DE2633451C3 - Herstellung von Bakterienzellmasse - Google Patents

Herstellung von Bakterienzellmasse

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DE2633451C3 DE2633451A DE2633451A DE2633451C3 DE 2633451 C3 DE2633451 C3 DE 2633451C3 DE 2633451 A DE2633451 A DE 2633451A DE 2633451 A DE2633451 A DE 2633451A DE 2633451 C3 DE2633451 C3 DE 2633451C3
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Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung der Erfindung.
Die erfindungsgemäß hergestellte Bakterienzellmasse hat einen hohen Anteil an Protein und daneben Fette, Kohlenhydrate und Vitamine enthält. Die Zellmasse dient als Grundsubstanz für Futtermittel und Nahrungsmittel.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse mittels Bakterienstämme, die auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelie wachsen, führen oft zu Produkten, die Farbstoffe, Schleime oder unerwünschte Reservestoffe wie Polyhydroxybuttersäure enthalten, wodurch ihre Eignung als Futter- oder Nahrungsmittel stark beeinträchtigt wird. Geruch, Geschmack oder toxische Eigenschaften solcher Begleitstoffe können eine einschlägige Verwendung verbieten.
Es wurde nun ein neuer Stamm der Gattung Methylomonas gefunden, der als Kohlenstoffquelle Methanol, Methan oder Dimethylamin verwenden kann. Dieser Stamm wurde als Methylomonas clara bestimmt und bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 31226 hinterlegt.
Das Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse gemäß der Erfindung durch Züchten von Bakterien der Gattung Methylomonas unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium enthaltend, Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen und essentielle Mineralsalze, ist also dadurch gekennzeichnet, daß man Methylomonas clara ATCC 31226 bei einer Konzentration an Methanol zwischen 5 und 150 ppm, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums, züchtet.
Vorzugsweise züchtet man bei einer Methanolkonzentration zwischen 10 und 50 ppm, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums.
Das Verfahren wird in gut belüfteten Fermentationsbehältern durchgeführt, welche ein Nährmedium enthalten, das neben Methanol als einziger Kohlenstoffquelle Salze wie Kaliumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat oder Ammoniak als Stickstoffquelle enthalten. Außerdem enthält es Phosphate wie Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat sowie Magnesium- und Kalium-Salze; außerdem Spurenelemente, wie sie z. B. im Leitungswasser enthalten sind, so insbesondere Eisen-, Kupfer- und Molybdänsalze.
Das Verfahren wird zweckmäßig bei Temperaturen zwischen 30 und 42° C, am besten zwischen 35 und 39° C durchgeführt.
20
35 Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in bekannten Fermentationsbehältern, z.B. in luftdurchströmten Rührkesseln oder auch in moderneren Feraientern wie Schlaufenreaktoren in diskontinuierlichem oder kontinuierlichem Betrieb durchgeführt werden.
Das flüssige Nährmedium im Fermentationsbehälter wird mit 0,1 bis 1,5 Liter Luft pro Liter Nähnnedium und Minute (wm) belüftet
Die einzuhaltende Methanolkonzentration kann kontinuierlich durch verschiedene Maßnahmen gesteuert werden, z. B. durch Messung des Stickstoffverbrauchs, des Anteils der Bakterienzellmasse in der Suspension oder zweckmäßig durch Messung des Kohlendioxydausstoßes. Hierdurch wird eine genaue Dosierung der Methanolzugabe mit schneller Reaktion auf den bei Kohlenstoffmangel absinkenden Kohlendioxydausstoß möglich. Diese Steuerung kann mit besonderem Vorteil auch über die Messung des gasförmigen Methanols mittels eines Flammenionisationsdetektors erfolgen.
Der pH-Wert der Kultursuspension, welche aus dem Nährmedium und der wachsenden Bakterienzellmasse besteht, liegt zweckmäßig zwischen 4,0 und 9,0, am besten zwischen 6,0 und 7,2. Wenn der pH-Wert der Kultursuspension unter den vorgeschriebenen Wert sinkt, wird eine entsprechende Menge Alkali, z. B. Natronlauge oder Kalilauge zugegeben. Ein zu hoher pH-Wert wird durch Zugabe von Säure, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, reguliert.
Die Abtrennung der Bakterienzeiimasse erfolgt in üblicher Weise, z. B. durch Zentrifugieren unter mehrmaligem Waschen mit Wasser. Dabei können Dekanter und Separatoren Verwendung finden. Man erhält so eine pastenartige Bakterienzellmasse, die noch 75 - 90 Gew.-% Wasser enthält.
Die Trocknung kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Walzentrocknung, Wirbelbetttrocknung oder Sprühtrocknung. Das so getrocknete Produkt enthält lediglich 1 -4 Gew.-% Wasser und 80-90 Gew.-% Rohprotein. In diesem Rohprotein beträgt der Anteil an Aminosäuren 75 — 78 Gew.-%. Dabei beträgt der Anteil der essentiellen Aminosäuren etwa 50 Gew.-°/o des Gesamtaminosäuregehaltes. Der Gehalt des Produktes an Nucleinsäure, Fett- und Kohlehydraten ist niedrig. Der Nucleinsäuregehalt liegt zwischen 10 und 14 Gew.-%, der Gehalt an Fett liegt zwischen 5 und 10 Gew.-%, der Gehalt an Kohlenhydraten liegt zwischen 5 und 10 Gew.-%.
Besonders vorteilhaft ist; daß die erfindungsgemäß erhaltene getrocknete Bakterienzellmasse keine Pigmente, toxischen Substanzen, Reservestoffe wie Schleime oder Polyhydroxybuttersäure, störende Geruchsstoffe und Sekundärmetabolite enthält.
Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene trockene Bakterienzellmasse ist daher in besonderem Maße als Eiweißquelle für Lebensmittel und Tierfutter geeignet.
Der gemäß der Erfindung zu züchtende Stamm wird wie folgt charakterisiert.
I. Wachstumsverhalten
a) Kein Wachstum auf
Glucoseagar oder Glucosemedium,
Fleischbouillonagar oder Fleischbouillonnährmedium, Gelatine, Peptonagar oder -medium,
Lackmusmilch, Kartoffelnährmedium,
Aminosäurenährmedium.
b) Wachstum auf
Methanol enthaltendem synthetischem Nährmedium.
II. Morphologie
a) Kurzstäbchen von 0,5—1,5 μ, beweglich durch polare Geißel, keine Sporenbildung, Cystenbildung.
b) Kolonieform rund, durchscheinend, leicht erglänzend.
c) Keine Pigmentbildung.
III. Physiologie
a) Wachstum bei:
200C ±,
25°C +
300C + +
35°C + + +
37°C + + + +
39°C + + +
41°C +
Optimale Wachstumstemperai'>r: 37°C Optimaler pH-Wert: 6,8-7,0. Gram-negativ.
b) Wuchsfaktoren
Polyhydroxybuttersäure-Bildung
Indolbildung —
Acetonbildung —
Reduktion von NO3 +
Cytochromoxidase +
Katalase +
Isocitratdehydrogenase +
Malatdehydrogenase +
Oxidase +
Bildung von H2S —
Gelatineverflüssigung —
Stärkehydrolyse -
Zitronensäurebildung —
Milchkoagulation -
Wachstum auf
Ammoniumsalzen +
Harnstoffen —
Acetat —
nicht erforderlich
Dimethylamin +
Trimethylamin —
Monomethylamin —
Formiat —
Formaldehyd —
Zucker, Polysaccaride —
Alkohole (außer Methanol) -
Ni-Fixierung +
CO2-Fixierung +
Die bekannten Methylomonas-Arten und andere methanolverwertende Mikroorganismen sind beschrieben in Bergey's Manual of Determinative Bacterology, 8th edition, the Williams & Wilkens company, Baltimore, 1974; außerdem sind verwandte Stämme in verschiedenen Publikationen charakterisiert worden. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt diesen Stand des Wissens im Vergleich mit charakteristischen Eigenschaften der neuen Art Methylomonas clara. Wie die Tabelle zeigt, differieren die Pseudomonas-Arten durch die Bildung von Polyhydroxybuttersäure und fehlendes Wachstum auf Methan oder Dimethylamin von der neuen Art Die bekannten Methylomonas-Arten unterscheiden sich von der neuen Art durch Temperaturoptimum, Pigmentbildung, Poiyhydroxybuttersäurebildung und Coccenform. Ein weiteres wichtiges Unterscheidungsmerkmal zwischen der neuen Art und den bekannten Arten ist der Hexulosephosphatweg. Er ist bei der neuen Spezies gegenüber dem Serinweg der Methanolverwertung energetisch begünstigt
In der nachstehenden Tabelle bedeutet am Ende der Spalte 1 G+ C (%) den Guanin- und Cytosin-Anteil am Gesamtgehalt der Pyrimidin-Basen.
In Spalte 2 ist der neue Stamm Methylomonas clara ATCC 31226 charakterisiert.
In den Spalten 3-7 sind verwandte Stämme nach Bergey aufgeführt.
In den Spalten 8 — 11 sind verwandte Arten aus einzelnen Veröffentlichungen angegeben. Im einzelnen handelt es sich um Pseudomonas methanolika, beschrieben in US-PS 37 55 082; Pseudomonas AM 1, beschrieben in J. Bact. 114 (1), 390 (1973); Pseudonomas methylotropa, beschrieben in DE-OS 21 61 164; Methylomonas methanica, beschriebenen in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, 1974, The Williams & Wilkens Company/Baltimore.
Tabelle 1
Methylomonas
clara
ATCC 31 226
Methylomonas methanica Melhylomonas
methano-
oxidans
Methylomonas
methanoni-
trificans
Methylococcus
capsalaticus
Zellmasse (μ)
0,5x1,5 !Stäbchen |
Beweglichkeit
Pigmentbildung
N2-Fixierung
CO2-Fixierung
NO3 a. Stickstoffquelle
Temp. opt. (0C)
Wachstum auf Aminosäuren -
B EB [37
0,6x1,0 Stäbchen
+ 1351 1x3
Stäbchen
D D
|30J
1 x2
2x4
Stäbchen
EB
EB
+
37
Fortsetzung
Metbylomonas Methylomonas Methylomonas Melhylomonas Methylococous
clara meihanica methano- melhanoni- capsalaticus
ATCC 31 226 oxidans trificans
Methanol als C-Quelle + + + +
Methan als C-Quelle + + + + +
Äthanol als C-Quelle - - +
Hexulosephosphatweg + + + + +
Serinweg B
Formaldehyd
Formiat
Trimethylamid
Dimethylamid +
G + C(%) 50-54 50-54 50-54 62,5
Methylosinus Ps. methanolica Pseudomonas Ps. methylo- Methylomonas
methylocystis AM 1 tropha methanica
Stäbchen
Zellmasse (μ) Beweglichkeit Pigmentbildung
pHBS [+]
N 2-Fixierung CO2-Fixierung NO3 a. Stickstoffquelle Temp. opt. (0C) Wachstum auf Aminosäuren Methanol als C-Quelle +
Methan als C-Quelle -
Äthanol als C-Quelle Hexulosephosphatweg Serinweg [TJ
Formaldehyd Formiat
Trimethylamid Dimethylamid
G + C(%) 62,5
Beispiel
Der Stamm Methylomonas clara ATCC 31226 wird zur Anzucht auf Schrägröhrchen folgender Zusammensetzung gehalten:
Agar 18 g
H3PO4 85%ig 2,0 ml ml
NH4OH12°/oig 3,0 ml
Na2HPO4 0,01 g
H2SO4 1,2 g
MgSO4 · 7 H2O 0,8 g
FeSO4 · 7 H2O 0,03 g Methanol (Zugabe vor Abfüllen
d. Röhrchen) 10,0 ml
Spurenelementlösung*) 1,0 ml
Wasser 1 pH vor Sterilisation!
*) Enthält CuSO3. H3BO3, MnSO4. ZnSO4, Na2MoO4
[+1
52,1
Die Schrägröhrchen mit dieser Zusammensetzung werden 30 Minuten lang im Autoklaven auf 12O0C erhitzt. Danach werden die Röhrchen mit Methylomonas clara beimpft und 2 Tage lang bei 37° C gehalten. Von zwei Röhrchen wird mit 10 ml physiologischer Kochsalzlösung die Zellmasse abgeschwemmt und auf die nächste Stufe verimpft
Diese Stufe ist eine Schüttelkultur (Vorkultur), wobei 2 1 — Erlenmeyerkolben verwendet werden, die mit 11 Nährlösung (wie vorstehend, doch ohne Agar) gefüllt sind und zu denen 3,3 ml Methanol (steril filtriert) zugegeben werden. Die Kultur erfolgt drei Tage bei 37°C auf Schüttelmaschinen, die 220 Upm und eine Amplitude von 4 cm haben. Nach 24 und 48 Stunden werden je 3,3 ml Methanol zugegeben.
Die folgende Stufe (Hauptkultur) wird in einem Fermenter von 251 Volumen durchgeführt, der mit ca. 201 der Nährlösung (wie vorstehend, jedoch ohne Methanol, ohne Aeari eefüllt wird. Nach Sterilisation
(30 Min7120°C/l,2-1,4 bar) wird der Fermenter mit 2 1 Vorkultur beimpft. Die Fermentationsbedingungen in dem mit Blattrührern, Belüftungskranz und drei Schikanen ausgerüsteten Fermenter sind folgende:
0,5 vvm
Methanol wird mit 20 ml vorgelegt; jedesmal, wenn der CO2-Ausstoß der Zellen absinkt, werden weitere 20 ml Methanol zugegeben. Die Methanolkonzentration erreicht dabei nicht mehr als 0,1 Volumprozent.
Nach 22 Stunden werden die 201 Kultursuspension der Hauptkultur in einen Vorfermenter von 2001 Volumen verimpft. Dieser Fermenter wird genauso behandelt wie die Hauptkultur. Er ist ebenso ausgerüstet. Die Fermentationsbedingungen sind:
Temperatur 370C
Belüftung 10 l/Min.
Druck 0,2 bar
Drehzahl 500 Upm
pH-Wert 6,6
Temperatur 37°C
Belüftung 6-8 mVh 0,5-0,75 vvm
Druck 0,2 bar
Drehzahl 380 Upm
pH-Wert 6,7
Temperatur 37° C
Belüftung 60-8OmVh
0,5-0,75 vvm
Druck 0,2 bar
Drehzahl 170 Upm
pH-Wert 6,7
ratur von 120 —150° C getrocknet. Das so erhaltene Pulver enthält noch 1,5-3,5% Restfeuchte und
Der pH-Wert wird mit sterilem Ammoniakwasser (10%ig) auf 6,7-6,8 gehalten. Die Methanolzufuhr wird durch Messen der Methanolkonzentration in der Abluft mit Hilfe eines FID (Flammenionisationsdetektor) geregelt, wobei jedes Absinken des Methanolwertes unter 50 ppm eine weitere Zugabe von Methanol nach sich zieht. Bei 600 vpm Methanol in der Abluft liegen 0,22% Methanol in der Lösung vor.
Nach 20 Stunden Fermentation wird ein Hauptfermenter mit 2001 der Kultursuspension aus dem Vorfermenter beimpft; er enthält 200 1 Nährlösung und hat folgende Betriebsbedingungen:
Die Methanolzugabe erfolgt wie im 200-1-Vorfermenter. Die Methanolkonzentration liegt bei 50 — 80 ppm in der Nährlösung. Nach 22 Stunden Fermentationszeit wird die Bakterienzellmasse abgeerntet Dazu wird die Kultursuspension durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf pH 4,0 gebracht und die Zellmasse in Separatioren bei 400 U/min abgeschleudert Es kann auch bei pH 6,5 — 6,8 abgeschleudert werden. Die abgeschleuderte Zellmasse (Trockengehalt 20%) wird mit Wasser gewaschen und danach im Separator auf 25% Trockengehalt gebracht. Anschließend wird die Zellmasse im Sprühtrockner bei einer Eingangstempe-
(N χ 6,25) Rohprotein 85%
Aminosäuren 74%
Essentielle Aminosäuren
davon ca. 50%
Nukleinsäuren 8-12%
Rohfett 6-8%
Rohasche 5-6%
Temperatur 37° C
Belüftung 80 NmVh
Druck 0,1 bar
Drehzahl 390 Upm
pH-Wert 6,8
(die Prozentangaben sind Gewichtsprozente.)
Beispiel 2
Der Stamm Methylomonas clara ATCC 31226 wird, wie in Beispiel 1 geschildert, gezüchtet.
Der Hauptfermenter ist ein für kontinuierliche Fermentation ausgelegter 3000-1-Fermenter, der ständig belüftet wird. Seine Betriebsbedingungen sind:
0,67 vvm
Er wird mit 2001 Kultursuspension des Vorfermenters beimpft; er enthält 200,0 1 Nährlösung (wie am Anfang des Beispiels 1 beschrieben, doch ohne Agar). Die Methanolkonzentration wird wie vorstehend beschrieben gemessen und durch Zugabe von Methanol/Wasser im Volumenverhältnis 40:60 gesteuert, so daß eine mittlere freie Methanolkonzentration von 0,001 -0,005% Methanol in der Nährlösung aufrechterhalten wird.
Nach Produzieren von 7 —10 kg Zellmasse/I wird der kontinuierliche Betrieb aufgenommen.
Dazu wird mit einer Durchflußrate (D) von 0,25/h Nährmedium zugegeben; dieser Wert wird nach ca. 12 Stunden auf D = 0,33/h gesteigert, was ca. 650 l/h ausmacht Nach dieser Zeit hat sich das Fließgleichgewicht eingestellt Die entsprechende Menge bewachsenen Nährmediums wird abgezogen, in einem Zwischenbehälter ohne Methanolzugabe 1 -2 Stunden gehalten und dann der Zellabtrennung und Trocknung wie in Beispiel 1 beschrieben zugeführt
Die so erhaltene Zellmasse enthält 2-4% Restfeuchte und
Rohprotein (N χ 6,25) 81%
Aminosäuren 70%
Essentielle Aminosäuren 50% d. ges.
Aminosäuren
Nukleinsäuren 8-10%
Rohfett 5-10%
Rohasche 5-10%

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Bakterienzellmasse durch Züchten von Bakterien der Gattung Methylomonas unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, enthaltend Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen und essentielle Mineralsalze, dadurch gekennzeichnet, daß man Methylomonas dara ATCC 31226 bei einer Konzentration an Methanol zwischen 5 und 150 ppm, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums züchtet
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Methanolkonzentration zwischen 10 und 50 ppm, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums, züchtet
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