HU176399B

HU176399B - Processs for producing cell-mateiral of bacteria

Info

Publication number: HU176399B
Application number: HU77HO2004A
Authority: HU
Inventors: Paul Praeve; Dieter Sukatsch; Uwe Faust
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1976-07-24
Filing date: 1977-07-22
Publication date: 1981-02-28
Also published as: FI57272C; SE426402B; US4166004A; FR2359204A1; IL52578A0; PT66843A; NO146605C; GR71995B; DK143286C; JPS5315490A; AU2722977A; DK332677A; NO772623L; ES460841A1; DD137121A5; NO146605B; NL7708016A; DK143286B; FR2359204B1; RO71616A

Description

A találmány nagy mennyiségű protein mellett zsírokat, szénhidrátokat és vitaminokat tartalmazó baktériumsejtanyag előállítására irányuló eljárásra vonatkozik. A sejtanyag takarmányok és tápanyagok számára nyersanyagként szolgál.

A metanolon mint egyetlen szénforráson növekvő baktériumtörzsek felhasználásán alapuló, baktériumsejtanyag előállítására szolgáló ismert eljárások gyakran olyan termékekhez vezetnek, amelyek színezőanyagokat, nyálkákat vagy nem kívánt tartalékanyagokat tartalmaznak, mint a polihidroxivajsav, ami erősen rontja takarmány- vagy tápanyagként! felhasználhatóságukat. Az ilyen kísérőanyagok szaga, íze vagy toxikus sajátsága az ilyenirányú felhasználást lehetetlenné teheti.

A 23 11 006 számú NSZK-beli közrebocsátási irat fehérje előállítására irányuló eljárást ismertet, ahol megfelelő táptalajban egyedüli szénforrásként metanolt alkalmaznak. A táptalajban az NRRL B—5458 jelzésű Methylomonas methanolica mikroorganizmust tenyésztik. A leírás 5. oldalán a

10. sorban adott kitanítás szerint a mikroorganizmus 30 °C hőmérsékleten mutat optimális növekedést. A táptalajban levő metanoltartalom a 2. igénypont szerint 1 térfogat% alatt van.

A 24 58 851 számú .NSZK-beli közrebocsátási irat egysejtű fehérjék kinyerését ismerteti. A művelethez metanolt és DSM 580 törzsszámú Methylomonas baktériumot alkalmaznak. A táptalajban egyedüli szénforrásként metanolt használnak, a te nyésztést aerob körülmények között végzik. A baktérium növekedésének optimuma - 33 és 36 °C között van (lásd a leírás 7. oldalát). A baktériumok további jellemző tulajdonságaként a sejtmassza 5 enyhén piros elszíneződését említik (lásd a leírás 7.

oldalát). A 3. igénypont szerint a táptalaj metanolkoncentrációja 0,01 és 2 térfogat% között van.

Mi a Methylomonas család egy olyan új törzsét találtuk meg, amely számára szénforrásként me0 tanolt, metánt vagy dimetilamint lehet alkalmazni. Ezt a törzset mint Methylomonas dara FH-B-5460-at határoztuk meg és az American Type Culture Collection-nél az ATCC 31226 szám alatt helyeztük letétbe,

A baktériumsejtanyagnak Methylomonas családba tartozó baktériumok segítségével aerob körülmények közötti, szénforrásként metanolt, nitrogénforrásokat és ásványi sókat tartalmazó tápközegben történő találmány szerinti előállítási ) eljárására az a jellemző, hogy a Methylomonas dara törzset tenyésztjük és a metanolkoncentrádó 5 és 150 ppm között van a tápközeg súlyára vonatkoztatva, és hogy metanol az egyedüli szénforrás.

> Az 5 és 100 ppm közötti metanolkoncentrádó előnyös. Különösen előnyös mindenekelőtt folyamatos üzemmód esetén az 5 és 30 ppm közötti metanolkoncentrádó. A mikroorganizmus csak emellett az alacsony metanolkoncentráció mellett i képes szaporodni. Az alacsony metanolkoncentrádó mellett azonban a mikroorganizmus nem tud toxikus metabolitokat, színezékeket felhalmozni, lecsökken a nukleinsavak és zsírok mennyisége és megnövekszik a sejtmassza fehérjetartalma, ami a takarmányként való felhasználás szempontjából igen _skedvező.

Az eljárást olyan jól levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre, amelyek a metanol, mint egyedüli szénforrás mellett sókat, így kálium-nitrátot, ammónium-szulfátot, nitrogénforrásként ammó- ₁₀nium-foszfátot vagy ammóniát tartalmazó tápközeggel vannak töltve. A tápközeg ezenkívül foszfátokat, mint a kálium-dihidrogén-foszfát vagy a dinátrium-hidrogénfoszfát, valamint magnézium- és kálium-sókat is tartalmaz, ezenkívül vannak benne ₁₅olyan nyomelemek, így különösen vas-, réz- és molibdén-sók, melyek például a vezetéki vízben előfordulnak.

Az eljárás célszerűen 30 °C és 42 °C között, előnyösen 35 °C és 39 °C között hajtjuk végre. ₂θ

A találmány szerinti eljárást ismert fermentáló edényekben, például átlevegőztetett keverős tartályokban vagy akár modem fermentorokban is, mint a gyűrűs reaktorok, szakaszos vagy folyamatos üzemben hajtjuk végre. ₂₅

A folyékony tápközeget a fermentációs edényben literenként és percenként 0,1-1,5 liter levegővel levegőztetjük.

A betartandó metanolkoncentrációt folyamatosan különböző módokon vezérelhetjük, például a ₃₀nitrogén-felhasználás mérése útján, a szuszpenzióban a baktériumsejtanyag mennyiségének mérése útján, vagy előnyösen a széndioxid-kibocsátás mérésével. Ezáltal lehetséges a pontos metanoladagolás, gyorsan reagálva a szénhiány következtében ₃₅fellépő széndioxid-kibocsátás csökkenésére. Ez a szabályozás különösen előnyös módon történhet az eltávozó levegőben levő gáz formájú metanol lángionizációs detektorral való mérése útján is.

A tápközegből és a növekvő baktériumsejtanyag- ₄₀ból álló fermentációs szuszpenzió pH értéke 4,0 és 9,0 között, előnyösen 6,0 és 7,2 között van. Ha a fermentációs szuszpenzió pH értéke az előírt érték alá süllyed, akkor megfelelő mennyiségű alkáliét, például nátrium- vagy kálium-hidroxidot adagolunk ₄₅be. A túl magas pH értéket pedig sav, például sósav vagy kénsav hozzáadásával csökkentjük.

A baktériumsejtanyag leválasztása szokásos módon, például többszöri mosás mellett végrehajtott centrifugálissal történik. Ennél a műveletnél dekantálókat és szeparátorokat alkalmazhatunk. Ily módon pasztaszerű baktériumsejtanyagot kapunk, amely még 75-90 súly százalék vizet tartalmaz.

A szárítás különböző módon történhet, például hengeres szárítással, örvényágyas szárítással vagy porlasztásos szárítással. Az így megszárított tennék már csak 1 —4 súlyszázalék vizet és 80—90 súlyszázalék nyers proteint tartalmaz. Ebben a nyers proteinben 75-78 súlyszázalék aminosav van. Az esszenciális aminosavak mennyisége mintegy 50% ezen belül. A termék nukleinsav, zsír és szénhidrát tartalma csekély. A nukleinsav tartalom 10 és 14 súlyszázalék, a zsír tartalom 5 és 10 súlyszázalék, a szénhidrát tartalom pedig 5 és 10 súlyszázalék között van.

Különösen előnyös, hogy a találmány szerint kapott szárított baktériumsejtanyag nem tartalmaz pigmenteket, toxikus anyagokat, tartalék anyagokat, mint a nyálkák és a polihidroxi-vajsav, zavaró illatanyagokat és szekunder metabolitokat.

A találmány szerinti eljárással kapott száraz baktériumsejtanyag ezért különösképpen alkalmas fehérjeforrásként élelmiszer és takarmány célokra.

Az új Methylomonas dara species FH—B—5460 ATCC 31226 a következőképpen jellemezhető:

I. Növekedési sajátságok:

a) Nem növekszik glukóz agaron vagy glukózos közegben, hús-bouillon agaron vagy hús-bouillon tápközegen, zselatinon, pepton agaron vagy tápközegen, lakmusztejen, burgonyatápközegen, aminosav tápközegen.

b) Növekszik metanolt tartalmazó szintetikus tápközegen.

II. Morfológia:

a) Rövid, 0,5-1,5 μ-os pálcikák, poláris csillókkal mozognak, nincs spóra- és cisztaképződés.

b) A kolónia forma kerek, áttetsző, enyhén fénylő.

c) Nincs pigmentképződés.

III. Fiziológia:

a) Növekedés: 20 °C-nál ± °C-nál ♦ 30°C-nál « 35 ^eC-nál **+ 37 °C-nál ~~ 39 °C-nál +++ 41 °C-nál ♦.

Optimális növekedési hőmérséklet: 37 °C.

Optimális pH érték: 6,8-7,0 Gram-negatív.

b) Növekedési faktorok: nem szükségesek.

c) Növekedési feltételek:

polihidroxivaj-	>	kataláz +,
sav-képződés indol-képződés		izocitrát- +,
aceton-képződés	9	dehidrogenáz malatde- +,
		hidrogenáz
nitrát redukálás	+ 9	oxidáz +,
dtokromoxidáz	*,	kénhidrogén- -,
zselatinelfolyósítás		képződés trimetilaminon -,
keményítőhidrolízis	~~ >	monometilaminon -,
dtfomsav-képződés		formiáton -,
tej koagulálás	9	formaldehiden -,
növekedés:		cukron, poli- —, szacharidokon alkoholokon -,
ammónium-sókon	⁺,	(metanolon kívül)
karbamidon	9	nitrogén +,
dimetilaminon	*,	megkötés széndioxid +.

megkötés

Az ismert Methylomonas fajtákat és az egyéb metanol értékesítő mikroorganizmusokat a Bergey’s Manual of Determinative Bacterology (VIII. kiadás, Williams és Wilkens Company, Baltomore 1) című műben íiják le, ezenkívül különböző publikációkban jellemzik a rokon törzseket. A következő I. táblázat a technika ezen állását mutatja az új Methylomonas dara species jellemző tulajdonságaival összehasonlítva. Miként a táblázat mutatja, a Pseudomonas fajták az új spedestől a polihidroxivajsav-képzésben és a metánon vagy dimetilaminon való növekedés hiányában térnek el. Az ismert Methylomonas fajták az új speciestől a hőmérsékleti optimumban, a pigment-képződésben, a polihidroxivajsav-képződésben és a kokkusz-formában térnek el. További fontos megkülönböztető jegy az új species és az ismert fajták között a hexulózfoszfát-út. Az új spedesnél energetikailag kedvezőbb a szerin-út szerinti metanol értékesítés.

A következő táblázat első oszlopának alján 'álló „G + C (%)” jel az ossz pirimidin-bázis tartalom guanin és citozin hányadát jelzi.

A 2. alatti oszlop az új Methylomonas dara ATCC 31226 jelű spedes adatait tartalmazza.

A 3.-7., valamint a 11. alatti oszlopban rokon törzsek adatait adjuk meg, melyeket a Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology (1974 évi

Vili, kiadás, The Williams és Wilkens Company/Baltimore) című műben írtak le.

A 8.-10. alatti oszlopokban az egyéb publikádókban megadott rokon fajok adatait közöljük. A Pseudomonas methanolica a 3 755 082 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, a Pseudomonas AM 1 a J. Bact., 114, (1), 390. (1973) alatti szakcikkben, a Pseudomonas methylotropa pedig a 2 161 164 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban került ismertetésre.

A táblázat fejlécén a számok a következő mikroorganizmusokat jelölik:

2. : Methylomonas dara FH-B-5460 ATCC 31226

3. : Methylomonas methanica

4. : Methylomonas methanooxidans

5. : Methylomonas methanonitrificans

6. : Methylococcus capsalaticus

7. : Methylosinus methylocystis

8. : Pseudomonas methanolica

9. : Pseudomonas AM 1

10. : Pseudomonas methylotropha

11. : Methylomonas methanica

I. táblázat

A mikro-

organizmus jele:	2.	3.	4.	5.	6.	Ί.	8.	9.	10.	11.
Sejtnagyság mikronban: -	0,5x1,5	0,6x1,0	1x3	1x2—2x4	lxl
Forma:	(pálcikák)	pálcikák	pálcikák	pálcikák	(gömbök)				pálcikák
Mozgékonyság:	+		+	4	—				4	(±)
Pigmentképzés:	(-)	ω	—	(0	—		ω
pHBS:	-	-	—	ω	—		4	—
Nitrogén megkötés: Széndioxid	(*)	-	( )	4
megkötés: Nitrogén-	(♦)		( )
forrásként NO₃:	(*)	4	( )		4
Optimális hőmérséklet: Növekedés	(37 °C)	(30 °C)	(30 °C)		37 °C (±)

aminosavakon: Szénforrásként	—

metanol:	4		4	4	4		4	4	4	4
Szénforráaként metán:	4	4	4	4	4		—	—	(-)	4
Szénfonásként etanol: Hexulóz-		-	-	4				(0	-	-
foszfát-út:	+		+	4	4	(♦)
Szerin-út: Formaldehid: Formiát:	(-)							__


Trimetilamid:										(-)
Dimetilamin:	4-					62,5			(-)
G+C (%)		50-54	50-54	50-54	62,5			54	52,1

levő táptalajt oltunk be. Ezt a fermentort éppen úgy kezeljük, mint a fő-kultúrát. A fermentor kiképzése is megegyező. A fermentációs körülmények a következők:

1. példa

A Methylomonas dara FH—B-5460 ATCC 31226 jelű törzset tenyésztéshez a következő összetételű táptalajt tartalmazó ferde csövecskékben tartjuk:

Agar	’ 18 g,
85%-os foszforsav	2,0 ml,
12%-os ammónium-hidroxid-oldat	3,0 ml,
dinátrium-hidrogén-foszfát	0,01 g,
kénsav	1,2 g,
magnézi um-szulfát-heptahidrát	0,8 g,
vas(II)-szulfát-heptahidrát	0,3 g,
metanol (a csövecskék betöltése
előtt adjuk hozzá)	10 ml,
nyomelem-oldat*	1,0 ml,
víz	1 liter.
A táptalaj pH-ja sterilizálás
előtt:	6,7.

^XA nyomelem-oldat réz(II)-szulfitot (CuSO₃), bórsavat (H₃BO₃), mangán(II).-szulfátot (MnSO₄), cink-szulfátot (ZnSO₄) és nátrium-molibdátot (Na₂MoO₄) tartalmaz.

A fenti összetételű táptalajt tartalmazó ferde csövecskéket autoklávban 30 percig 120°C-on tartjuk. Ezt követően a csövecskéket Methylomonas clara-val oltjuk be és 2 napig 37 °C-on tartjuk. Két csövecskéről 10 ml fiziológiás konyhasó-oldattal lemossuk a sejtanyagot, és a következő fokozatra át oltjuk.

Ez a fokozat egy rázatott kultúra (elő-kultúra), amelynél 2 literes, az előző táptalajból (agar nélkül) 1 litert tartalmazó Erlenmeyer lombikot alkalmazunk, és amelyhez 3,3 ml (sterilre szűrt) metanolt adunk. Ezt a kultúrát három napon át 37 °C-on 220 fordulat/perc fordulatszám és 4 cm-es amplitúdó beállításával rázatjuk. 24 és 48 óra után

3,3-3,3 ml metanolt adunk a kultúrához.

A következő tenyésztési fokozatot (fő-kultúra) 25 liter térfogatú fermentorban hajtjuk végre. A fermentorba mintegy 20 liter fenti összetételű táptalajt öntünk (metanolt és agart azonban nem tartalmaz). Sterilizáció (30 perc 120°C-on és 1,2-1,4 bar nyomáson) után a fermentort 2 liter elő-kultúrával oltjuk be. A lapos keverővei, levegőztető koszorúval és három beavatkozó nyílással ellátott fermentorban a következő fermentációs körülményeket állítjuk be:

hőmérséklet	37 °C,
levegőztetés	10 liter/perc, 0,5 wm,
nyomás	0,2 bar,
fordulatszám	500 fordulat/perc
PH	6,6.

ml -metanolt kimérünk, és minden esetben, ha a sejtek széndioxid-kibocsátása csökken, további 20 ml metanolt adagolunk a fermentorba. A metanol koncentráció eközben nem lesz nagyobb 0,1 térfogatszázaléknál.

óra eltelte után a fő-kultúra 20 liter fermentációs elegyével egy 200 literes elő-fermentorban

hőmérséklet	37 °C,
levegőztetés	6—8 m³/óra, 0,5—0,75 wm,
nyomás	0,2 bar,
fordulatszám	380 fordulat/perc,
PH	6,7.

A fermentációs elegy pH-ját steril ammónium-hidroxid-oldattal (10%-os) tartjuk 6,7-6,8 értéken. A metanol-beadagolást a fermentorból kijövő levegő metanol koncentrációjának lángionizációs detektor segítségével történő mérése útján szabályozzuk. A metanol koncentráció 50 ppm alá süllyedése esetén újból adagolunk be metanolt. Ha az eltávozó levegőben 600 vpm a metanol koncentráció, akkor az oldatban 0,22% metanol van.

óráig tartó fermentáció után az elő-fermentor 200 liter fermentációs elegy ével egy fő-fermentort oltunk be, ez 2000 liter táptalajt tartalmaz, és a következő üzemi adatokkal rendelkezik:

hőmérséklet	37 °C,
levegőztetés	60—80 m³/óra, 0,5—0,75 wm
nyomás	0,2 bar,
fordulatszám	170 fordulat/perc
PH	6,7.

A metanol beadagolás a 200 literes elő-fermentomál megadott módon történik. A metanol koncentrációt a táptalajban 50—80 ppm értéken tartjuk. 22 óra fermentációs idő után learatjuk a baktériumsejtanyagot. Ehhez a fermentációs elegy pH-ját hígított kénsav hozzáadásával .4,0 értékre állítjuk be, és a sejtanyagot 400 fordulat/perc fordulatszámmal szeparátorokban lecentrifugáljuk. A centrifugálást 6,5-6,8 pH-nál is el lehet végezni. A lecentrifugált sejtanyagot (szárazanyag tartalom = 20%) vízzel mossuk, és ezután szeparátorban 25% szárazanyag tartalomig centrifugáljuk. Ezt követően a sejtanyagot porlasztásos szárítóban 120—150 °C belépő hőmérséklettel megszárítjuk. Az így kapott por még mintegy 1,5-3,5% maradék nedvességet és (a nitrogén tartalom x 6,25 képlettel számolva) 85% nyers proteint,

74% aminosavat, melynek mintegy 50%-a esszenciális aminosav,

8-12% nukleinsavat,

6-8% nyers zsírt és

5—6% nyers hamut tartalmaz (a százalékok súlyszázalékot jelentenek).

2. példa

A Methylomonas dara FH-B—5460 ATCC 31226 jelű törzset az 1. példában leírt módon tenyésztjük.

A fő-fermentor egy 3000 literes, a folyamatos fermentádóra kialakított, állandóan levegőztetett fermentor. Üzemi adatai a következők:

hőmérséklet levegőztetés nyomás fordulatszám pH °C,

Nm³/óra, 0,67 wm,

0,1 bar,

390 fordulat/perc,

6,8.

A fŐ-fermentort az elő-fermentor 200 liter fermentációs elegyével oltjuk be. A fő-fermentor 2000 liter táptalajt tartalmaz (összetétele megegyezik az 1. példa elején megadottal, de nem 10 tartalmaz agart). A metanol koncentrációt az 1. példában leírt módon mérjük, és 40 :60 térfogatarányú metanol-víz elegy hozzáadásával úgy szabályozzuk, hogy a fermentorban 10 és 50 ppm közötti közepes szabad metanol koncentrációt tart- 15 sunk fenn a táptalajban.

A folyamatos üzemet 7-10 kg sejtanyag/liter termelése után indítjuk be.

A tápközeget 0,25/óra átfolyási aránnyal (D) adjuk hozzá, ezt az értéket mintegy 12 óra után 20 D = 0,33/órára emeljük, ami mintegy 650 liter/órát jelent. Ezen idő után beáll a folyási egyensúly. A közepes szabad metanol koncentrációt ekkor 10 és 20 ppm között tartjuk. Az elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó tápközeg megfelelő meny- 25 nyiségét leszívatjuk, egy közti tartályban metanol hozzáadása nélkül 1-2 órán át állni hagyjuk, majd végrehajtjuk az 1. példában leírt módon a sejt leválasztást és a szárítást.

Az így kapott sejtanyag 2—4% maradék nedvességet és (a nitrogén tartalom x6,25 képlettel számolva)

81% nyers proteint,

70% aminosavat, ahol az esszenciális anrinosavak mennyisége az ossz aminosav mennyiség 50%-a,

8—10% nukleinsavat, 5-10% nyers zsírt és

5—10% nyers hamut tartalmaz.

Az eljárás hozama nem folyamatos megoldás esetén 25—30 g/liter.

Folyamatos eljárásnál a hozam: 5—6 g/liter óra.

Az ismert eljárásoknál a kapott biomassza nem kívánatos nukleinsavtartalma legalább 15%, ezzel szemben a találmány szerinti eljárással kapott biomasszánál a nukleinsavtartalom előnyösen 12% alatt van.

Az ismert megoldásoknál a kapott biomassza aminosavtartalina mindössze 64%, ezzel szemben a találmány szerinti megoldással előállított biomasszában az aminosavtartalom 70-78% között van.

A találmány szerinti eljárással előállított sejtmassza (bioprotein) tulajdonságait az egyéb ismert fehérjeforrásokkal összehasonlítva az alábbi eredményeket kapjuk:

II. táblázat %-ban

Fehéijehordozó

Nem fehérje Aminosavak eredetű N Nyers zsír

Hamu

Szénhidrát

bioprotein	70	δ-
halliszt	56	10
szójadara	41	5
sovány tejpor	35	-

A bioprotein további előnye, hogy az aminosavak között nagy mennyiségben található lizin és triptofan, viszont a metionin- és cisztin-tartalom viszonylag csekély.

Claims

1. Eljárás baktériumsejtanyagnak a Methylomonas családba tartozó baktériumok aerob körülmények között, szénfonásként metanolt, nitrogénforrásokat és esszenciális ásványi sókat tartalmazó tápközegben végzett tenyésztésével történő

5-105-10

5 154

1 636

1 850 előállítására, azzal jellemezve, hogy a Methylomonas dara ATCC 31226 jelű törzset a táptalaj súlyára vonatkoztatva 5 és 150 ppm közötti menynyiségű metanolt tartalmazó táptalajon tenyésztjük 30-42 °C hőmérsékleten, 4,0-9,0 pH értéken percenként 0,1-1,5 liter levegő átfujása mellett, majd a kapott sejtanyagot ismert módon elkülönítjük, vízzel mossuk és szárítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést folyamatos üzemben, a tápközeg súlyára vonatkoztatva 5 és 30 ppm közötti metanol-koncentráció fenntartása mellett hajtjuk végre.