KR810000509B1 - 단세포 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

단세포 단백질의 제조방법

본 발명의 고도의 단백질, 지방, 탄수화물 및 비타민을 함유하는 단세포 단백질(세균균체괴 : Biomass)을 메틸로 모나스(Methylomonas) 속의 새로운 균주를 사용하여 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 제조된 생물질은 식품 및 동물사료를 제조하는데에 기본물질로 사용되고 있다.

탄소원으로서 단지 메탄올만을 이용하는 균주를 사용하여, 생물질을 제조하는 기지의 방법으로는 종종 색소, 생중합체 또는 폴리하이드록시 부티린산과 같은 바람직하지 않은 대사산물을 함유하는 생성물이 제조되므로 식물과 동물사료로서 사용함에 많은 제한을 받았다. 이러한 부수되는 물질의 색, 맛 또는 독성은 실제 생물질로 사용할 경우 제거되어야만 한다.

메틸로모나스 속의 새로운 균주는 유일한 탄소원으로 메탄올, 메탄 또는 디메틸아민을 이용할 수 있음을 알게되었다. 이 균주는 메틸로모나스 클라라(Methylomons Clara) FH-B-5460으로 명명되어 있으며 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Colletion)에 ATCC 31226이라는 등록번호로서 보존되어 있다.

본 발명 방법에 따라 질소원, 광물염 및 탄소원으로서 메탄올을 함유하는 영양배지중에서 메틸로모나스속의 균주를 배양하여 세균균체과(단세포 단백질)을 제조하는 방법에서 균주로서는 메틸로모나스 클라라속의 균주를 사용하며 메탄올농도는, 영양배지 중량으로하여 5-150ppm이다. 메탄올이 유일한 탄소원이다.

메탄올 농도를 5-100ppm으로 하는 것이 바람직하며, 연속조작에서의 농도는 5-30ppm이 바람직하다.

본 공정은 유일한 탄소원으로서 메탄올이외에 질소원으로서 질산칼륨, 황산암모니움, 인산암모니움 또는 암노니아로 구성되어 있는 영양배지를 함유하는 통기가 잘되는 발효기중에서 수행한다. 영양배지는 또 예를 들어 포태슘 디하이드로 게노포스페이트 또는 디소디움 하이드로 게노포스페이트 같은 인산류와 마그네슘염 및 칼륨염과 수도물에서 발견할 수 있는 미량원소, 특히 철, 구리 및 몰리브덴염들을 함유한다.

본 공정은 30-42℃의 온도범위에서 유효하게 수행되며 바람직한 온도는 35-39℃이다.

본 발명에 따른 공정은 기지의 발효용기 예를들어 통기되는 진탕용기 또는 예를들어 루프(loop)반응기 같은 현대식 발효기중에서 연속조작 또는 불연속조작으로 수행할 수 있다.

발효기중의 액체영양배지 1ℓ를 기준으로하여 분당 공기 0.1-1.5ℓ(vvm)를 공급해 준다.

유지되어야만 하는 메탄올 농도는 여러가지 방법 예를들어 현탁액중의 질소소비량과 생물질양을 측정하거나 또는 이산화탄소 방출량을 측정하여 계속하여 조절할 수 있으며 후자의 방법이 바람직하다. 후자의 방법에서 반응이 급속히 일어나 탄소원이 부족되는 경우에는 이산화탄소 방출이 감소되므로 가해야할 메탄올의 양을 정확히 계산할 수 있다. 달리는, FID(Flame Ionization Detector)를 사용하여 메탄올의 기체를 측정하므로서 메탄올의 농도를 특히 유용하게 조절할 수 있다.

영양배지와 성장하고 있는 세포물질로 구성되어 있는 배양용 현탁액의 pH는 4.0-9.0이며 바람직하기로는 6.0-7.2이다. 만일 배양용 현탁액의 pH가 필요로하는 값이하로 떨어지는 경우, 적당량의 알카리금속 예를들어 수산화나트륨 또는 수산화칼륨용액을 가하여 조정할 수 있다. pH가 너무 높을 경우에는 염산 또는 황산 같은 산을 가하여 pH를 조정할 수 있다.

세균균체괴은 통상의 방법 예를들어 필요에 따라 데칸터(Decantor) 및 분리기를 사용하여 물로 반복하여 세척하면서 원심분리시킴으로서 분리된다. 이리하여 얻어진 것은 수분을 75-95%(중량)함유하는 풀같은 세균균체괴(Biomass)이다.

건조는 여러방법 예를들어 드럼형의 건조기, 유동베드형 건조기 또는 분무형건조기를 사용하여 수행한다. 이렇게 얻어진 생성물은 수분을 1-4%(중량), 조단백을 80-90%(중량)함유한다. 이조단백의 아미노산 함량은 75-78%(중량)이며 필수아미노산의 함량은 전아미노산 함량의 약 50%(중량)이다. 이 생성물의 지방, 핵산 및 탄수화물 함량은 낮으며, 핵산함량은 10-14%(중량), 지방함량은 5-10%(중량), 탄수화물 함량은 5-10%(중량)이다.

이렇게 얻어진 세균균체괴 (단세포 단백질)은 색소, 독성물질, 생중합체 같은 저장물질, 폴리하이드록시부티린산, 바람직하지 않은 향기물질 또는 이차 대사산물중 어떤것도 함유하지 않는다.

그러므로 본 발명에 따라 얻어진 건조된 세균균체괴는 식품과 동물사료를 제조하기 위한 단백원으로 특히 적당하다.

새로운 균주인 메틸로모나스 클라라 FH-B-5460 ATCC 31226의 특성은 다음과 같다.

I. 성장상태 :

가) 성장되지 않는 배지 : 포도당 한천 또는 포도당배지, 육즙한천 또는 육즙영양배지, 젤라틴, 펩톤한천 또는 배지, 리트머스밀크, 감자영양배지, 아미노산영양배지.

나) 성장되는 배지 : 메탄올을 함유시킨 합성영양배지

II. 형 태 :

가) 0.5-1.5μ의 적은 간균으로 극성 편모에 의해 운동성이 있으며, 포자,포낭은 없다.

나) 원형집탁을 이루며 투명하고 약간 유리질이다.

다) 색소는 없다.

III. 생 리 :

가) 성장온도 : 20˚±

25℃ +

30℃ ++

몇몇기지의 메틸로모나스 종 균주와 메탄올을 이용하는 다른 균주는 버어지스 메뉴얼 오브 디터미터티브 박테리올로지(Bergy's Maual of Determinative Bacteriology 8판, Williams Wilkens Company, Baltimore, 1974)에 기술되어 있다. 또 이와 관련된 균주들은 여러 공공서에 공개되어 있다. 신종균주인 메틸로모나스 클라라와 기지의 균주의 특징적인 성질을 비교한 것이 다음 표에 나타나 있다. 슈도모나스(Pseudomonas)속의 균주는 폴리하이드록시 부티린산을 생성하지 못하고 메탄 또는 디메틸아민으로 성장하지 못한다는 점에서 신규의 균주와 다르다는 것을 표에서 알수 있다. 기지의 메틸로모나스 균주는 최적 온도 색소형성여부 폴리하이드록시 부티린산 및 이들의 구형 형태면에서 신규의 균주와 다르다. 신규의 균주와 기지의 균주간의 더욱 중요한 차이점은 헥수로즈 포스페이트 경로이다.

신규의 균주의 경우에 이러한 경로는 메탄올 이용과정에서 세린경로보다 에너지면에서 더욱 유리하다. 다음표(I)의 첫번째란 제일밑에 있는 G +C (%)는 전체의 피리미딘 염기중에 있는 구아닌과 시토신의 함량을 나타낸다.

두 번째란에는 신류의 균주인 메틸로모나스 클라라 31226의 특징이 기술되어 있다. 3-7번째란과 11번째 난은 이와 관련된 균주들로 버어지스 메뉴얼오브디터미너트브 박테리올로지 (8판, 1974, Williams Wilkens Com./Baltimore)에 기술되어 있는 균주들이다.

8-11번째란은 여러 공공서에서 선택한 이와 관련된 균주들 즉 슈도모나스 메탄올리카(Pseudomonas methanolica), (참조; 미국특허 제3,755,082호), 슈도모나스 AMI(참조; J.Bact., 114(1), 390, 1973), 슈도모나스 메틸오트로파(Pseudomonas methylotropa, 참조; 독일공개명세서 제2,261,164호)를 나타낸다.

[표 1]

다음의 실시예는 본 발명을 상술한다.

[실시예 1]

메틸로모나스 클라라 FB-B-5460 ATCC 31226 균주를 다음의 조성을 갖는 사면배지에서 배양시킨다.

pH는 멸균하기전 6.7로 맞춘다.

상기의 사면배지로 고압멸균기에서 30분동안 120℃까지 가열한다. 그후 균주인 메틸로모나스 클라라를 접종시키고 37℃에서 2일간 배양한다. 2개의 사면배지에서 얻은 세포괴를 생리 식염수로 현탁화하고 다음 단계에 이용한다.

본 단계는 진탕용 배양(전배양)이다. 이것을 영양액(한천을 제외하고는 상기 조성과 동일) 1ℓ를 함유하는 2ℓ짜리 삼각 플라스크에 가한다. 여기에 메탄올(멸균시 여과된것) 3.3ml를 가한다. 상기 배양약을 왕복거리 4cm인 진탕기가 달린 용기내에 넣고 37℃에서 3시간동안 220rpm으로하여 진탕시킨다. 24시간, 48시간후 각각 메탄올 3.3ml를 가한다.

다음 단계(주배양)는 영양액(한천을 제외하고는 상기 조성과 동일) 약 20ℓ를 함유하는 발효기상에서 반응된다. 1.2-1.4 압력하에 120℃에서 30분동안 멸균시킨후 전 배양액 2ℓ를발효기에 접종시킨다. 플래트 패들형 믹서기와 공기 송입바퀴, 3개의 조절판이 부착된 발효기내에서 다음 조건하에 발효시킨다.

메탄올 20ml를 가하고 세포의 CO₂방출이 감소될 때마다 매번 20ml를 더 가한다. 메탄올 농도는 용량당 대략 0.1%이다.

22시간후 200ℓ짜리 발효기에 주 배양용 현탁액 20ℓ를 접종시킨다. 이 발효기를 주 배양에서와 같은 방법으로 장치하고 처리한다. 발효는 다음조건하에서 수행한다 :

6.7-6.8로 맞춘다. 메탄올의 공급은 FID로 폐기 개스중의 메탄올 함량을 측정하여 조절하며 메탄올 농도가 50ppm이하로 떨어질때마다 매번 가해준다.

폐기개스 60vpm중의 메탄올의 농도는 용액중의 메탄올의 농도 0.22%와 상응한다.

20시간후 주 발효기에 전발효기에서 얻은 배양용 현탁액 200ℓ를 접종한다. 이것은 영약액 2000ℓ를 함유하는 발효기 중에서 다음 조건하에 배양한다.

메탄올을 200ℓ짜리 전 배양기에서 시행한 방법에 따라 가해준다. 영양액의 메탄올 농도는 50-80ppm의 범위내에 있다. 22시간동안 발효시킨후 세포를 다음과 같이 처리한다. 배양용 현탁액의 pH는 묽은 황산을 가해 4.0으로 맞추고 400rpm의 속도에서 분리기로 세포괴를 원심분리 시킨다. 또한 pH 6.5-6.8에서 원심분리시킬 수 있다. 분리시킨 세포괴(수분함량 80%)를 물에 세척시킨후 분리기내에서 건조물 함량이 25%가 될때까지 건조시킨다. 그후 세포괴를 120-150℃에서 분무 건조기로 건조시킨다. 얻은 분말은 여전히 수분함량이 1.5-3.5%이며 다음과 같은 조성을 함유한다.

[실시예 2]

메틸로모나스 클로라 FH-B-5460 ATCC 31226 균주를 상기 실시예 1 에 따라 배양한다.

주 발효기는 연속발효시 이용되며 3000ℓ용량을 갖는다. 다음 조건하에서 계속 공기를 송입시키고 처리한다 :

주 발효기는 영양액(환천을 제외하고는 상기 실시예 1의 조성과 동일) 2000ℓ를 함유하며, 전 발효기의 배양용 현탁액 200ℓ를 접종시킨다. 메탄올 농도는 상기에 상술한 방법에 따라 측정되며, 메탄올 : 물의 용량비가 60 : 40인 메탄올/물을 가하여 영양용 배지중의 평균 메탄올 농도를 10-50ppm으로 유지시킨다.

세포괴가 7-10kg/ℓ만큼 생성될때 연속적인 공기 송입을 시작한다.

영양용 배지를 시간당 0.25의 속도로 가하고 12시간후에 이 속도를 시간당 0.33으로 증가시키면 시간당 약 650ℓ가 된다. 메탄올의 평균 유리농도를 10-20ppm으로 유지시킨다. 세균이 성장되는 영양용 배지중 상응되는 양을 제거하여 메탄올을 가하지 않은 중간단계의 용기내에서 1-2시간동안 유지시키고 상기 실시예 1의 방법에 따라 세포를 분리시키고 건조시킨다.

얻은 세포괴는 수분함량이 2-4%이며 다음과 같은 조성을 갖는다.

Claims (1)

1. 메틸로모나스 클라라(Methylomonas clara) ATCC 31226 균주를 탄소원으로서 메탄올을 5내지 150ppm(중량)함유하며 질소원 및 필수 광물류를 함유하는 영양용 배지중에서 호기성 조건하에 배양시킴을 특징으로 하는 단세포 단백질의 제조방법.