrer Verwendung als Chelatisierungsmittel zur Entfernung von Spurenmetallen, als Beize zur Aufhellung von Farben, als Reagenz für Albumin, Muein, Glucose und Gallenfarbstoffe usw.. Citronensäure ist außerdem in der Medizin verwendet worden, z.B. als mildes Adstringens.

109885/0330

BAD ORIGINAL

der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, welches die Nachteile und Mängel der Verfahren nach dem bisherigen Stand der Technik überwindet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Fermentation, welches auf einfache und wirksame Art und Weise ausgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Fermentation, welches vorteilhaft im industriellen Maßstab bei niedrigen Kosten und mit hoher Produktausbeute durchgeführt werden kann.

Diese und weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen hervor.

Als Ergebnis von Untersuchungen über die Fermentationsprodukte, die hauptsächlich aus η-Paraffinen durch Anwendung natürlicher, zur Assimilierung von Kohlenwasserstoffen befähigter Bacterien-Isolate erhalten wurden, durchgeführt zu dem Zweck, die Kohlehydrate, die bei Fermentationsverfahren als Ausgangsmaterialien verwendet werden, durch Kohlenwasserstoffe zu ersetzen, wurden von den Erfindern Bakterien gefunden, welohe wesentliche Mengen an L-Glutaminsäure und a-Ketoglutarsäure produzieren. Dementsprechend ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaiiinsäure und a-Ketoglutarsäure aus η-Paraffinen als Ausgangsmaterial entwickelt worden.

109885/0330

AIs ein weiteres Ergebnis der Untersuchung dieser Verfahren im einzelnen in der Absicht, die Anreicherung von Citronensäure in der KuIturflüseigkeit zu erzielen, und zwar ausgehend von der Tatsache, daß auffallend bedeutende Mengen an !-Glutaminsäure und a-Ketoglutarsäure aus n-Paraffinen als Hauptausgangsmaterial angereichert werden, wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die verschiedenen zur Ausnutzung von Kohlenwasserstoffen befähigten Bakterien imstande sind, Citronensäure in einer Fermentationsflüssigkeit unter Verwendung von η-Paraffinen mit 9 bis 30 Kohlenetoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle zu produzieren und anzureichern. Untersuchungen haben gezeigt, daß Citronensäure mit hoher Ausbeute durch Fermentation produziert werden kann, indem man einen zu Arthrobacter paraffineus gehörenden Mikroorganismenstamm verwendet.

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm von Arthrobacter paraffineus wurde aus Boden isoliert. Der Stamm veist folgende bakteriologische Eigenschaften auft

A. Morphologische Eigenschaften.

Bakterienform: normalerweise kurze Stäbchen, Form und Größe unregelmäßig, verzweigte, gebogene und Keulenformen werden bei relativ langen Zellen gefundenf auch kokkenähnliche Formen finden sich. Großes normalerweise 0,5 - 0,8 χ 1 - 3 /U Kokkenähnliohe Zellen 0,6 - 0,8 /U.

109885/0330

Beweglichkeit: nicht beweglich Sporen: keine Bildung.

Säurefest-Färbung (acid-fast staining): nicht säurefest. Gram's Färbung: grampositiv oder -negativ (meist gramnegativ "bei langgestreckten Zellen, und gram-positiv "bei kokkenähnlichen Zellen).

B. Züchtungs-Eigenschaften:

1. Agar-Kolonien: Wachstum reichlich, kreisförmig, glatt, zusammenhängend, blaß gelblich-braun, opak, schimmernd.

2. Schrägagar:Wachstum reichlich, fadenförmig, erhoben oder flach, schimmernd, blaß gelblich-graubraun, butt erähnli ch (butyrous).

3. Nährbrühe: leicht trübe, leichtes flockenartiges Sediment.

C. Physiologische Eigenschaften:

1. Optimale Temperatur: 20° - 30⁰C (geringfügiges Wachstum bei 37⁰C)

2. Optimaler pH-Wert: 6,0 - 8,0

3. Verhalten gegenüber freiem Sauerstoff aerob, fakultativ anaerob.

4. Lackmusmilch: unverändert oder alkalisch.

5. Gelatine-Stichkultur: Verflüssigung: keine

6. Schwefelwasserstoff: negativ

7. Indolproduktion: negativ

8. Hydrolyse von Stärke: negativ

109885/Q330

9. Wirkung auf Nitrat: kein Nitrit

10. Katalase: positiv

11. Urease ι positiv

12. Reichliches Wachstum unter Ausnutzung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle, und Produktion einer erheblichen Menge an L-Glutaminsäure aus η-Paraffinen oder Essigsäure.

13. Erzeugt Säure aus Fructose und Mannit

H. In Falle der Verwendung von Essigsäure oder

η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle in einem Nährmedium nach Hucker kann NH₄HpPO₄ nicht als einzige Stickstoffquelle verwendet werden.

Sie taxonomische Stellung des oben beschriebenen Bakteriums wurde anhand von "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Ausgabe (1957) bestimmt.

Das vorliegende Bakterium gehört zur Familie Corynebaoteriaceae, und zwar aufgrund seiner Stäbchenform sowie der folgenden Eigenschaften; keine Sporenbildung, nicht beweglich» nioht säurefest, grampositiv (gramvariabel), aerob und Verzweigungsmöglichkeit. Zur Familie Corynebacteriaeeae gehören 6 Gattungen: Corynebacterium, Listeria, Erysipelo-

thrix, Microbacterium, Cellulomonas und Arthrobacter. Die Gattung Listeria besteht aus kleinen Stäbchen-Bakterien, die beweglich sind. Die Gattung Erysipelothrix weist lange fadenartige Formen auf. Die Gattung Microbacterium ist wider-

109885/0330

standsfähig gegen Wärme, und die Gattung Cellulomonas besitzt die Fähigkeit, Cellulose zu zersetzen. Demzufolge wird angenommen, daß das vorliegende Bakterium nicht zu diesen Gattungen gehört.

Das vorliegende Bakterium müßte also zur Gattung Corynebacterium oder zur Gattung Arthrobacter gehören. Der vorliegende Stamm ist jedoch ein typisches Bodenbakterium mit gramvariablen und kokkenähnlichen Zellen, welche bei 37⁰C nur spärlich produziert werden. Anhand dieser Tatsachen wird der Stamm der vorliegenden Erfindung als zur Gattung Arthrobacter gehörend eingeordnet.

Unterschiede zwischen Arthrobacter ureafeoiene und ArthrobjKcter terregens, die dem Bakterium der vorliegenden Erfindung am ähnlichsten sind, sowie Arthrobacter parafflneus werden in der folgenden Tabelle aufgezeigt.

109885/0330

Tatelle 1

	Agarkolonien	Arthrobacter	Arthrobacter ]	Arthrobacter	j	keine Verflüssigung	}
	Sehrägagar	paraffineus	ureafaciens	terregens
		blaß gelblich-braun	gelb	gelblich-braun	t negativ	(
	Nährbrühe	fadenförmig, blaß	fadenförmig, gelb	fadenförmig, blaßbraun		ί
		gelbli ch-graubraun			negativ
	Optimale Tempera	leichtes trübes	mäßige Trübung, blaß	mäßige Trübung,
	tur für dae	Sediment	gelbes Sediment	gelbes Sediment	negativ
	Wachstum				I Nitrit
	Sauerstoff-Be	20° - 30⁰C	32⁰C	20° - 26⁰C	positiv
O	dürftigkeit				! negativ	I
co	Gram-Färbung	aerob bis fakulta	aerob	aerob	i gut
co co	Lackmusmilch	tiv anaerob
crt		positiv oder negativ	megativ	negativ oder variabel	i
O	Gelatine-Stich-	unverändert oder		unverändert
U)	kultur	alkalisch
<*>	Schwefelwasser	keine Verflüssigung	Verflüssigung		-t-k An
	stoff
	IndoI-Produktion	negativ	positiv
	Hydrolyse von
	Stärke	negativ	negativ
	Nitrat
	Katalase	negativ	negativ
	urease	kein Nitrit	ί kein Nitrit
	Produktivität von	positiv	positiv
	L-GrIu t aminsäur e	positiv	1 negativ
	aus n-Paraffinen	gut

		,

Der Arthrobacter paraffineus-Stamm der vorliegenden Erfindung wurde bei der American Type Culture Collection in Rockwell, Maryland, hinterlegt und erhielt die ATCC-Katalognummer 15591·

Entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium ist für die vorliegende Erfindung geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Stammes erforderlichen Nährstoffe und, gemäß der vorliegenden Erfindung, einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Derartige Nährstoffe sind in der Technik bekanntf zu ihnen gehören Stoffe wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl., welche durch den verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen ausgenutzt werden.

Die anzuwendende Kohlenstoffquelle umfaßt hauptsächlich Kohlenwasserstoffe und insbesondere η-Paraffine mit

9 bis 30 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt werden aufgrund einer hohen Produktionsausbeute an Citronensäure η-Paraffine mit

10 bis 18 Kohlenstoffatomen. Beispiele dafür sind geradkettige Paraffine (Alkane), wie z.B. n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Ietradecan, n-Pentadecan» n-Eicosan, n-Docosan, n-Tricosan, n-Triacontan usw.. Rohmaterialien, die η-Paraffine enthalten, können ebenfalls wirksam verwendet werden. Mischungen zweier oder mehrerer n-Paraffine können als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Kleine Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie z.B.

109885/Ö330

Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Rohrzucker, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen, usw. können ebenfalls in dem Fermentationsmedium zusammen mit der Kohlewasserstoff verbindung oder den Kohlenwasserstoffverbindungen verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie z.B. Harnstoff oder Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat usw., oder natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, z.B. Maisquellflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysate, Fischmehl usw.. Gemische zweier oder mehrerer dieser Stickstoffquellen können verwendet werden.

Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden können, sind z.B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Natriumchlorid, Eisensulfat, sowie auch andere Üblicherweise verwendete Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, Zink, Calcium und dgl·. Gemische derartiger anorganischer Verbindungen können ebenfalls verwendet werden.

Darüber hinaus sollte zur Erzeugung hoher Citronensäure-Ausbeuten gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Calciumcarbonat zu dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden. Überdies ist die Zugabe von Harnstoff, Salzen oder Estern höherer Fettsäuren, verschiedenen Arten von oberflä- -

109885/0330

chenaktiven Mitteln und Methanol wirksam zur Erhöhung der produzierten Citronensäure-Ausbeute. Es wird in diesem Zusammenhang Bezug genommen auf die schwebende Anmeldung Serial No. 600 402, angemeldet am 9. Dezember 1966, sowie auf die schwebende Anmeldung Serial No. 64-3 832, angemeldet am 6. Juni 1967» hinsichtlich der Typen von oberflächenaktiven Mitteln, die zur Erhöhung der Citronensäure-Ausbeute bei der Ausführung des Fermentationsverfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.

Das zur Erzeugung von Citronensäure erfindungsgemäß angewendete Fermentationsverfahren wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren einer Submerskultur, und bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4O⁰C sowie einem pH-Wert von etwa 4 bis 9 durchgeführt. Nach etwa 3 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden bemerkenswert große Mengen an Citronensäure in dem Züchtungsmedium angereichert gefunden.

Nach Beendigung der Fermentation kann die Citronensäure mit den üblichen Mitteln, wie z.B. Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Chromatographie, Ausfällung, Extraktion oder dgl., von der Fermentationsflüssigkeit abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, jedoch nicht beschränken. Falls nicht anders angegeben, beziehen eich die Proζentangaben in der gesamten Beschreibung auf das Gewicht.

109885/0330

Beispiel 1

20 ml eines Züchtungsmediums mit der folgenden Zusammensetzung (pro Liter Wasser) werden in einem 500 ml-Sakaguchikolben hergestellt:

5,0$ n-Dodeean

0,2$ KH₂PO₄ 0,19^ MgSO₄*7H₂O 0,005$ MnSO₄·4Η₂0 0,02$ PeSO₄-7H₂O 0,5$ NH₄NO₃ 0,1$ Harnstoff

10 mg// Thiamin 3,0$ OaOO₅

Sodann wird 1 ml einer Einsaat-Kulturflüssigkeit von Arthrobacter paraffineus ATCC 15591».die mit Hilfe einer 24 Stunden lang dauernden Schüttelkultur in einem flüssigen Bouillon-Medium bei 30⁰C erhalten worden war, in das Fermentationsmedium eingeimpft. Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 28⁰C 96 Stunden lang durchgeführt.

Die nach Beendigung der Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherte Citronensäuremenge beträgt 10 mg/ml,

Beispiel 2

Die Züchtung wird in demselben Züohtungsmediua, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, durchgeführt, mit der

109885/0330

Abwandlung, daß 0,05$ Tween 40 (Polyoxyäthylensorbitanmono palmitat) zu dem Medium hinzugefügt werden. Die Züchtung wird unter denselben Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 abgegeben worden sind, 96 Stunden lang durchgeführt. Die in der Kulturflüssigkeit angereicherte Citronensäuremenge beträgt 15 mg/ml.

Beispiel 3

3 Liter eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung werden in einem 5 Liter-Jar-Fermenter eingebracht und sterilisiert:

0,2$ KH₂PO₄ 0,1$ MgSO₄- 7H₂O 0,005$ MnSO₄.4H₂O 0,02$ PeSO₄-7H₂O 1,0$ NH₄NO₃ 0,2$ Harnstoff

0,01$ Maisquellflüssigkeit

0,05$ Polyoxyäthylenglycolmonostearat

Der pH-Wert des Mediums ist etwa neutral. Eine Kulturflüssigkeit von Arthrobaoter paraffineus ATCC 15591» die durch Züchtung unter aerobem Schütteln in einem Züchtungsmedium, bestehend aus 1,0$ Fleischextrakt, 1,0$ Pepton, 0,5$ Natriumchlorid und 1,0$ Sorbit, bei einem pH-Wert von 7,2 erhalten worden ist, wird in das Fermentationsmedium in einer Menge von 5$ eingeimpft« Die Züchtung wird sodann bei

109885/0330

-H-

28⁰C und bei einer Rührbewegung von 600 r.p.m. sowie unter Belüftung mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1 Liter steriler Luft pro Minute 72 Stunden lang durchgeführt. Zu Beginn der Züchtung werden 200 ml η-Paraffine mit 12 bis H Kohlenstoffatomen zu dem Züchtungsmedium hinzugefügt.

Die nach Beendigung der Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereichert gefundene Citronensäuremenge beträgt 28 mg/ml. Nach Behandlung der Lösung mit den üblichen Mitteln werden aus ihr 60 g Citronensäure gewonnen.

Beispiel 4

Arthrobacter paraffineus ATCC 15590 wird verwendet; die übrigen Züchtungsbedingungen sind ähnlich wie die in Beispiel 1 verwendeten. Nach 96 Stunden dauernder Züchtung haben sich 9*5 mg Citronensäure pro ml in der Kulturflüssigkeit angereichert.

Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß Variationen innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Citronensäure aus Kohlenwasserstoffen als Hauptausgangsmaterial durch Fermentation möglich sind. So sind z.B. , wie in Beispiel 3 gezeigt wird, Kohlenwasserstoffgemische, die η-Paraffine enthalten, zur Durchführung der Erfindung gut geeignet.

Aus dieser Beschreibung der Erfindung geht hervor, daß dieselbe in vielfacher Hinsicht variiert werden kann.

109885/0330

Derartige Variationen sind keine Abweichungen von Grundidee und Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, und alle solche Modifikationen sollen in den Bereich der folgenden Patentansprüche fallen.

Claims

Patentansprüche j

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium, das imstande ist, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren, und das zur Gattung Arthrobacter gehört, in einem wässrigen, η-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, und daß man Citronensäure in der entstehenden Kulturflüssigkeit anreichert und daraus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Arthrobaoter paraffineus verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Arthrobacter paraffineus ATCG 15591 verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Arthrobacter paraffineus ATCC 15590 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

109885/0330

—1b-

daß nan die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 4 bis 9 ausführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man n-Faraffine verwendet, die 9 bis 30 Kohlenstoffatome enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man η-Paraffine verwendet, die 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hährmediuii verwendet, welches außerdem ein oberflächenaktives Mittel enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hährmedium verwendet, welches außerdem mindestens einen Zusatzstoff enthält, der Galciumcarbonat, ein Salz oder Ester einer höheren Fettsäure oder Methanol sein kann.

10. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Arthrobacter paraffineus in einem wässrigen, mindestens ein η-Paraffin mit 9 bis

30 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, und daß man Citronensäure in der entstehenden Kulturflüssigkeit anreichert und daraus gewinnt. ,

11.

109885/0330

11. Verfahren nach Anspruch 10» dadurch gekennzeichnet, daß nan die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4O⁰O und einem pH-Wert von etwa 4 bis 9 ausführt.

12. Verfahren nach Anspruch 11» dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Arthrobaeter paraffineus

AOiCO 15591 verwendet.

13· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daS nan als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ™ ATCO 15590 verwendet.

14. Verfahren a&ch Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, welches außerdem Calciumcarbonat enthält·

15· Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hährmedium verwendet, welches außerdem mindestens ein Polyoxyäthylenoberfläohenaktives Mittel enthält.

16. Verfahren ßaeh iiiapruefe 9* iaßureh gekennzeichnet, ' daß man ein Rohmaterial» welehes n~Paraffine mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomen enthält, als Kohlenstoffquelle in dem Hfthmediua verwendet.

109885/0330