NO326120B1

NO326120B1 - Mikroorganisme som produserer 5-aminolevulinsyre og fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre ved anvendelse derav

Info

Publication number: NO326120B1
Application number: NO995780A
Authority: NO
Inventors: Seiji Nishikawa; Tohru Tanaka; Tomomi Kaminaga; Nobuya Miyachi; Kikuo Watanabe; Keitaro Watanabe; Yasushi Hotta
Original assignee: Cosmo Res Institute; Cosmo Oil Co Ltd
Priority date: 1997-05-27
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2008-09-29
Also published as: WO1998054297A1; DE69829765D1; DE69829765T2; EP1018546A4; NO995780D0; DK1018546T3; US6342377B1; EP1018546B1; EP1018546A1; NO995780L

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en mikroorganisme som produserer og akkumulerer 5-aminolevulinsyre i en høy konsentrasjon, og vedrører fremgangsmåter for fremstilling av 5-aminolevulinsyre samt en fremgangsmåte for dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme.

5-aminolevulinsyre er en forbindelse som er omfattende tilstede i biosfæren som en prekursor for tetrapyrrolforbindelser og som spiller en viktig rolle in vivo. 5-aminolevulinsyre er en naturlig forbindelse som viser utmerkede funk-sjoner som f.eks. herbicider, insekticider, plantevekst-regulerende midler, plantefotosyntese-forsterkende midler o.l., og har også fordelaktige egenskaper som ingen toksi-sitet overfor mennesker og dyr og gir ingen rester i miljøet på grunn av dens høye nedbrytbarhet (se f.eks. JP-A-61-502814, JP-A-2-138201OSV.)

5-aminolevulinsyre har imidlertid et problem med at den mangler anvendelighet i forbindelse med de ovennevnte bruks-områder på grunn av dens høye produksjonsomkostninger (CHEMICAL WEEK, 29. oktober (1984)).

Følgelig, har en rekke kjemiske synteseprosesser blitt undersøkt (se f.eks. JP-A-2-76841), men tilfredsstillende prosesser er fremdeles ikke utviklet.

På den annen side er andre prosesser for fremstilling av 5-aminolevulinsyre også blitt undersøkt ved anvendelse av mikroorganismer som tilhører slekten Rhodobacterium, slekten Propionibacterium, slekten Methanobacterium, slekten Methanosarcina o.l. Prosessene med anvendelse av mikroorganismer som tilhører slekten Propionibacterium, slekten Methanobacterium, slekten Methanosarcina o.l. (se f.eks. JP-A-5-184376) er imidlertid ikke tilfredsstillende på grunn av at produksjonsutbyttet er svært lavt.

Fra E.L. Neidle et al., J. Bacteriol, vol 175, nr. 8, 1993,

s. 2304-2313 er det kjent en Rhodobacter sphaeroides bakterie som produserer 5-aminolevulinsyre.

Fra Tohru Taneka et al., Biotechnology Letter, Vol. 13, nr. 8, s. 589-594 er det kjent en mutant stamme av Rhodobacter sphaeroides som produserer 5-aminolevulinsyre.

Det er kjent at purpur ikke-svovelbakterier, slik som mikroorganismer som tilhører slekten Rhodobacterium, slekten Rhodopseudomonas, o.l. har en stor evne til å syntetisere tetrapyrrolforbindelser ved anvendelse av 5-aminolevulinsyre som et metabolisk mellomprodukt. Bruk av disse mikroorganismer har imidlertid et problem ved at den fremstilte 5-aminolevulinsyre metaboliseres til tetrapyrrolforbindelser slik at en ønsket mengde av 5-aminolevulinsyre ikke akkumuleres.

Siden biosyntese av 5-aminolevulinsyre reguleres på kompli-sert måte in vivo er det således ikke lett å oppnå en stamme som er i stand til å akkumulere 5-aminolevulinsyre i en høy konsentrasj on.

På den annen side er det foreslått en metode med anvendelse av en mutant stamme av slekten Rhodobacterium som er i stand til å akkumulere 5-aminolevulinsyre i en maksimal mengde på 14,3 mM hvor glukose anvendes som en karbonkilde (JP-A-8-1683 91) . Denne metode kan imidlertid ikke betraktes som en industrielt fordelaktig metode fordi det er nødvendig å holde en oppløst oksygenkonsentrasjon på et lavt nivå under dyrking slik at lufttilførsel til dyrkingskaret må gjennomføres ved tilførsel av en blanding av luft og en nitrogengass.

Denne metode krever også oksygen når 5-aminolevulinsyre. akkumuleres aerobt ved anvendelse av glukose som karbonkilden. Følgelig er det en mulighet for at 5-aminolevulinsyre produseres effektivt selv under betingelser hvor oksygen er tilstrekkelig tilstede fordi den oppløste oksygenkonsentrasjon reduseres på grunn av mikroorganismens oksygen-, forbruk. Det er imidlertid ikke mulig å danne 5-amino-. levulinsyre effektivt under betingelser med en relativt høy konsentrasjon av oppløst oksygen.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en mikroorganisme som kan danne 5-aminolevulinsyre effektivt selv under betingelser hvor konsentrasjonen av oppløst oksygen er relativt høy uten at det kreves tilførsel av en nitrogengass e.l. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre ved anvendelse av mikroorganismen.

I forbindelse med de ovennevnte betingelser har oppfinnerne til den foreliggende oppfinnelse gjennomført omfattende studier med det formål å oppnå en mikroorganisme som kan danne 5-aminolevulinsyre effektivt og som et resultat har man funnet en fremgangsmåte for å selektere 5-aminolevulinsyre-akkumulerende mikroorganismer med høy produktivitet og, ved anvendelse av denne metode, har man deretter funnet en mikroorganisme som er i stand til å akkumulere 5-aminolevulinsyre i en høy konsentrasjon selv med en relativt høy konsentrasjon av oppløst oksygen. Den foreliggende oppfinnelse er således oppnådd på bakgrunn av dette.

De foreliggende oppfinnere har også utviklet en påfallende effektiv prosess for å selektere 5-aminolevulinsyre-akkumu-lerende mikroorganismer som kan evaluere et stort antall mutant-stammer ved passende å forandre sakkarider, glycin, levulinsyre o.l., og en gjentatt mutantbehandling er blitt mulig. De foreliggende oppfinnere har således oppnådd å frembringe en stamme som er i stand til å akkumulere 5-aminolevulinsyre i en høy konsentrasjon. Deretter ble den foreliggende oppfinnelse fullført ved å etablere en dyrkings-prosess hvor sakkarider, glycin, levulinsyre, jernkomponenter, o.l. passende tilsettes, og hvor oppløst oksygen og redoks potensialet til dyrkingsmediet er kontrollert.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme med en 5-aminolevulinsyre-syntaseaktivitet fra 2 til 7 nmol/min/mg protein under aerobe dyrkingsbetingelser og med en konsentrasjon av oppløst oksygen fra 0,70 til 6,60 ppm, hvori mikro organismen er Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 med depone-ringsnummer FERM BP-6320 eller en mutant stamme derav.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre som omfatter dyrking av minst en slik 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme ifølge oppfinnelsen og med utvinning av 5-aminolevulinsyre fra den resulterende kultur.

Videre, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre som omfatter dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme i et medium som inneholder en jernkomponent i en mengde fra 5 til 500/xM og med utvinning av 5-aminolevulinsyren fra den resulterende kulturblanding, hvori den 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme er minst en av mikroorganismene ifølge oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en fremgangsmåte for å dyrke en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme som omfatter dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganismer i et medium som inneholder en jernkomponent i en mengde fra 5 til 500/iM, hvori den 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme er minst en av mikroorganismene ifølge oppfinnelsen.

Kort forklaring av tegningen

Fig. 1 er en grafisk fremstilling som viser en sammenheng mellom oppløst oksygen og 5-aminolevulinsyre-syntaseaktivitet.

Den 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme i henhold til oppfinnelsen kan f.eks. oppnås ved å anvende en vill-stamme eller en mutant stamme av en purpur ikke-svovel-bakterie som en moderstamme, underkaste denne for en mutasjonsbehandling og selektere en stamme med en 5-aminolevulinat-syntaseaktivitet fra 2 til 7 nmol/min/mg protein under betingelser med en konsentrasjon av oppløst oksygen fra 0,70 til 6,60 ppm, foretrukket en 5-aminoleyulinsyre-syntase aktivitet fra 3,5 til 5,6 nmol/min/mg protein ved en konsentrasjon av oppløst oksygen fra 1,46 til 5,86 ppm.

Den etterfølgende metode kan eksemplifiseres spesifikt.

Et flytende medium hvor en moderstamme kan vokse fremstilles først i et prøverør og steriliseres, og deretter inokuleres moderstammen i mediet og dyrkes under rysting. De således dyrkede celler vaskes med en buffer og underkastes en mutasj onsbehandling.

Som mutasjonsbehandling kan en generell mutasjonsmetode anvendes. Eksempler på denne inkluderer en metode hvor cellene i moderstammen som er dyrket på et agarmedium bestråles med et fysisk mutagen, slik som UV-stråler, ioniserende stråling e.l., og en metode hvor moderstammen dyrkes i en buffer hvor-til et kjemisk mutagen inkluderende et alkyleringsmiddel slik som etylmetansulfonat (EMS), N-metyl-N'-nitro-N-nitro-soguanidin (NTG), etyl-nitrosourea (ENU), e.l., og en base-analog, som bromdeoksyuridin (BrdUrd) e.l., er blitt tilsatt. Cellene som således er behandlet ved hjelp av de ovennevnte mutasjonsmetoder vaskes igjen med en buffer og utspres på et agarmedium for dyrking. Seleksjonen av en stamme med de ovennevnte egenskaper fra de således dyrkede mutant-stammer gjennomføres ved hjelp av de etterfølgende trinn.

Hver av de således oppnådde mutant-stammer dyrkes i et prøve-rør e.l., og levulinsyre og glycin tilsettes dertil etter cellevekst. Etter tilsetting av disse forbindelser blir mengden av akkumulert 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet målt for å selektere en stamme med høy 5-aminolevulinsyre-produktivitet.

For å dyrke og evaluere et større antall mikroorganismer, er det effektivt og foretrukket å anvende en mikrotiterplate. I tillegg kan seleksjonen gjennomføres effektivt når målingen av 5-aminolevulinsyre gjennomføres ved hjelp av Ehrlich reaksjonen fordi den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre kan erkjennes visuelt.

Seleksjonen gjennomføres ved å selektere omtrent 1 til 100 stammer med høy 5-aminolevulinsyre-produktivitet fra omtrent15 000 mutant-stammer oppnådd ved den første mutasjonsbehand- lingen, og deretter blir en stamme med stabil vokseevne og produktivitet valgt fra de således valgte stammer ved å sub-dyrke dem i prøverør eller på agarplater. I dette tilfellet er det også foretrukket å anvende Ehrlich reaksjonen og et mikrotiter.

Ved anvendelse av den således oppnådde stamme som moderstammen, gjentas den ovenfor angitte mutasjonsbehandling og seleksjon. Når produktiviteten av 5-aminolevulinsyre øker ved repetisjon av mutasjonen forandres den optimale konsentrasjon av levulinsyre som skal tilsettes i enkelte til-feller, slik at det er foretrukket å forandre konsentrasjonen av levulinsyre som passende skal tilsettes.

Stammen som således er oppnådd ved repetisjon av mutasjons-formering, som har evnen til å akkumulere en betydelig mengde 5-aminolevulinsyre under aerobe betingelser, har en egenskap med at ett av de 5-aminolevulinsyre metabolisme-relaterte enzymer, nemlig 5-aminolevulinat-syntase, økes. I tillegg, til forskjell fra tilfellet med villstammer av fotosyntetiske bakterier fra den samme slekt, vil inhibering av 5-aminolevulinat-syntaseaktivitet nesten ikke forekomme i den således oppnådde mutant-stamme selv under slike betingelser at konsentrasjonen av oppløst oksygen i kulturmediet overskrider 2 ppm.

Med hensyn til moderstammen for anvendelse i det første trinn i den overfor angitte metode, anvendes en stamme som viser god vekst på en billig karbonkilde slik som glukose e.l., under aerobe betingelser og som har en høy evne til å syntetisere tetrapyrrolforbindelser slik som bakterieklorofyll é.l. Den nevnte stammen er Rhodobacter sphaeroides CR-002 (FERM P-15312) .

Stammen oppnådd ved den ovenfor angitte mutasjon og seleksjon er en stamme som er blitt betegnet Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 og som er deponert internasjonalt som FERM BP-6320 7. april, 1998, ved National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Denne stammen som er i stand til å akkumulere en betydelig mengde 5-aminolevu linsyre er blitt oppnådd ved gjentagende mutasjon og seleksjon av den ovenfor angitte Rhodobacter sphaeroides CR-002. Da Rhodobacter sphearoides CR-0072009 er en stamme som er oppnådd ved mutasjon av Rhodobacter sphaeroides CR-002 som beskrevet over, er de fleste av dens bakteriologiske egenskaper identiske med dem til stammen CR-002.

Bakteriologiske egenskaper til Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 er beskrevet i det etterfølgende.

(a) Morfologiske egenskaper

Størrelse og form på cellen:

0,5 x 1 til 2,5/xm, stavbakterier, flere celler forbundet med hverandre i hovedakseretningen Sporer: fraværende

(b) Vekst på agarmedium

Glansfull, rødaktig, brun sirkulær koloni på mediet i

tabell 1

(c) Fysiologiske egenskaper

Gramfarging:

Reduksjon av nitrat: +

Oksydase: +

Glukosefermentering: -

Vekstområde: pH 4,0 til 9,0, 10°C til 40°C

(d) Kjemotaksonomiske egenskaper

DNA G/C innhold (mol%): 68

Quinontype: Q-10

Karotenoid:

+ (hovedkomponenter: kloroksantin, metylkloroksantin) Bakterieklorofyll: +

(e) Andre vekstbetingelser o.l.

Fotosyntetisk vekst:

Svært svak i mediet i tabell. 1. Skjønt dens opprinnelige stamme er en fotosyntetisk bakterie, er evnen til å gjennomføre fotosyntetisk vekst redusert. Assimilering av glukose (aerobt): + Assimilering av natriumacetat (aerobt): +. 5-aminolevulinatdehydratase-aktivitet:1/3eller lavere sammenlignet med originalstammen (CR-002) ved aerob dyrking.

Produksjonsbetingelsene for 5-aminolevulinsyre ved anvendelse av Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 er beskrevet i det etterfølgende. Med hensyn til produksjonsbetingelsene for5-aminolevulinsyre, kan generelle mikroorganisme-dyrkingsbetingelser anvendes. Eksempler på karbonkilden inkluderer sakkarider slik som glukose o.l., eller syrer som eddiksyre, malinsyre, ravsyre o.l., og sakkarider er særlig fordelaktige sett på bakgrunn av økonomiske forhold. Eksempler på nitro-genkilden inkluderer uorganiske nitrogenkilder som f.eks. ammoniakk-nitrogenforbindelser som ammoniumsulfat, ammonium-klorid o.l., og nitratnitrogenforbindelser som natriumnitrat o.l., og uorganiske nitrogenkilder som glycin, urea, polypep-ton, gjærekstrakt, casaminosyre o.l. Blant disse tilsettes glycin foretrukket for å forbedre produktiviteten av 5-aminolevulinsyre. Mengden tilsatt glycin er foretrukket i området fra 10 til 1000 mM, mere foretrukket fra 10 til 400 mM. Det er også foretrukket å anvende glycin i en mengde fra 10 til 200 mM pr. tilsetning og tilsette denne mengde flere ganger. Videre kan om nødvendig andre komponenter som vitaminer, uorganiske salter o.l. tilsettes til mediet alt etter behov.

Det er kjent at mikroorganismer som tilhører purpur ikke-svovelbakteriene slik som slekten Rhodobacterium, slekten Rhodopseudomonas o.l. generelt har 5-aminolevulinatdehydratase som metaboliserer dannet 5-aminolevulinsyre. Da 5-aminolevulinatdehydratase-aktivitet imidlertid er signifikant redusert i stammen i henhold til oppfinnelsen, kan 5-aminolevulinsyre akkumuleres ekstracellulært uten å tilsette en 5-aminolevulinsyredehydratase-inhibitor, som levulinsyre, men tilsettingen av en liten mengde av inhibitoren er effektiv med hensyn til å forbedre 5-aminolevulinsyre-produktivitet. I dette tilfellet er den mengden inhibitor som skal tilsettes foretrukket innen et område fra 0,01 til 20 mM, mere foretrukket fra 0,1 til 10 mM. Hvilke som helst dyrkingsbetingelser kan anvendes så lenge Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 kan vokse, men generelt er foretrukne betingelser dyrking ved en temperatur fra 10°C til 40°C, mere foretrukket fra 20°C til 35°C, og i et medium med en pH fra 4 til 9, mere foretrukket fra 5 til 8.

Når pH i mediet fluktuerer under dyrkingen er det også foretrukket å innstille til det ovenfor angitte området med en alkalisk oppløsning, slik som natriumhydroksyd, ammoniakk e.l., eller med en syre som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre e.l.

Fremstilling av 5-aminolevulinsyre kan gjennomføres samtidig med eller uavhengig av mikrobeveksten. I dette tilfellet er mikroorganismen for anvendelse enten voksende celler eller hvilende celler, som kan anvendes som sådan for fremstill-ingen av 5-aminolevulinsyre eller etter øking av celletettheten, f.eks. ved å utvinne cellene ved anvendelse av et apparat slik som en sentrifuge e.l., og deretter resuspendere de utvunnede celler i en passende oppløsning, slik som et medium, en fosfatbuffer e.l.

For videre å forbedre produktiviteten av 5-aminolevulinsyre, er det foretrukket å kontrollere konsentrasjonen av oppløst oksygen og redoks-potensialet i dyrkingsmediet til henholdsvis områdene fra 0,001 til 2 ppm og -220 mV til 50 mV, mere foretrukket fra 0,001 til 1 ppm og -200 mV til 0 mV. Eksempler på kontrollmetoden i dette tilfellet inkluderer en metode hvor omrøringshastigheten eller lufttilførselsmengden endres, en metode hvor mikroorganismens respirasjon aktiveres ved å tilsette sakkarider, gjærekstrakt e.l.,. og en kombina-sjonsmetode derav.

For å kontrollere oppløst oksygen og redoks-potensialet på en mer stabil måte er det effektivt å tilsette en jernkomponent til mediet for det formål å øke veksthastigheten til mikroorganismen og derved stabilisere respirasjonsaktiviteten. Jernkomponenten for anvendelse er foretrukket et jernsalt, og jern-valens-jernet er ikke spesielt begrenset. Eksempler på jernforbindelsen inkluderer ferriklorid, jern (III) sulfat, jerncitrat, o.l. Når en naturlig substans som gjærekstrakt, maisstøpevæske e.l. anvendt som en mediumkomponent inneholder en jernkomponent i en nødvendig mengde, kan den anvendes som jernforbindelsen. Det er foretrukket å tilsette jernkomponenten til mediet i en mengde fra 5 tiM 500 iiM som jern. Dersom mengden er mindre enn 5 iiM, kan det ikke oppnås effekt med hensyn til å akselerere mikrobevekst eller stabilisere respirasjonsaktivitet, og dersom mengden er større enn 500/xM kan mikrobevekst inhiberes. En konsentrasjon av jernkomponent en er foretrukket fra 10 til 3 00/iM, mere foretrukket fra 20 til200 iiM. Jernforbindelsen kan også være inkludert i mediet på forhånd eller den kan tilsettes på et senere stadium.

Om nødvendig kan den således dannede 5-aminolevulinsyre separeres og renses ved vanlig anvendte teknikker slik som en ionebyttermetode, en kromatografimetode, en ekstråksjons-metode o.l.

Eksempler

Den foreliggende oppfinnelse skal nå forklares i det etter-følgende på grunnlag av eksempler.

Eksempel 1

10 ml av et glutamat/glukosemedium (medium 1) som vist i tabell 1 ble helt inn i et prøverør med diameter 21 mm, sterilisert ved 121°C i 15 min og fikk deretter stå for avkjøling. En løkke ("loopful") av Rhodobacter sphaeroides CR-0 02 (FERM P-15312) ble inokulert i mediet og dyrket under rysting i mørket ved 3 0°C i 2 døgn.

Inn i et annet prøverør med diameter 21 mm ble 10 ml av medium l innhelt på samme måte som beskrevet over. En 0,5 ml porsjon av det ovennevnte dyrkingsmedium ble inokulert i mediet og dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 18 timer. Dyrkingsmediet ble sentrifugert ved 3000 x g i 5 min for vasking, den oppnådde supernantant ble fjernet og cellene ble deretter suspendert i det samme volum av en Tris-maleat buffer (pH 6,0). Dette vasketrinn ble videre gjentatt to ganger.

Deretter ble suspensjonen sentrifugert ved 3000 x g i 5 min, den oppnådde supernantant ble fjernet og cellene ble suspendert i en Tris-maleat buffer (pH 6,0) som inneholdt 100//g/ml NTG og dyrket statisk med romtemperatur i 80 min.

De således muterte celler ble vasket tre ganger på samme måte som beskrevet over og deretter inokulert i et prøverør som inneholdt sterilisert medium 1 og dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 2 døgn.

Det således oppnådde dyrkingsmedium ble fortynnet og utspredt på et agarplatemedium som var fremstilt ved å tilsette 15 g/l agar til medium 1 og sterilisere blandingen ved 121°C i 5 min, og cellene ble dyrket i mørket ved 32°C i 4 døgn.

Som et resultat ble omtrent 15 000 kolonier oppnådd. Deretter ble sterilisert medium 1 helt inn i steriliserte 96-brønns mikrotiterplater méd 0,2 ml pr. brønn, og hver av de ovenfor beskrevne omtrentlige 15 000 mutant-stammer ble inokulert i mediet.

Etter dyrking under rystingen i mørket ved 30°C i 48 timer på en mikroplateryster, ble glycin og levulinsyre tilsatt til hver brønn for å gi en endelig konsentrasjon på 30 mM, etterfulgt av dyrking under omrøring i 24 timer ved de samme betingelser.

5-aminolevulinsyre ble detektert i hver brønn som beskrevet i det etterfølgende (Ehrlich reaksjon).

(1) ' Dyrkingsmediet i hver brønn ble overført til en annen mikrotiterplate og blandet med 0,1 ml av en IM acetatbuffer som inneholdt 1% acetylaceton, og mikrotiterplaten ble for-seglet, inkubert ved 100°C i 15 min og deretter raskt avkjølt på is. (2) Deretter ble 0,1 ml av en eddiksyreoppløsning som inneholdt 2% p-dimetylaminobenzaldehyd og 16% perklorsyre tilsatt til hver brønn og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 15 min for å observere utviklingen av en rødaktig purpur farge ved Ehrlich reaksjonen. (3) Deretter ble en del av reaksjonsoppløsningen tatt ut og underkastet TLC analyse for å utelukke stammer som viste en rødaktig purpur farge som ikke var avledet fra 5-aminolevulinsyre, for derved å selektere 6 mutanstammer med høy produktivitet av 5-aminolevulinsyre.

Hver av de således oppnådde 6 stammer ble dyrket i mørket ved 3 0°C i 48 timer ved anvendelse av et prøverør som inneholdt medium 1, og det oppnådde dyrkingsmedium ble utspredt på et agarplatemedium med en sammensetning som medium 1 og dyrket for å danne kolonier.

Deretter ble sterilisert medium 1 helt inn i brønner i en sterilisert 96-brønns mikrotiterplate med 0,2 ml pr. brønn og hver av de valgfritt valgte 60 kolonier avledet fra hver av de ovenfor angitte stammer ble inokulert i mediet.

Etter dyrking med rysting i mørket ved 32°C i 4 8 timer på en mikroplateryster, ble glycin tilsatt til hver brønn til å gi en sluttkonsentrasjon på 30 mM, og 30, 15 eller1mM levulinsyre ble tilsatt til brønnene svarende til 20 kolonier av de ovenfor angitte 60 kolonier. Dyrking under omrøring ble fortsatt i 24 timer ved de samme betingelser, og en del av dyrkingsmediet ble tatt ut fra hver brønn for å understreke produktiviteten av 5-aminolevulinsyre og en optimal konsentrasjon av levulinsyre ved hjelp av Ehrlich reaksjonen. Denne prosedyren ble gjentatt tre ganger, og en mutant-stamme med stabil høyere produktivitet enn CR-0 02 ble isolert ved anvendelse av en økning i produktiviteten og variasjon av produktiviteten blant kolonier som indekser. Denne stamme ble betegnet CR-150. Den optimale konsentrasjonen av levulinsyre var 3 0 mM. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre i tilfellet med tilsetting av 3 0 mM levulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen av Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-002 en produktivitet på 0,01 mM, mens produktiviteten til stammen CR-150 var 0,1 mM.

Eksempel 2

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-150 for derved å oppnå omtrent15000mutant-stammer. Ved å underkaste dem for seleksjons-forsøk på samme måte som i eks. 1, ble en mutant-stamme CR-268 som har en forbedret produktivitet i forhold til CR-150 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-2 68 en produktivitet på 0,3 mM.

Eksempel 3

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-268 for derved å oppnå omtrent 15 000 mutant-stammer. Ved å underkaste dem for seleksjons-forsøk på samme måte som i eks. 1, ble en mutant-stamme CR-3 68 med ytterligere forbedret produktivitet i forhold til CR-268 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved553nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-368 en produktivitet på 0,5 mM.

Eksempel 4

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-368 for derved å oppnå omtrent 15 00 0 mutant-stammer. Ved å underkaste dem for seleksjons-forsøk på samme måte som i eks. 1, ble en mutant-stamme CR-405 med en forbedret produktivitet i forhold til CR-368 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-405 en produktivitet på 1,0 mM.

Eksempel 5

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-405 for derved å oppnå omtrent 15 000 mutant-stammer. Ved å underkaste dem for seleksjons-forsøk på samme måte som beskrevet i eks. 1 unntatt at mengden levulinsyre som tilsettes ble forandret til 15 mM, ble en mutant-stamme CR-502 som har en forbedret produktivitet i forhold til CR-4 05 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-405 en produktivitet på 1,2 mM, mens produktiviteten til stammen CR-502 var 2,1 mM.

Eksempel 6

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-502 for derved å oppnå omtrent 15000mutant-stammer. Ved å underkaste dem for seleksjons-forsøk på samme måte som beskrevet i eks. 1 med unntak av at mengden levulinsyre som tilsettes ble forandret til 1 mM, ble en mutant-stamme CR-660 som har en forbedret produktivitet i forhold til CR-502 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, viste stammen CR-502 en produktivitet på 2,4 mM, mens produktiviteten til stammen CR-660 var 3,3 mM.

Eksempel 7

Den samme prosedyre som i eks. 1 ble gjentatt, unntatt at stammen ble forandret til CR-660 for derved å oppnå omtrent 15 00 0 mutant-stammer. Ved å underkaste disse for selek-sjonsforsøk på samme måte som beskrevet i eks. 1, unntatt at mengden levulinsyre som tilsettes ble forandret til 1 mM, ble mutant-stammer CR-0072001, CR-0072002 og CR-0072009 som har forbedret produktivitet i forhold til CR-660 oppnådd. Når den akkumulerte mengde 5-aminolevulinsyre ble bestemt ved å måle absorbansen for Ehrlich reaksjonen ved 553 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, var produktivitetene for stammene CR-0072001, CR-0072002 og CR-0072009 henholdsvis 5,9, 5,6 og 4,6 mM.

Eksempel 8

Hver av mutant-stammene CR-0072001, CR-0072002 og CR-0072009 oppnådd i eks. 7 ble inokulert i en rystekolbe med kapasitet på 500 ml som inneholdt 2 00 ml medium 1 og dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 48 timer på en resiprok ryster. Etter dyrking ble de resulterende celler utvunnet ved sentrifuge-ring ved 5000 x g i 10 min og suspendert i medium 2 som vist i tabell 2 til å gi en densitet på 0,5 g våte celler/10 ml, og 3 ml av suspensjonen ble helt inn i prøverør på 21 mm. Cellene i de således fremstilte prøverør ble dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 20 timer på en resiprok ryster, og mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet ble målt ved metoden etter Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, Nr. 8, s. 1494, 1990). Som et resultat var produktiviteten til stammer CR-0072001, CR-0072002 og CR-0072009 henholdsvis 19,0, 21,5 og 31,0 mM.

Eksempel 9

Mutant-stammen CR-0072009 ble inokulert i en konisk kolbe med kapasitet på 3 00 ml utstyrt med ledeplater inneholdende 50 ml medium 3 som vist i tabell 3 og dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 48 timer på en roterende ryster. Det oppnådde dyrkingsmedium ble inokulert i en fermentor med kapasitet 3 1 som inneholdt 1,8 1 medium 3 og ble dyrket med rysting ved 32°C med en lufttilførselsmengde på 0,36 l/min og ved 400 opm. Etter dyrking i 40 timer mens pH i mediet reguleres til 6,5 - 6,6 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd, ble 0,210 g levulinsyre, 8,1 g glycin og 18 g gjærekstrakt (D-3, produsert av Japan Pharmaceutical) tilsatt til mediet og dyrkingen ble fortsatt ved forandring av omrøringshastig-heten til 325 opm og ved å regulere pH i mediet til 6,3 - 6,4 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd. En 8,1 g porsjon glycin ble tilsatt 12, 2 6 og 3 8 timer deretter. Dyrkingen ble stanset 50 t etter tilsetting av levulinsyre. Mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet var 60 mM som målt ved metoden etter Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, Nr. 8, s. 1494, 1990). Gjennomsnittlig konsentrasjon av oppløst oksygen i dyrkingsmediet etter tilsetting av levulinsyre var 0,01 ppm. Også redoks-potensialet i dyrkingsmediet forandret seg innen området fra -180 mV til -50 mV etter tilsetting av levulinsyre.

Eksempel 10

Mutant-stammen CR-0072 009 ble inokulert i en konisk kolbe som var utstyrt med ledeplater og med kapasitet 300 ml som inneholdt 50 ml av medium 3 og ble dyrket med rysting i mørket ved 32°C i 48 t. Det oppnådde dyrkingsmedium ble inokulert inn i en fermentor med kapasitet 3 1 som inneholdt 1,8 1 medium 3 og dyrket med omrøring ved 32°C og med en lufttil-førselsmengde på 0,36 l/min og 400 opm. Etter dyrking i 40 timer mens pH i mediet ble regulert til 6,5 - 6,6 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd, ble 0,210 g levulinsyre, 8,1 g glycin og 18 g gjærekstrakt tilsatt til mediet og dyrkingen ble fortsatt ved å forandre lufttil-førselsmengden og omrøringshastigheten til henholdsvis 0,72 l/min og 600 opm, og pH i mediet ble regulert til 6,3-6,4 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd. En 8,1 g porsjon glycin ble tilsatt 12, 26 og 38 timer deretter. Dyrkingen ble stanset 50 timer etter tilsetting av levulinsyre. Mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet var 13 mM som målt ved metoden etter Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, Nr. 8, s. 1494, 1990). Gjennomsnittlig konsentrasjon av oppløst oksygen i dyrkingsmediet var 2,3 ppm etter tilsetting av levulinsyre. Også redoks-potensialet i dyrkingsmediet forandret seg innen området fra 50 mV til 70 mV etter tilsetting av levulinsyre.

Eksempel 11

Mutant-stammen CR-0072 009 ble inokulert i en konisk kolbe med kapasitet på 3 00 ml utstyrt med ledeplater inneholdende 50 ml av medium 3 og ble dyrket under rysting i mørket ved 32°C i 48 timer på en roterende ryster. Det oppnådde dyrkingsmedium ble inokulert i en fermentor med kapasitet 3 1 som inneholdt 1,8 1 av medium 3 og. dyrket med omrøring ved 32°C med en luft-tilførselsmengde på 0,36 l/min og 400 opm. Etter dyrking i 40 timer mens pH i mediet ble regulert til 6,5 - 6,6 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd, ble 0,210 g levulinsyre, 8,1 g glycin og 18 g gjærekstrakt tilsatt til mediet og dyrkingen ble fortsatt ved å forandre lufttil-førseismengden og omrøringshastigheten til henholdsvis 0,18 l/min og 200 opm, og pH i mediet ble regulert til 6,0 - 6,5 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd. En 8,1 g porsjon av glycin ble tilsatt 12 og 24 timer deretter. Dyrkingen ble stanset 50 timer etter tilsetting av levulinsyre. Mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet var 15 mM som målt ved metoden etter Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, Nr. 8, s. 1494, 1990). Konsentrasjonen av oppløst oksygen i dyrkingsmediet var etter tilsetting av levulinsyre mindre enn deteksjonsgrensen. I tillegg forandret redoks-potensialet i dyrkingsmediet seg etter tilsetting av levulinsyre innen området fra -220 mV til -180 mV.

Som beskrevet i eks. 7 er mutant-stammen CR-0072 009 oppnådd ved gjentatt mutasjon ved anvendelse av Rhodobacter sphaeroides CR-002 som moderstammen, en stamme som kan produsere 5-aminolevulinsyre i en markert større konsentrasjon ved anvendelse av rimelige materialer som glukose, glycin o.l.,

slik at det er mulig å danne 5-aminolevulinsyre i en industriell målestokk ved anvendelse av denne stammen. I tillegg, som det fremgår fra resultatene i eks. 10 og 11, er det foretrukket å regulere konsentrasjonen av oppløst oksygen i dyrkingsmediet til 2,0 ppm eller lavere etter tilsetting av levulinsyre, eller redoks-potensialet i dyrkingsmediet innen området fra -220 mV til 50 mV, for å øke produktiviteten, og en slik regulering kan lett gjennomføres ved å nedsette om-røringshastigheten.

Eksempel 12

Mutant-stammen CR-0 072 00 9 ble inokulert i hver av de tre koniske koblene som er utstyrt med ledeplater med kapasitet 3 00 ml og som inneholdt 50 ml medium 3 og dyrket med roterende rysting i mørket ved 32°C i 48 t. Det oppnådde dyrkingsmedium i en kolbe ble inokulert inn i en av de tre fermentorkarene med kapasitet 3 1 som inneholdt 1,8 1 medium 3 og dyrket ved 32°C. Dyrkingen ble fortsatt i 90 timer med en lufttilførselsmengde på 0,36 l/min og en omrøringshastig-het på 400 opm mens pH i mediet ble regulert til 6,5 - 6,6 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd, unntatt at omrøringshastigheten for ett av de tre kar ble forandret til 250 opm 2 5 timer etter dyrking. Under dyrkingen ble konsentrasjon av oppløst oksygen og 5-aminolevulinat-syntaseaktivitet målt. 5-aminolevulinat-syntaseaktiviteten ble målt som beskrevet i det etterfølgende.

En omtrent 3 0 ml porsjon av dyrkingsmediet ble tatt ut og sentrifugert for å oppnå celler. De således oppnådde celler ble vasket med en fosfatbuffer (50 mM, pH 7,2), resuspendert i 5 ml i den samme buffer, de ble nedbrutt ved hjelp av en "French" presse på vanlig måte og sentrifugert ved 10 000 x g i 3 0 min, og den således oppnådde supernantant ble anvendt som en uren enzymoppløsning av 5-aminolevulinsyre-syntase. En enzymreaksjonsoppløsning ble fremstilt ved å tilsette 50 mM glycin, 0,1 mM pyridoksalfosfat, 1 mM EDTA og 1,0 mg protein/ml av den ovenfor angitte urene enzymoppløsning til 1 ml av en fosfatbuffer (50 mM, pH 7,2). Denne ble blandet med suksinyl-CoA til å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2 mM og inkubert ved 37°C. Etter inkubasjonen i 15 min ble reaksjonen stanset ved å tilsette 1 ml 10 vol% trikloreddiksyre. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert ved 3 500 opm i 10 min, 1 ml av den oppnådde supernantant ble blandet med 2 ml av en IM acetatbuffer (pH 4,7) som inneholdt 1% acetylaceton og blandingen fikk reagere ved 100°C i 15 min og ble deretter avkjølet med is. En 3,5 ml porsjon av Ehrlichs reagens ble tilsatt dertil for, 15 min deretter, å måle mengden av dannet pyrrolforbindelse basert på absorbansen med 553 nm og for derved å beregne den mengden 5-aminolevulinsyre (a) som var .. dannet ved hjelp av en enzymreaksjon.

En dannelses-rate for 5-aminolevulinsyre ble beregnet på grunnlag av den etterfølgende formel og anvendt som 5-aminolevulinsyre-syntaseaktiviteten. Sammenhengen mellom konsentrasjon av oppløst oksygen i dyrkingsmediet og 5-aminolevulinsyre-syntaseaktiviteten under dyrkingen er vist i fig. 1 og tabell 4.

I fig. 1 svarer også en 10% konsentrasjon av oppløst oksygen til 0,7 ppm, og en konsentrasjon av 90% oppløst oksygen svarer til 6,6 ppm.

v: enzymaktivitet (nmol/min/mg protein)

a: 5-aminolevulinsyre i 1 ml enzymreaksjonsoppløsning (nmol) p: mengde protein i 1 ml enzymreaksjonsoppløsning (= 1 mg)

t: reaksjonstid (= 15 min)

Sammenlikningseksempel 1

Prosedyren i eks. 10 ble gjentatt unntatt at stammen ble forandret til CR-002. Resultatene er vist i fig. 1 og tabell 4.

Som det fremgår fra fig. 1 vil inhibering av 5-aminolevulinat-syntaseaktivitet, som er vanlig i villstammer av fotosyntetiske bakterier, nesten ikke forekomme i stammen CR- 0072009 selv under slike betingelser at konsentrasjonen av oppløst oksygen i dyrkingsmediet overskrider 2 ppm.

Eksempel 13

Det etterfølgende forsøk ble gjennomført ved anvendelse av medium 3 anvendt i eks. 9, unntatt at gjærekstrakten i mediet ble forandret til 5,0 g/l gjærekstrakt B produsert av en annen produsent (B-2, produsert av Oriental Yeast). På samme måte som i eks. 9 ble mutant-stammen CR-0072009 dyrket under omrøring i 48 timer i en konisk kolbe utstyrt med ledeplate og med kapasitet på 300 ml, og det oppnådde dyrkingsmedium ble inokulert i 1,8 1 medium 3 fremstilt ved anvendelse av gjærekstrakt B i en fermentor med kapasitet 3 1 og dyrket ved 32°C med en lufttilførselsmengde på 0,36 l/min og ved 400 opm, og dyrkingen ble fortsatt ved tilsetting av 0,210 g levulinsyre, 8,1 g glycin og 18 g gjærekstrakt B og omrør-ingshastigheten ble nedsatt til 325 opm. Etter tilsetting av levulinsyre forble konsentrasjonen av oppløst oksygen på et nivå av 0,5 ppm i omtrent 4 timer men begynte å øke etter 5

t. Etter 6 timer var den økt til 4 ppm og dannelsen av 5-aminolevulinsyre stanset ved 10 mM. Når ferriklorid ble tilsatt dertil for å gi en sluttkonsentrasjon på 2 0 iiM, ble

konsentrasjonen av oppløst oksygen igjen redusert til 0,5 ppm eller lavere og dannelsen av 5-aminolevulinsyre startet igjen innen 2 timer etter tilsettingen, slik at glycin ble tilsatt i 8,1 g porsjoner 12, 26 og 38 timer deretter. Dyrkingen ble stanset 50 timer etter tilsetting av levulinsyre. Mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet var 4 0 mM som målt ved metoden etter Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, Nr. 8, S. 1494, 1990) .

Som det fremgår fra eks. 13 har tilsettingen av en.jern-forbindelse effekten med hensyn å gjenvinne respirasjon.

Referanseeksempel1.

Ved undersøkelse med ICP massemetoden, var mengden jern i gjærekstrakten anvendt i eks. 9, gjærekstrakt B anvendt i eks. 13 og en annen gjærekstrakt C fra en annen produsent (Industrial Yeast Extract, produsert av Oriental Yeast) som anvendt i de etterfølgende eksempler henholdsvis 73 iig, 25 iig og 155 iig pr. g av hver gjærekstrakt.

Disse resultater viser at mengden jern i medium 3 fremstilt ved anvendelse av disse gjærekstrakter er henholdsvis 6,64, 2,27 og 14,1/xM. Det er således funnet at 2 0/xM jern er

inneholdt i dyrkingsmediet på tidspunktet med dannelsen av 5-aminolevulinsyre i eks. 9, og mediet i eks. 13 inneholder 6,8/xM jern før tilsetting av forbindelsen og 2 6,8/xM etter jern-tilsetting.

Eksempel 14

Mutant-stammen CR-0072009 (1 ml dyrkingsmedium oppnådd ved å dyrke stammen i 48 timer ved anvendelse av 10 ml gjærekstrakt C i et forsøksrør med diameter 21 mm (optisk tetthet ved 660 nm, 0,2)) ble inokulert i en konisk koble som var utstyrt med ledeplater med kapasitet 3 00 ml som inneholdt 50 ml av et medium fremstilt ved å tilsette 0,5, 10, 20, 50, 200 eller 10 0 0/xM ferriklorid til medium 3 hvor dets gjærekstrakt har blitt erstattet med 3 g/l gjærekstrakt C og stammen ble dyrket med omrøring i mørket ved 32°C. Når jernkomponenten som inneholdt gjærekstrakten er inkludert, inneholder dette medium et totalt jerninnhold som vist i tabell 5. Resul-' tåtene av målingene av celletettheten som optisk tetthet ved 660 nm 30 timer etter dyrking er også vist i tabell 5.

Som det fremgår fra tabell 5 har tilsettingen av en passende mengde jernkomponent effekten med en økning i veksthastigheten.

Eksempel 15

Det samme volum av mutant-stammen CR-0072009 som beskrevet i eks. 14 ble inokulert i en konisk koble som var utstyrt med ledeplater med kapasitet 300 ml som inneholdt 50 ml av et medium fremstilt ved å tilsette 2 0/xM ferriklorid til medium 3 hvor gjærekstrakten deri var blitt erstattet med 3 g/l gjærekstrakt C, og stammen ble dyrket under roterende rysting i mørket ved 32°C i 48 t. En del av det oppnådde dyrkingsmedium ble inokulert inn i 1,8 1 av det ovenfor angitte medium i en fermentor med kapasitet 3 1 og dyrket under om-røring ved 32°C og med en lufttilførselsmengde på 0,36 l/min og ved 400 opm. Etter dyrking i 24 timer ble 0,210 g levulinsyre, 8,1 g glycin og 9 g gjærekstrakt tilsatt til mediet og dyrking ble fortsatt ved at rotasjonshastigheten ble nedsatt til 325 opm og pH i mediet ble regulert til 6,3 - 6,4 ved anvendelse av svovelsyre og natriumhydroksyd. En 8,1 g porsjon av glycin ble videre tilsatt 12, 26 og 38 timer deretter. Dyrkingen ble stanset 50 timer etter tilsetting av levulinsyre. Mengden 5-aminolevulinsyre i dyrkingsmediet var 55 mM som målt ved hjelp av metoden' etter Okayama et al.

(CLINICAL CHEMISTRY, vol. 36, nr. 8, s. 1494, 1990). I dette tilfellet var den gjennomsnittlige konsentrasjon av oppløst oksygen i dyrkingsmediet etter tilsetting av levulinsyre 0,01 ppm. Redoks-potensialet i dyrkingsmediet etter tilsetting av levulinsyre forandret seg også innen området fra -180 mV til

-50 mV.

Industriell anvendbarhet

Mikroorganismen ifølge den foreliggende oppfinnelse har ut-merket produktivitet av 5-aminolevulinsyre, og 5-aminolevulinsyre -produksjonsmetoden ved anvendelse av mikroorganismen krever ikke spesifikke midler, slik som innføring av nitrogengass e.l., selv under betingelser hvor konsentrasjonen av oppløst oksygen er relativt høy slik at 5-aminolevulinsyre kan dannes på en industriell fordelaktig måte.

Claims

1. 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme,karakterisert vedat den har en 5-aminolevulinsyre-syntaseaktivitet fra 2 til 7 nmol/min/mg protein under aerobe dyrkingsbetingelser og med en konsentrasjon av oppløst oksygen fra 0,70 til 6,60 ppm, hvori mikroorganismen er Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 med depone-ringsnummer FERM BP-6320 eller en mutant stamme derav.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre,karakterisert vedat den omfatter dyrking av minst en av de 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganismer som er angitt i krav 1, og med utvinning av 5-aminolevulinsyre fra den oppnådde kultur.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, hvori levulinsyre eller glycin tilsettes under dyrking.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, hvori glycin tilsettes i en mengde på 10-200 mM pr. gang.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 2 til 4, hvori dyrkingen gjennomføres ved en konsentrasjon av oppløst oksygen fra 0,001 til 2 ppm eller et redoks-potensial fra -220 mV til 50 mV i kulturen.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av 5-aminolevulinsyre,karakterisert vedat den omfatter dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme i et medium som inneholder en jernkomponent i en mengde fra 5 til 50 0/xM, og med utvinning av 5-aminolevulinsyre fra den oppnådde kultur, hvori den 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme er minst en av mikroorganismene som angitt i krav 1.

7.Fremgangsmåte for dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme, karakterisert vedat den omfatter dyrking av en 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme i et medium som inneholder en jernkomponent i en mengde fra 5 til 500/xM, hvori den 5-aminolevulinsyre-produserende mikroorganisme er minst en av mikroorganismene i krav 1.