-
Verfahren zur fermentativen Herstellung von 1-Glutaminsäure Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure aus Glucose oder einer
ähnlichen Substanz nach einem biochemischen Verfahren.
-
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure bekannt,
bei denen jedoch stets die racemische Säure, und zwar dl-Glutaminsäure, als Endprodukt
erhalten wird, die für die meisten Zwecke in die optisch aktiven Isomeren getrennt
werden muß. Wegen dieser Schwierigkeit sind daher chemische Herstellungsverfahren
im großtechnischen Maßstab nicht verwendet worden. Wenn nur 1-Glutaminsäure hergestellt
werden soll, wie sie gewöhnlich bei der Herstellung von Nahrungsmittelzusätzen verwendet
wird, werden weitaus vorteilhafter Mikroorganismen zum Umwandeln verschiedenartiger
Ausgangsmaterialien nach enzymatischen Verfahren benutzt. Auch hier sind zahlreiche
Verfahren bekannt, bei denen eine Anzahl von Ausgangsmaterialien und verschiedenartige
Mikroorganismen verwendet werden.
-
Ausgehend von der fermentativen Herstellung von 1-Glutaminsäure durch
aerobe Züchtung von Mikroorganismen in Kohlehydrat- und Stickstoffhaltigen Nährmedien
bei hierfür üblichen pH-Werten wurde nun gefunden, daß man 1-Glutaminsäure in höheren
Ausbeuten herstellen kann, wenn man als Mikroorganismen Corynebakterium lilium NRRL
B-2243 oder Corynebakterium callunae NRRL B-2244 einsetzt.
-
Ein Kohlenhydratausgangsmaterial kann mittels dieser Mikroorganismen
durch eine einzige Gärungsstufe unter milden Bedingungen in einer Ausbeute von etwa
7519/o der Theorie oder mehr in 1-Glutaminsäure umgewandelt werden.
-
Die zwei Bakterienstämme, die bei dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen
Verfahren verwendet werden können, sind von dem United States Department of Agriculture,
Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, in die
für dauernd unterhaltene Sammlung von Mikroorganismen aufgenommen worden. Diese
Stämme und ihre Identifizierungsnummern sind: Corynebaeterium lilium NRRL B-2243,
Corynebacterium callunae NRRL B-2244.
-
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein geeignetes Medium, das
auf einen pH-Wert zwischen 5 und 9 eingestellt ist, mit etwa 0,5 bis 10 Volumprozent
oder mehr, vorzugsweise mit etwa 1 bis 3 % einer Kultur des zu verwendenden Mikroorganismus
angeimpft, belüftet und bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40° C und vorzugsweise
zwischen 25 und 35° C vergoren. Bei Beginn der Gärung wächst der Organismus eine
Zeitlang schnell; und wenn der pH-Wert nicht durch Zugaben von Calciumcarbonat,
Ammoniak oder eines anderen schwach basischen, nichtgiftigen Alkalis oder einer
Puffersubstanz aufrechterhalten wird, fällt er schnell und erreicht einen Wert von
etwa 4 bis 4,5. Zur Vermeidung eines übermäßigen Schäumens können gegebenenfalls
Antischaummittel zugesetzt werden. Das Wachstum erreicht gewöhnlich in etwa 10 bis
20 Stunden den größten Wert und wird dann geringer. Wenn das größte Wachstum etwa
erreicht ist, erfolgt die Anreicherung der 1-Glutaminsäure in dem Medium. Während
der Anreicherung der 1-Glutaminsäure sollte der pH-Wert des Mediums auf einem Wert
zwischen etwa 5,5 und 8,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6 und 7,5 gehalten werden.
Die Gärung wird gewöhnlich so lange fortgesetzt, bis die Anreicherung der 1-Glutaminsäure
den größten Wert erreicht hat, und wird dann abgebrochen.
-
Ein zufriedenstellendes Medium für das aktive Wachstum von Corynebacterium
lilium NRRL B-2243 oder Corynebacterium callunae NRRL B-2244 und für die Herstellung
von 1-Glutaminsäure enthält neben Wasser, einen geeigneten Zucker, eine
Stickstoffquelle,
Magnesium, Kalium, Phosphat, zusätzliche Wachstumfaktoren und gegebenenfalls Spurenelemente.
Zu zusätzlichen Wachstumsfaktoren gehören Biotin, Biotinstammsubstanzen und/oder
andere bekannte Substanzen, die die gleiche Wirkung wie Biotin ausüben. Das Medium
kann auch ein schwaches, nichtgiftiges Alkali oder eine Puffersubstanz zwecks Einstellung
und Aufrechterhaltung des pH-Wertes enthalten. Ein solches Medium kann die folgende
Zusammensetzung haben:
| Geeigneter Bereich Vorzugsweise |
| verwendeter Bereich |
| Zucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 1 bis 10 Gewichtsprozent 2,5 bis 7,5 Gewichtsprozent |
| (NH4)2S04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0,5 bis 5 0/0 1 bis 3 % |
| Biotin . . . .. . . . .. . . . .. . ... . ... . . . . . . .
. .. . . . 0,1 bis 2,0 y/l 0,2 bis 1y/1 |
| KEHP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 0,01 bis 10/0 0,05 bis 0,4% |
| MgS04 " 7 HQO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 0,05 bis 0,3 % 0,1 bis 0,2% |
| CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 1 bis 10% 2 bis 5 0/0 |
Das Medium kann also Glucose, Rohrzucker, Fructose, Maltose oder andere geeignete
Zucker; dann Ammoniak, Harnstoff oder andere entweder organische oder anorganische
Stickstoffquellen enthalten.
-
Zu den sogenannten »Spurenelementen« gehören gewöhnlich Mangan, Eisen,
Zink, Kobalt, Kupfer und gegebenenfalls andere Elemente. Die Wirkungsweise dieser
Materialien ist nicht genau bekannt, und deren Notwendigkeit und Mengenanteile sind
noch nicht genau erforscht. Meist sind diese Materialien nur in Spuren erforderlich,
wobei solche Mengen gewöhnlich in den zur Herstellung der Gärungsmedien verwendeten
Materialien enthalten sind.
-
Die Zusammensetzung der Gärungsmedien kann selbstverständlich in verschiedener
Weise verändert werden, wobei dennoch eine zufriedenstellende Bildung von 1-Glutaminsäure
erzielt wird. Als Zucker kann z. B. »Cerelose« verwendet werden, und zwar ist dieses
Material Glucosemonohydrat, das durch saure Hydrolyse von Maisstärke hergestellt
worden ist. Nach einer anderen Arbeitsweise kann ein Invertzuckergemisch verwendet
werden, das nach einem bekannten Verfahren durch saure Inversion von Rohrzucker
hergestellt worden ist. Es können auch verschiedenartige Ammoniumverbindungen verwendet
werden, zu denen das Hydroxyd, Chlorid, Sulfat, Phosphat u. dgl. gehören. Stickstoff
und Phosphat können als Ammoniumphosphat zusammen oder gegebenenfalls auch getrennt
zugesetzt werden. Auch andere Kalium-, Magnesium- und Phosphatsalze können selbstverständlich
verwendet werden. Das Einstellen und/oder Aufrechterhalten des pH-Wertes kann mit
praktisch jedem alkalischen Material erfolgen, das den Verlauf der Gärung nicht
beeinträchtigt.
-
Der zusätzliche Wachstumsfaktor kann in Form des reinen Biotins, einer
dem Biotin gleichwertigen Substanz (und zwar einer Substanz, die die biologische
Wirkung von Biotin besitzt) oder in Form einer Biotinstammverbindung (d. h. einer
Substanz, die unter den Gärungsbedingungen Biotin oder eine dem Biotin gleichwertige
Substanz liefert) zugesetzt werden. Zu geeigneten Quellen für den zusätzlichen Wachstumsfaktor
gehören Fleichextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Rübenmelassen, Zuckerrohrmelassen
oder ein handelsübliches Produkt, das am Tag der Anmeldung unter dem Warenzeichen
»Protopepton Nr. 366« von der Firma Wilson & Company vertrieben wurde.
Zufriedenstellende Ergebnisse werden z. B. erhalten, wenn etwa 0,2% Fleischextrakt
zusammen mit etwa 0,2% Pepton oder nach einer anderen Arbeitsweise 0,2% »Protopepton
Nr. 366« verwendet werden.
-
Die Konzentration des unterstützenden Wachstumsfaktors in dem Gärungsmedium
ist wesentlich. Die Anreicherung von 1-Glutaminsäure in der Gärflüssigkeit erreicht
innerhalb einer kürzesten Zeit den größten Wert, wenn die Konzentration des unterstützenden
Wachstumsfaktors zwischen etwa 0,1 und 1,5 y Biotin je Liter liegt, während die
Anreicherung bei niedrigeren oder höheren Biotinäquivalentwerten weitaus geringer
ist und/oder langsamer verläuft. Diese Wirkung wird in den Ausführungsbeispielen
7 und 8 erläutert. Da bestimmte natürlich vorkommende Ausgangsmaterialien wie Rübenmelassen,
Zuckerrohrmelassen, Maisquellwasser und ähnliche Materialien geringe Mengenanteile
von Biotin und/oder biotinartigen Substanzen enthalten, müssen diese Mengenanteile
bei der Herstellung eines solchen Materialien enthaltenden Gärungsmediums berücksichtigt
werden.
-
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen erreichen innerhalb
von etwa 10 bis 20 Stunden den bzw. in einer längeren Zeit unter gewöhnlichen Gärungsbedingungen
(20 und 40° C, vorzugsweise zwischen etwa 25 und 35° C) das größte Wachstum, worauf
deren Anzahl schnell geringer wird. Während dieses aktiven Wachstums ist die Anreicherung
von 1-Glutaminsäure verhältnismäßig so gering, daß die Konzentration an 1-Glutaminsäure
vor dem Ablauf von 24 Stunden einen Wert von 10 mg/ccm gewöhnlich nicht erreicht.
Nach dieser Zeit erfolgt eine schnelle Anreicherung von 1-Glutaminsäure und erreicht
in etwa 50 bis 100 Stunden und oft auch in einer kürzeren Zeit den größten Wert.
Die Vergärung wird unter einer wirksamen Belüftung, die durch Schütteln, Rühren,
Einleiten von Luft od. dgl. erzielt werden kann, durchgeführt werden, so daß eine
Sauerstoffabsorptionsgeschwindigkeit von mindestens etwa 0,1 Millimol je Liter des
Mediums je Minute erzielt wird.
-
Die nach dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren erhaltene Gärflüssigkeit
enthält gewöhnlich nicht nur 1-Glutaminsäure, sondern als Nebenprodukte auch andere
Aminosäuren, wie 1-Alanin, 1-Leucin, 1-Valin, 1-Glutamin u. dgl., die nach bekannten
Verfahren, so z. B. durch Ionenaustauscher, abgetrennt werden können. Das molare
Verhältnis von 1-Glutamin zu 1-Glutaminsäure kann gegebenenfalls bis zu etwa 1:4
betragen.
-
Die Gewinnung von 1-Glutaminsäure aus der Gärflüssigkeit kann nach
üblichen Verfahren erfolgen, die nur wenig oder gar nicht abgeändert werden
müssen.
Die Flüssigkeit wird zunächst zwecks Entfernung suspendierter Festbestandteile filtriert.
Sie kann dann zwecks Entfernung von Schleimen oder zwecks Verringerung der Konzentration
dieser Schleime nach verschiedenen Verfahren behandelt werden. So kann sie z. B.
mit einem geringen Mengenanteil von Tannin oder Alkalilignin nach Verfahren behandelt
werden, die in den USA.-Patentschriften 2 487 785 und 2 487 807 beschrieben worden
sind. Nach einem anderen, in der USA.-Patentschrift 2 796 433 beschriebenen Verfahren
kann die Flüssigkeit bis zu einem Festbestandteilgehalt von etwa 25 bis 45 Gewichtsprozent
konzentriert und dann mit einem geringen Mengenanteil von Bariumchlorid, Bariumhydroxyd
oder einer ähnlichen Substanz bei einem pH-Wert oberhalb von 7 zwecks Abscheidung
organischer Verunreinigungen behandelt werden. Die gereinigte Flüssigkeit wird dann
bis zu einem Festbestandteilgehalt von etwa 80 bis 85 % konzentriert, bei einem
pH-Wert von 5 bis 6 entsalzt und dann weiter konzentriert, worauf der pH-Wert der
Flüssigkeit mit Schwefelsäure, Salzsäure od. dgl. auf etwa 3,2 eingestellt wird,
wobei die 1-Glutaminsäure in guten Ausbeuten auskristallisiert.
-
Die bei dem vorgeschlagenen Verfahren verwendeten Mikroorganismen,
Corynebacterium lilium NRRL B-2243 und Corynebacterium callunae NRRL B-2244, werden
gewöhnlich auf üblichen TGY-Agarhängen (Trypton-Glucose-Hefeextrakt) gehalten. Bei
der Herstellung einer geeigneten Impfkultur wird ein Hang in ein Reagenzglas übergeführt,
das 10 ccm einer Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Brühe enthält, und dort 15 bis 30 Stunden
bei einer Temperatur von 28 bis 30° C in einer sich drehenden Schüttelvorrichtung
bebrütet. Aus der erhaltenen Kultur wird ein Anteil von 2 bis 10 ccm in einen 500
ccm fassenden Kolben, der 100 ccm der Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Brühe enthält,
übergeführt, worauf das Gemisch unter den oben angegebenen Bedingungen bebrütet
und dabei eine geeignete Impfkultur erzeugt wird.
-
Die bei dem vorgeschlagenen Verfahren verwendeten Bakterienstämme
Corynebacterien lilium NRRL B-2243 und Corynebacterien callunae NRRL B-2244 gehören
nicht zu einem der Corynebakterien, die bereits bekannt sind.
-
Besonders wirksam ist das Corynebaeterium lilium NRRL B-2243. Dieser
Mikroorganismus besteht aus kurzen, pleomorphen, grampositiven Stäben, von denen
einige becherförmig und andere mit metachromatischen Körnchen getüpfelt oder gebändert
sind, wenn sie einer bipolaren Färbung ausgesetzt werden. In Brühenkulturen sind
die jüngeren Organismen (Alter 18 Stunden oder weniger) häufig gramnegativ, während
ältere Kulturen gewöhnlich grampositiv sind. Die Organismen sind nicht beweglich,
und Geißeln sind nicht beobachtet worden. Eine Sporenbildung ist nicht gefunden
worden. Auf Nährstoffagar zeigen die Organismen innerhalb von 24 Stunden bei 30°
C ein mäßiges Wachstum, bei dem sahneartige, weiße Kolonien mit trockenen, faltigen,
stumpfen, wellenförmigen Kanten gebildet werden. Auf einem Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Agarmedium
wachsen diese Organismen gut und bilden eine glitzernde, filigranartige Kultur.
Die Kolonien sind kreisförmig, vollständig, leicht gebuckelt und gelb, wenn sie
im Licht gezüchtet werden, und sahneartig weiß bis leicht gelblich, wenn sie im
Dunkein gezüchtet werden. Die Organismen haben die folgenden physiologischen Eigenschaften:
1. Die beste Temperatur für die Bildung von 1-Glutaminsäure liegt zwischen 25 und
35° C. Gutes Wachstum bei Temperaturen bis zu 37° C, geringes bei 40° C.
-
2. pH-Bereich 5 bis 9; bester Bereich 6,0 bis 8,5. 3. Aerob.
-
4. Erzeugt Säure, aber kein Gas aus Dextrose, Fructose, Maltose, Rohrzucker,
Mannose, Galaktose (Spur, wieder alkalisch werdend in 72 Stunden), Trehalose (Spur,
stark positiv werdend in 2 bis 3 Wochen), Inulin (Spur bis schwach positiv, negativ
werdend in 2 Wochen), Mannit (Spur bis schwach positiv, veränderlich) und Inosit
(Spur bis schwach positiv, veränderlich), (Bromthymolblau-Indikator).
-
5. Erzeugt keine Säure bzw. kein Gas aus Arabinose, Lactose, Raffinose,
Dulcit, Salicin, Rhamnose, Sorbose, Melibiose, Melizitose, Xylose, Adonit, Glycerin,
Sorbit, Dextrin und stärke (Bromthymolblau-Indikator).
-
6. Verflüssigt nicht Gelatine. 7. Erzeugt kein Indol.
-
B. Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
-
9. Erzeugt kein Acetylmethylcarbinol (Voges-Proskauer-Versuch).
-
10. Methylrot: zweifelhaft. 11. Citrat schwach positiv. 12. Katalyse
positiv.
-
13. Urease positiv.
-
14. Lackmusmilch; keine Veränderung in 14 Tagen; alkalisch nach 25
Tagen; kein Abbau.
-
15. Nitratreduktion positiv.
-
Corynebakterium callunae NRRL B-2244 zeigt im wesentlichen die gleichen
charakteristischen Reaktionen wie Corynebacterium lilium NRRL B-2243, bewirkt jedoch
keine Nitrareduktion. Corynebacterium callunae NRRL B-2244 unterscheidet sich weiter
darin, daß es Säure, aber kein Gas (ohne Reversion bzw. Umkehrung) aus Galaktose,
Raffinose und Salicin erzeugt und einen stark positiven Methylrottest (pH 5,0) ergibt.
-
In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die vorliegende Erfindung
näher erläutert.
-
Beispiel 1 Es wurde ein Gärungsmedium mit der folgenden Zusammensetzung
hergestellt:
| »Cerelose« ............. 5% |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . - 2% |
| Fleischextrakt ......... 0,2% |
| Pepton ................ 0,2% |
| K,HPO4 . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0 |
| MgS04 - 7 H,0 . . . . . . . . . 0,1% |
| CaCO'3 ................ 2% |
| Wasser . ........ . . . . ... Restmenge |
Ein Anteil von 50 ccm dieses Mediums wurde sterilisiert, mit 2 Volumprozent einer
Trypton- Glucose-Hefeextrakt-Kultur von Corynebacterium lilium NRRL B-2243 -angeimpft
und in einem 250 ccm fassenden Erlenmayerkolben bei einer Temperatur
von
30° C in einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Nach 5 Tagen enthielt
die Gärflüssigkeit 36,2 mg 1-Glutaminsäure je Kubikzentimeter, was nach dem 1-Glutaminsäuredecarboxylaseverfahren
bestimmt wurde und einer Glucoseumwandlung von 97% der Theorie entsprach.
-
Beispiel 2 Wenn das im Beispiel l beschriebene Verfahren im wesentlichen
wiederholt, jedoch als Zucker Rohrzucker an Stelle von »Cerelose« verwendet wird,
wird eine Gärflüssigkeit erhalten, die nach 5 Tagen 32,0 mg 1-Glutaminsäure je Kubikzentimeter
enthält, was einer theoretischen Rohrzuckerumwandlung entspricht.
-
Beispiel 3 Wenn das im Beispiel l beschriebene Verfahren im wesentlichen
wiederholt, jedoch an Stelle von »Cerelose« Fructose als Zucker verwendet wird,
wird eine Gärflüssigkeit erhalten, die 11,8 mg 1-Glutaminsäure je Kubikzentimeter
nach 72 Stunden enthält, was einer Fructoseumwandlung von 2911/o der Theorie entspricht.
-
Beispiel 4 Bei einem weiteren Versuch, bei dem an Stelle von »Cerelose«
Mallose als Zucker und 100 ccm des Gärmediums in einem 500 ccm fassenden Kolben
verwendet wurden, bei' dem jedoch die anderen im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensbedingungen
befolgt wurden, wurde eine Gärflüssigkeit erhalten, die nach 66,5 Stunden 14,4 mg
1-Glutaminsäure je Kubikzentimeter enthielt, was einer Maltoseumwandlung von 34'%
der Theorie entsprach.
-
Beispiel 5 Bei einem weiteren Versuch, bei dem das im Beispiel 1 beschriebene
Verfahren praktisch wiederholt, jedoch an Stelle von Fleischextrakt und Pepton 0,8%
Rübenmelasse verwendet wurden, wurde eine Gärflüssigkeit erhalten, die nach 72 Stunden
25,4 mg 1-Glutaminsäure je Kubikzentimeter enthielt.
-
Beispiel 6 Ein Anteil von 100 ccm des Mediums mit der in Beispiel
1 angegebenen Zusammensetzung wurde mit 2 Volumprozent Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Kultur
von Corynebacterium callunae NRRL B-2244 angeimpft und dann in einem 500 ccm fassenden
Kolben bei einer Temperatur von 30° C in einer sich drehenden Schüttelvorrichtung
vergoren. Bei der Analyse der Gärflüssigkeit zwecks Bestimmung des Gehalts an 1-Glutaminsäure
wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
| Gärungszeit Konzentration |
| von 1-Glutaminsäure |
| Stunden mg/ccm |
| 34 4,1 |
| 71 10,0 |
| 93,5 10,2 |
Beispiel 7 Die folgenden Versuche erläutern die Beziehungen zwischen der Anreicherung
von 1-Glutaminsäure und dem Biotingehalt in dem Gärmedium. Die Gärversuche wurden
im allgemeinen nach dem im Beispiel l beschriebenen Verfahren durchgeführt, nur
wurden Pepton und Fleischextrakt durch die angegebenen Mengen von Biotin ersetzt.
Die unten angegebenen Ergebnisse zeigen nach 72 Stunden eine größte Anreicherung
von 1-Glutaminsäure bei etwa 0,5 y Biotin je Liter.
| Biotingesamtgehalt Konzentration |
| von 1-Glutaminsäure |
| y/1 mg/ccm |
| 0,0 8,6 |
| 0,1 10,8 |
| 0,2 1.3,6 |
| 0,5 25,0 |
| 0,8 22,0 |
| 1,0 21,2 |
| 1,2 17,0 |
| 1,5 10,2 |
Beispiel 8 Die folgenden Versuche, die nach dem im Beispie17 beschriebenen Verfahren
durchgeführt wurden, erläutern näher die Beziehungen zwischen der Anreicherung der
1-Glutaminsäure und dem Biotingehalt in dem Gärungsmedium und zeigen, daß die größte
Geschwindigkeit der Anreicherung bei einer Konzentration von 0,6 y Biotin je Liter
erzielt wird.
| Biotin- |
| gesamt- Konzentration von 1-Glutaminsäure, mg/ccm, nach |
| gehalt |
| y/1 24 Stunden 1 48 Stunden j 72 Stunden
122 Stunden* |
| 0 0,6 4,6 6,4 0,9 |
| 0,4 4,2 10:8 18,2 22,0 |
| 0,5 4,1 13,4 j 20,2 23,8 |
| 0,6 5,3 15,8 23,0 28,2** |
| 0,7 4,2 14,8 24,0 25,2 |
| 1,0 1,6 9,8 18,4 23,0 |
| 1,5 0,8 6,2 13,8 19,6 |
| * Wegen der Verdampfungsverluste korrigiert. |
| ** Einer Umwandlung von 75 % der Theorie entsprechend. |
Beispiel 9 Die folgenden Angaben zeigen, daß der optimale Mengenanteil der Anstellkultur
etwa 2 Volumprozent beträgt, wenn diese nach dem vorzugsweise verwendeten Verfahren
hergestellt worden ist. Die Versuche wurden im wesentlichen nach dem im Beispiel
1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
| Menge der Konzentration von 1-Glutaminsäure |
| Anstellkultur mg/ccm |
| % Nach 48 Stunden I Nach 6 Tagen |
| 0,1 8,5 17,2 |
| 0,5 10,4 20,4 |
| 1,0 12,8 23,0 |
| 2,0 16,8 25,6 |
| 4,0 13,8 24,8 |
| 8,0 6,0 12,1 |
Beispiel 10 Eine Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Agarhangkultu: vcn
Corynebacterium lilium NRRL B-2243 wurde auf 10 ccm einer Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Brühe
in einem Reagenzglas übertragen und bei einer Temperatur von 30° C unter Schütteln
16,5 Stunden bebrütet. Die erhaltene Kultur wurde in einer Konzentration von 2 Volumprozent
einer größeren Menge einer Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Brühe zugesetzt, die dann
zwecks Erzeugung einer Anstellkultur 15,75 Stunden bei einer Temperatur von 30°
C bebrütet wurde.
-
Ein Gärungsmedium wurde dann aus Ausgangslösungen mit den folgenden
Zusammensetzungen hergestellt:
| Lösung A |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . 20 g |
| Fleischextrakt .................. 2 g |
| Pepton ......................... 2 g |
| MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g |
| K2HPO4 ....................... 1 g |
| CaCO3 ......................... 20 g |
| Wasser ........................ 500 ccm |
| Lösung B |
| Cerelose ....................... 54,0 g |
| Wasser auf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500 ccm |
Die Lösungen A und B wurden sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen vermischt.
Das erzeugte Medium, das einen pH-Wert von 8,0 aufwies, wurde mit 2 Volumprozent
der Impfkultur angeimpft und bei einer Temperatur von 28° C in einem 141 fassenden
Gefäß vergoren, das mit einem Rührer versehen war, der mit 300 Umdrehungen je Minute
betrieben wurde. Durch ein in der Nähe des Bodens der Flüssigkeit angeordnetes Einlaßrohr
wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 121 je Minute eingeleitet. Zwecks Unterdrückung
des Schäumens wurde bei Bedarf ein Silikonantischaummittel zugesetzt. In bestimmten
Zeitabständen wurden von der Gärflüssigkeit Proben abgenommen, deren Gehalt an 1-Glutaminsäure
nach dem 1-Glutaminsäuredecarboxylaseverfahren bestimmt wurde.
-
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden drei Gärversuche durchgeführt,
bei denen 4, 6 bzw. 81 des Gärmediums verwendet wurden. Dabei wurden die folgenden
Ergebnisse erhalten:
| Volumen des Mediums, 1 |
| 4 ( 6 1 8 |
| Luftgeschwindigkeit, I/Min. |
| 3 1 2 1 1,5 |
| Gehalt an 1-Glutaminsäure, mg/ccm |
| 24 Stunden 8,7 7,0 8,2 |
| 36 Stunden 12,0 13,2 15,6 |
| 48 Stunden 16,4 17,2 22,2 |
| 60 Stunden 21,4 19,8 23,4 |
| 70 Stunden 22,8 20,8 1 22,4 |
| 89 Stunden 26,4 j 23,6 1 23,4 |
Beispiel 11 In dem folgenden Beispiel wird die Herstellung von 1-Glutaminsäure aus
»Cerelose« bei einem pH-Wert von 6,9 erläutert.
-
Ein Gärmedium wurde aus Ausgangslösungen mit der folgenden Zusammensetzung
hergestellt:
| Lösung A |
| Cerelose ....................... 165 g |
| MgS04 - 7H.20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g |
| CaC12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3
g |
| Wasser auf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1500 ccm |
| Lösung B |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . 30 g |
| K2HP04 ................. ... 3 g |
| Pepton ........................ 3 g |
| Fleischextrakt .................. 3 g |
| Wasser ........................ 1500 ccm |
Die Lösungen wurden in Autoklaven getrennt sterilisiert, miteinander vermischt,
mit 2% einer Trypton-Glukose-Hefeextrakt-Kultur von Corynebacterium lilium NRRL
B-2243 angeimpft und bei einer Temperatur von 30c C vergoren, wobei die Lösung mit
einem Rührer, der mit 400 Umdrehungen je Minute betrieben wurde, gerührt und mit
21 Luft je Minute belüftet wurde. Zwecks Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 6,9
wurden entsprechende Anteile einer konzentrierten Ammoniumhydroxydlösung zugesetzt,
wobei 150 ccm dieser Lösung innerhalb einer Gärungszeit von 52 Stunden verbraucht
wurden. Zwecks Unterdrückung des Schäumens wurde bei Bedarf ein Silikonantischaummittel
zugesetzt. Bei der in Abständen vorgenommenen Untersuchung der Gärflüssigkeit wurden
die folgenden Ergebnisse erhalten:
| Gärungszeit Konzentration von |
| Stunden 1-Glutaminsäure, mg/ccm |
| 10,5 2,2 |
| 19 7,5 |
| 24 9,0 |
| 28 16,8 |
| 36 23,2 |
| 47 19,2 |
| 52 22,0 |
Beispiel 12 In dem folgenden Beispiel wird die Verwendung eines Mediums erläutert,
das Harnstoff als Stickstoffquelle enthält. -Ein Medium wurde aus Ausgangslösungen
mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt:
| Lösung A |
| Cerelose ....................... 55 g |
| MgS04 . 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g |
| Bromkresolblau ................ 10 mg |
| CaCO3 ........................ 20 g |
| Wasser ........................ 500 ccm |
| Lösung B |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . 10 g |
| K2HHP04 ....................... 19 |
| Harnstoff ...................... 1 g |
| Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g |
| Wasser ........................ 500 cem |
Die Lösungen A und B wurden getrennt sterilisiert und dann miteinander vermischt,
wobei die verwendeten Mengen derart bemessen wurden, daß 31 des fertigen Mediums
erhalten werden. Das Medium wurde mit 1 Volumprozent einer Trypton-Glucose-Hefeeatrakt-Kultur
von Corynebacterium lilium NRRL B-2243 geimpft und dann in einem 41 fassenden Gefäß
bei einer Temperatur von 30° C vergoren. Das Medium wurde mit 180 Umdrehungen je
Minute gerührt, mit 21 Luft je Minute belüftet und in Abständen mit einer 20%igen
wäßrigen Lösung von Harnstoff auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt. Bei der
in Abständen vorgenommenen Untersuchung der Gärflüssigkeit wurden die folgenden
Ergebnisse erhalten:
| Gärungszeit Konzentration |
| von 1-Glutaminsäure |
| Stunden mg/ccm |
| 24 2,2 |
| 32 3,6 |
| 48 8,2 |
| 84 14,0 |
| 96 16,4 |