FI57272C - Foerfarande foer framstaellning av en proteinhaltig bakteriecellmassa foer vidare behandling till foeda foer maenniskor och djur - Google Patents

Description

RSF^l M (11)KUU,LUTUSJULKAISU ,7070 JUA lJ 'V UTLÄGGN INGSSKRIFT Of 272 •2?S C (45) Pate:. tii n; ycr r 11 y J? '7 IPJj (51) KY.lkilnt.CI.3 G 12 N 1/00 SUOM I — FI N LAN D (11) Pfnttlhikmui — PtttntmtOkfllni 772238 (22) H»k*ml«plivt —Ameknlngidig 20.07-77 (23) Alkupllvl—GHtl«h«tada| 20.07.77 (41) Tullut Julkliukal — BIMt offuntllf 25.01.78

Patentti- ja rakiatarihallitus /44) Nthtiviksip*non ]» kmiLjullutoun pvm.—

Patent· och regiitentyrelaen AnMctn uth|d oeh utUkrtfun publicand 31.03.80 (32)(33)(31) *rr··*** «tuelkuu*—Begird priorltut 2k. 07.76

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2633U51.0 (71) Hoechst Aktiengesellschaft, 6230 Frankfurt (Main) 80, Saksein Liitto tasavalta- Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Paul Präve, Bad Soden am Taunus, Dieter Sukatsch, Frankfurt/Main,

Uwe Faust, Kelkheim, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7^) 0y Roister Ab (5U) Menetelmä ihmisten ja·eläinten ravinnoksi edelleen käsiteltäväksi soveltuvan valkuaisainepitoisen bakteerisolumassan valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en proteinhaltig bakteriecellmassa för vidare behandling tili föda för människor och djur

Keksinnön kohteena on menetelmä bakteerisolumassan valmistamiseksi, joka massa sisältää suuren määrän proteiinia ja sen ohella rasvoja, hiilihydraatteja ja vitamiineja. Solumassaa voidaan käyttää edelleen käsiteltynä rehujen ja ravintoaineiden perusaseena

Tunnetuilla bakteerisolumassan valmistusmenetelmillä käyttäen bakteerikantoja, jotka käyttävät metanolia ainoana hiililähteenään, saadaan usein tuotteita, jotka sisältävät väri- ja lima-aineita tai ei-toivottuja sivuaineita, kuten poly-hydroksivoihappoa, mikä huomattavasti rajoittaa niiden käyttöä rehu- tai ravintoaineina. Tällaisten sivuainesten haju, maku tai myrkylliset ominaisuudet voivat olla esteenä niiden käytölle.

Seulontamenettelyllä öljypitoisista maa- ja vesinäytteistä, metanolitehtaan jätevesistä tai hedelmistä ja kukista (appelsiininkuoret ja jasmiininkukat) on löydetty suvun Methylomonas uusi kanta, joka voi käyttää hiililähteenä metanolia, metaania tai dimetyyliamiinia. Tämä kanta määriteltiin uudeksi, ja sille annettiin nimi Methylcmonas clara FH-B-5^+60, ja se on talletettu American Type Culture Collection kokoelmiin merkinnällä ATCC 31226.

57272

Keksinnön mukainen menetelmä ihmis- ja eläinravinnoksi edelleen käsiteltäväksi soveltuvan valkuaisainepitoisen bakteerisolumassan valmistamiseksi viljelemällä aerobisissa olosuhteissa Methylomonas-sukuun kuuluvia bakteereja viljelyväliaineessa, joka sisältää metanolia hiililähteenä, typpilähteitä ja välttämättömiä mineraalisuoloja, on tunnettu siitä, että käytetään uutta Methylomonas clara ATCC 31226 kantaa ja että viljelyväliaineen metanolikonsentraatio on 5-150 ppm laskettuna viljelyväli-aineen painosta ja viljely suoritetaan 30-1t2°C:ssa, edullisesti 35-39°C:ssa ilmastaen 0,1-1,5 litralla ilmaa viljelyväliaineen litraa kohti minuutissa ja pH-arvossa 1+,0-9,0, edullisesti 6,0-7,2, solumassa erotetaan viljelysuspensiosta, pestään vedellä ja kuivataan. Tällöin metanoli on ainoa hiililähde.

Metallipitoisuus on edullisesti 5-100 ppm. Erityisen edullisesti metanoli-pitoisuus on varsinkin jatkuvakäyttöisessä valmistuksessa 5“30 ppm.

Menetelmä suoritetaan hyvin ilmastetuissa fermentointisäiliöissä, jotka sisältävät ravintoväliaineessa ainoana hiililähteenä metanolia ja sen ohella typpi-lähteenä suoloja, kuten kaliumnitraattia, ammoniumsulfaattia, ammoniumfosfaattia tai ammoniakkia. Lisäksi ravintoväliaine sisältää fosfaatteja, kuten kaliumdi-vetyfosfaattia tai dinatriumvetyfosfaattia, sekä magnesium- ja kaliumsuoloja, lisäksi sellaisia hivenaineita, joita on esim. vesijohtovedessä, varsinkin rauta-, kupari- ja molybdeenisuoloja.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa tunnetuissa fermentointisäiliöissä, esim. ilmastetuissa sekoitustankeissa tai myös uudenaikaisemmissa fermenttoreissa, kuten ketjureaktoreissa, panoksittain tai jatkuvana.

Metallipitoisuuden vaadittu taso voidaan tarkistaa jatkuvasti erilaisin toimenpitein, esim. mittaamalla typen kulutus, bakteerisolumassan määrä suspensiossa tai edullisesti mittaamalla vapautunut hiilidioksidimäärä. Tällöin metanoli-lisäys voidaan tarkasti annostella sen mukaan, miten hiilen puute ilmenee hiilidioksidipitoisuuden laskuna nopeasti analysoitaessa. Tämä ohjaus voidaan suorittaa varsinkin edullisesti mittaamalla kaasumaisen metanolin pitoisuus liekki-ionisaattoridetektorilla.

Viljelyväliaineesta ja kasvavasta bakteerisoluraassasta koostuvan viljely-suspension pH on tarkoituksenmukaisesti U,0-9,0, edullisesti 6,0-7,2. Jos viljely-suspension pH laskee esitetyn rajan alle, lisätään vastaava määrä alkalia, esim. natriumhydroksidia tai kaliumhydroksidia. Liian korkea pH säädetään lisäämällä happoa, esim. suolahappoa tai rikkihappoa.

.viri iti 3 57272

Bakteerisolumassan erottaminen tapahtuu tavallisella tavalla, esim. linkoamalla samalla pesten vedellä useita kertoja. Tällöin voidaan käyttää dokanttereita tai separaattoreita. Näin saadaan tahnamainen bakteerisolumassa, joka sisältää vielä 75-90 paino-# vettä.

Kuivaaminen voidaan suorittaa eri tavoin, esim. valssikuivaamalla, leiju-petikuivaarnalla tai sumuttamalla. Näin saatu tuote sisältää vain 1-ä paino-# vettä ja 8Ο-9Ο paino-# raakaproteiinia. Tämän raakaproteiinin aminohappopitoisuus on 75-78 paino-#. Kokonaisaminohappomäärästä on välttämättömien aminohappojen osuus noin 50 paino-#. Tuotteen nukleiinihappo-, rasva- ja hiilihydraattipitoisuus on alhainen. Nukleiinihappopitoisuus on 10—1U -paino-#, rasvapitoisuus on 5~10 paino-# ja hiilihydraattipitoisuus on 5“10 paino-#.

Erityisen edullista on, ettei keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kuivattu bakteerisolumassa sisällä pigmenttejä, myrkyllisiä aineita, sivuaineita, kuten lima-aineita tai polyoksivoihappoa> häiritseviä hajuaineita eikä muita metäbo-liitteja.

Keksinnön mukaisesti Valmistettua kuivattua bakteerisolumassaa kokeiltiin sikojen ruokinnassa lisättynä rehuun 3-12 #. 3 kuukauden koeaikana sikojen painon lisäy: oli normaali eikä sioilla esiintynyt minkäänlaisia ruokinnasta johtuvia häiriöitä.

Uusi bakteerikanta Methylomonas Clara FH-B-5**60 ATCC 31226 luonnehditaan seuraavasti.

I. Kasvuolosuhteet a) Ei kasva glukoosiagarilla, tai glukoosiväliaineessa, lihaliemiagarilla tai lihaliemiväliaineessa, gelatiinilla, peptoniagarilla tai peptoniväliaineessa, lakmusmaidossa, perunaravintoväliaineessa, aminohapporavintoväliaineessa.

b) Kasvaa metanolia sisältävässä synteettisessä ravintoväliaineessa.

c) Dimetyyliamiinia sisältävässä ravintoväliaineessa ja metaaniatmosfäärissä kasvu on heikompaa.

d) Happi on välttämätön.

II. Morfologia a) lyhyitä 0,5-1,5 p sauvoja, jotka liikkuvat polaaristen värekarvojen avulla, ei itiönmuodostusta, kystanmuodostus.

b) Pesäkkeet pyöreitä, läpikuultavia hieman kiiltäviä.

c) Ei pigmentinmuodostusta. , - ·' . , 11 57272 III, Fysiologia a) Kasvu lämpötiloissa: 20°C + 2 5°C + 30°C ++ 35°C +++ 37°C ++++ 39°C +++ U1°C +

Optimikasvulämpötila: 37°C Optimi-pH: 6,8-7,0 . Gram-negatiivinen. a) Kasvutekijät

Kasvuolosuhteet Ei tarpeellinen polyhydroksivoihapon muodostus Indolin muodostus Asetonin muodostus N0^:n pelkistys +

Sytokromioksidaasi +

Katalaasi +

Isositraattidehydrogenaasi +

Malaattidehydrogenaasi +

Oksidaasi + f^Sin muodostus

Gelatiinin nesteytys Tärkkelyshydrolyysi

Sitruunahapon muodostus

Maidon koagulaatio

Kasvaa: ammoniumsuoloilla + virtsa-aineilla asetaatilla dimetyyliamiinilla + trimetyyliamiinilla monometyyliamiinilla formiaatilla formaldehydillä sokerilla, polysakkarideilla alkoholeilla (metanolilla +3 N0-sitominen + / ' , . . .

CO?-sitominen + 5 57272

Tunnetut Methylomonas-lajit sekä muita metanolia käyttäviä mikro-organismeja on kuvattu teoksessa Bergey's Manual of Determinative Bacterology, 8th edition, the Williams & Wilkens Company, Baltimore 197^> lisäksi on läheisiä kantoja kuvattu eri julkaisuissa. Seuraavassa taulukossa on esitetty tämä tunnettu tekniikan taso verrattuna uuden Methylomonas clara-kannan tunnusomaisiin ominaisuuksiin. Kuten taulukosta ilmenee, eroavat Pseudomonas-lajit uudesta kannasta siinä, että ne muodostavat polyhydroksivoihappoa eivätkä ne kasva metanolilla tai dime-tyyliamiinilla. Tunnetut Methylomonas-lajit eroavat uudesta kannasta lämpötila-optimin, pigmentinmuodostuksen, polyhydroksivoihaponmuodostuksen ja kokkimuodon suhteen. Uusi kanta eroaa tunnetuista lajeista lisäksi siinä, että se energiankäytön kannalta metanolin hyväksikäytössä suosii heksuloosifosfaattia eikä serii-niä kuten tunnetut lajit.

Seuraavassa taulukossa merkitsee ensimmäisen sarakkeen lopussa G + C (%) guaniini- ja sytosiiniosuutta pyrimidiiniemästen kokonaismäärästä.

Sarakkeessa 2 on kuvattu uuden Methylomonas clara ATCC 31226 kannan ominaisuudet .

Sarakkeissa 3-7 on kuvattu teoksen Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, 197^» The Williams & Wilkens Company, Baltimore, mukainen kuvaus lähisukuisten kantojen ominai suliksi st a.

Sarakkeissa 8-11 on yksittäisten julkaisujen esittämiä lähisukuisia lajeja, nim. Pseudomonas methanolica (US-patenttijulkaisu 3 755 082), Pseudomonas AM 1 (J. Bact. 11U (1), 390 (1973) ja Pseudomonas methylotropa (DE-hakemusjulkaisu 2 161 16U).

6 srtTi o Γ I ---- I o Ο ·Η _ >} to I [+"il ++1 I I I I ^

*“ £} Λ X3 l_I I I CM

^ -P β +> UN

M e a o cd r-H 0) "-3 S XS O _ ο xi ft > (-1 I-1 *- -p 0 3+ 1 +1 1 1 1 1 1 -a· co <u U cd I—-I I I ir\

PM a -P CO

0 t3 co d id *- r~—a on <u β + +1+1

co O S __J

pm a <

cd I cd 0 d 0 •H cd O PM

H +> Pi ft O co Ό cd _

OO S -§ j? ·Η I + I + I

ä o s o I—I

• -P 0 H > co a; a ο ·η PM 0 — ft 01

1 I

0 0

I—I 1—I CO

ϊ>> CO >> ·Η UN

t- Ä 3 Ä P I-1 ·>

-P β +> co + CM

<u ·η <u ι>» I J \o 2 co 0 υ 1 1 : 0 cd cd !

rl M r) '— tr~3 I

1¾ 0 cd to a> - cfN

no xi 0 co d Xml'll + r- +1 + + + ·> -p 0 ft 0 3 1 ro L_ cm

* 0 0 cd *H ' o 1 \O

2 υ 0 -p W

0 ^ j 2 CO ·Η

P cd (H

Η β -P

2 s ·η cd 0 β cd EM UN O O "-3 H β CO CM -3 O _ _ -3· λ’λ § X! X 0 + Γ+1 Γ+1 + + + + + Τ' P -p o cd I_J I—I o ω cu ·η «- cm w un 2 0^ 1 1 cd O O CO ·Γ-3 H β β ro o >3 [O cd cd t> / 1 i-I r 1 xf Xl cd X3 X d + I I I If II I o ++I+ un +> β -p ·η ώ I_11_I I_ 00 1 J) Q M '-to 0 2 0 0 O un CO CÖ ·Η cd +> co

β co 3<J —· O

ο β ο ο β " 0 ο τ) Β O *- cd <0 Ο ·Η Ο d ft τ» H β d S ft X O I—n >> 3 0 xi cd > + 1 1 +0 +1+ -a- Λ Λ >>β M3 3 1_J ro un

P P ·Η rl ·Η · Jj I

CD (U CU O O O W o

2 0 *—· ft > UN

CO

cd NO

e CM UN

O O CM " CM 0 NO »- β *? +Q1 BBS ^ · + + + □ xi u m to un 0 Γ p e I o * cd

0) H K EM O CO

2 O Cc < :cd I

β O cd icd ·Η

r-' CO (U O H β «cd «d -P

β 0 CU H CU β β -P

O +> -P *> ·Η CU 0) ID cd u to xi -h o -p cu <u co ·η M O id g ft i p p Mi Td -h •H Ό fl H ·Η cd I® Λ X! to ·Η 'Ö 0 O β <D ·Η -p xd H icd icd o ·η 0 ·η *- I 0 <D β ft ft O I H H M -Ö 30 CO 0 Ö ·Η ft O β O I I -H CU >> ·Η ·Η 3 O d fl ·Η 0 !>j cd ·Η O O M ·ΗΧΓ-ΡΗ·Η·—' O-pd-H 0 O +> H 0 ·Η O -p <D -P S H W.

Xo>+> o+> ·η3η·η·ηο ·η tJ cd s

o d d β -p ·η · -p o β h h β rH a +> S

,M 0 3 Φ ·ΗΜ®:0 3350>» ·η g ·η o . -p o ^ 3 3 i ω to i ft f 3 3 g co -h 00¾¾ HH*HEi)pgi CMCO0CO-P+>3,M<DiHfifiTMi + Q 0·Η·ΗΡ3 CM O O :cd cdl)®^ CU ·Η CU O O Β·Η

WCOPJft ftaoa>3i*J22wa-Pttl&MpMEMQO

7 57272

Esimerkki 1

Kannan Methylomonas clara FH-B-5460 ATCC 31226 kasvattamiseen käytetään seuraavalla viljelyväliaineella täytettyjä vino-viljelmäputkia:

Agar 18 g I^PO^ 85 %:nen 2,0 ml NH40H 12 %:nen 3,0 ml

NaH2HP0^ 0,01 g 1,2 g

MgS04.7H20 0,8 g

FeS01+.7H20 0,03 g

Metanoli (lisätään ennen putkien täyttämistä) 10,0 ml • * · X )

Hivenaineliuos 1,0 ml

Vesi 1 litra pH ennen sterilointia 6,7 x)sisältää CuS04, H3B03, MnSO^, ZnSO^, Na2Mo04

Viljelyväliainetta sisältäviä putkia kuumennetaan autoklaavissa 120°C:ssa 30 minuuttia. Sitten putkiin ympätään Methylomonas clara-kantaa ja putkia pidetään 2 vrk 37°C:ssa. Kahdesta putkesta huuhdotaan solumassa fysiologisella keittosuolaliuoksella ja käytetään seuraavan vaiheen ymppinä.

Tämä vaihe on ravistusviljelmä (esiviljelmä), jossa käytetään 2 litran erlenmeyer-pulloja, jotka on täytetty viljelyväli-aineella (sama kuin edellä, mutta ilman agaria), ja joihin on lisätty 3,3 ml metanolia (steriilisuodatettu). Tätä viljelmää ravistellaan 3 vrk 37°C:ssa ravistuskoneissa, joiden kierrosluku on 220 kierr/min. ja amplitudi 4 cm. Metanolia lisätään 24 ja 48 tunnin kuluttua 3,3 ml kummallakin kerralla.

Seuraava vaihe (pääviljelmä) suoritetaan 25 litran ferment-torissa, joka on täytetty 20 litralla viljelyväliainetta (sama kuin edellä, mutta ilman metanolia ja ilman agaria). Steriloinnin (30 min./120°C/1,2-1,4 bar) jälkeen fermenttorin sisältö ympätään 2 litralla esiviljelmää. Fermentointiolosuhteet siipisekoittajalla, ilmastuskehällä ja kolmella välilevyllä varustetussa fermenttorissa ovat seuraavat: 8 57272

Lämpötila 37°C

Ilmastus 10 1/min. 0,5 vvm

Paine 0,2 bar

Kierrosluku 500 kierr/min.

pH 6,6

Metanolia lisätään alussa 20 ml ja joka kerta, kun solujen CC^-kehitys laskee, lisätään jälleen 20 ml metanolia. Metano-lipitoisuus ei tällöin kohoa yli 0,1 tilavuus-%:n.

22 tunnin kuluttua ympätään 20 litralla pääviljelmän vilje-lysuspensiota 200 litran esifermenttorissa oleva viljelyväliaine.

Tätä fermenttoria käsitellään aivan samoin kuin pääviljelmää. Sen varusteet ovat myös samat. Fermentointiolosuhteet ovat:

Lämpötila 37°C

Ilmastus 6-8 m^/h 0,5-0,75 vvm

Paine 0,2 bar

Kierrosluku 380 kierr./min.

pH 6,7 pH pidetään 6,7-6,8:ssa steriilillä ammoniakkiliuoksella (10 %:nen). Metanolilisäys säädetään mittaamalla poistoilman meta-nolipitoisuus liekki-ionisaattoridetektorilla, jolloin metanoli-pitoisuuden laskiessa alle 50 ppm tapahtuu aina uusi metanolilisäys. Kun poistoilmassa on 600 vpm metanolia, on liuoksen metanoli-pitoisuus 0,22 %.

20 tunnin fermentoinnin jälkeen ympätään pääfermenttorissa oleva 200 litraa viljelyväliainetta esifermenttorista saadulla 2000 litralla viljelysuspensiota. Viljelyolosuhteet ovat seuraavat: Lämpötila 37°C

o

Ilmastus 60-80 m /h 0,5-0,75 vvm

Paine 0,2 bar

Kierrosluku 170 kierr/min.

pH 6,7

Metanolilisäys suoritetaan samoin kuin 200 litran esifermenttorissa. Ravintoliuoksen metanolipitoisuus on 5Ό-80 ppm. 22 tunnin fermentoinnin jälkeen bakteerisolumassa otetaan talteen. Viljely-suspensioon lisätään tällöin laimeata rikkihappoa kunnes pH on 4,0, ja solumassa erotetaan separaattoreissa 400 kierr/min. Linkoaminen voidaan suorittaa myös pH 6,5-6,8:ssa. Lingottu solumassa (kuiva- t 9 57272 ainepitoisuus 20 %) pestään vedellä, ja kuiva-ainepitoisuus saatetaan 25 %:ksi separaattorilla. Tämän jälkeen solumassa sumute-kuivataan, sisäänvientilämpötila on tällöin 120-150°C. Näin saadussa jauheessa on vielä 1,5-3,5 % jäännöskosteutta ja raakaproteiinia (N x 6,25) 85 % aminohappoja 74 % joista välttämättömiä aminohappoja noin 50 % nukleiinihappoja 8-12 % raakarasvaa 6-8 % raakatuhkaa 5-6 % (prosentit ovat paino-%:ja).

Esimerkki 2

Kantaa Methylomonas clara FH-B-5460 ATCC 31226 viljellään samoin kuin esimerkissä 1.

Pääfermenttorina on jatkuvaan fermentointiin sopiva 3000 litran fermenttori, jota ilmastetaan koko ajan. Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:

Lämpötila 37°C

o

Ilmastus 80 Nm /h 0,67 vvm

Paine 0,1 bar

Kierrosluku 390 kierr./min.

pH 6,8

Ymppinä käytetään 200 1 esifermenttorin viljelysuspensiota ja fermenttori sisältää 2000 1 ravintoväliainetta (samaa kuin esimerkin 1 alussa, mutta ilman agaria). Metanolipitoisuus mitataan edellä kuvatulla tavalla, ja sitä säädetään lisäämällä meta-noli/vesiseosta 40:60 (tilav.) siten, että metanolipitoisuus ra-vintoväliaineessa pysyy välillä 10-50 ppm.

Kun on tuotettu 7-10 kg solumassaa/1 aloitetaan jatkuva viljely.

Ravintoväliainetta lisätään läpivirtausnopeudella (D) 0,25/h. Tämä arvo korotetaan noin 12 tunnin kuluttua arvoon D = 0,33/h, mikä vastaa noin 650 1/h. Tämän ajan kuluttua virtausnopeus on asettunut tasaiseksi. Keskimääräinen vapaan metanolin pitoisuus pidetään nyt välillä 10-20 ppm. Vastaava määrä kasvanutta ravinto-väliainetta poistetaan ja pidetään ilman metanolilisäystä 1-2 tuntia välisäiliössä, minkä jälkeen solut erotetaan ja kuivataan samoin kuin esimerkissä 1.

ίο $7272 Näin saatu solumassa sisältää 2-4 % jäännöskosteutta ja raakaproteiinia (N x 6,25) 81 % aminohappoja 70 % välttämättömiä aminohappoja 50 % kaikista aminohapoista nukleiinihappoja 8-10 % raakarasvaa 5-10 % naakatuhkaa 5-10 % t