WO1998054297A1 - Micro-organismes produisant l'acide 5-aminolevulinique et procedes de production de cet acide a l'aide de ces micro-organismes - Google Patents

Micro-organismes produisant l'acide 5-aminolevulinique et procedes de production de cet acide a l'aide de ces micro-organismes Download PDF

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WO1998054297A1
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aminolevulinic acid
acid
producing
microorganism
culture
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PCT/JP1998/002321
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Seiji Nishikawa
Tohru Tanaka
Tomomi Kaminaga
Kikuo Watanabe
Nobuya Miyachi
Keitaro Watanabe
Yasushi Hotta
Original Assignee
Cosmo Research Institute
Cosmo Oil Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism capable of producing and accumulating 5-aminolevulinic acid at a high concentration and a method for producing 5-aminolevulinic acid using the microorganism.
  • 5-Aminolevulinic acid is a compound that exists widely in the biosphere as a precursor of a tetrapyrrole compound and plays an important role in living organisms.
  • 5-Aminolevulinic acid has an excellent effect as a herbicide, insecticide, plant growth regulator, plant photosynthesis enhancer, etc., has no toxicity to humans and livestock, and has high degradability, so it is environmentally friendly. It is a natural compound having excellent properties, such as no persistence (see Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Sho 61-520184, Hei 2-138201).
  • 5-aminolevulinic acid has a problem of high production cost and lacks practicality for use in the above applications (CHEMICAL WEEK / OCTOBER, 29, 1984).
  • Microorganisms of red non-sulfur bacteria such as Rhodobacterium and Rhodopseudomonas are known to have a high ability to synthesize tetrapyrrole compounds using 5-aminolevulinic acid as a metabolic intermediate.
  • the produced 5-aminolevulinic acid is metabolized to a tetrapyrrole compound, and there is a problem that a desired amount of 5-aminolevulinic acid is not accumulated.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of efficiently producing 5-aminolevulinic acid without introducing nitrogen gas or the like even under conditions where the concentration of dissolved oxygen is relatively high.
  • Another object of the present study is to provide a method for producing 5-aminolevulinic acid using the microorganism.
  • the present inventors have conducted intensive studies to obtain a microorganism that efficiently produces 5-aminolevulinic acid.
  • a method for selecting levulinic acid-accumulating microorganisms was found, and by this method, a microorganism capable of accumulating 5-aminolevulinic acid at a high concentration even when the dissolved oxygen concentration was relatively high was found, and the present invention was completed.
  • the present inventors have developed a method for selecting an extremely efficient 5-aminolevulinic acid-accumulating microorganism capable of evaluating a large number of mutant strains by appropriately changing the addition of saccharides, glycine, levulinic acid, and the like.
  • the development enabled repeated mutation treatment.
  • strains that accumulate 5-aminolevulinic acid at high concentrations were successfully bred.
  • the present invention has been completed by appropriately adding saccharides, glycine, levulinic acid, iron, and the like, and establishing a culture method for controlling dissolved oxygen and redox potential in a culture solution.
  • the 5-aminolevulinic acid synthase activity is 2 to 7 (nmol / min / mg protein) under aerobic culture conditions in which the dissolved oxygen concentration is 0.70 to 6.6 O ppm.
  • the present invention also provides a method for producing 5-aminolevulinic acid, comprising culturing one or more microorganisms producing 5-aminolevulinic acid and collecting 5-aminolevulinic acid from the obtained culture. It is.
  • the present invention is characterized in that a 5-aminolevulinic acid-producing microorganism is cultured in a medium containing 5-500 // M iron component, and 5-aminolevulinic acid is collected from the obtained culture.
  • the present invention provides a method for producing 5-aminolepnic acid.
  • the present invention provides a method for culturing 5-aminolevulinic acid-producing microorganisms, which comprises culturing 5-aminolevulinic acid-producing microorganisms in a medium containing 5-500 iron components.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between dissolved oxygen and 5-aminolevulinic acid synthase activity.
  • the 5-aminolevulinic acid-producing microorganism of the present invention may be prepared, for example, by treating a wild-type or a mutant of a red non-sulfur bacterium as a parent strain and subjecting the wild-type strain to a mutant strain. Under the condition that 5-aminolevulinic acid synthase activity is 2 to 7 (nmol / min / mg protein), preferably at a dissolved oxygen concentration of 1.46 to 5.8.6 ppm, It can be obtained by selecting a strain having an activity of 3.5 to 5.6 (nmol / minZmg protein).
  • a liquid medium in which the parent strain can grow is prepared in a test tube, sterilized, inoculated with the parent strain, and cultured with shaking. After the grown cells are washed with a buffer, a mutation operation is performed.
  • ordinary mutation means can be used.
  • physical mutagens such as ultraviolet rays and ionizing radiation are irradiated to a parent strain on an agar medium, ethyl methanesulfonate (EMS), N-methinole N'-nitro-1-N-nitrosogazine (NTG),
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • NTG N-methinole N'-nitro-1-N-nitrosogazine
  • a method of culturing the parent strain in a buffer containing a chemical mutagen such as an alkylating agent such as ethyl nitrosourea (ENU) or a base analog such as bromodeoxyperidine (BrdUrd) can be used. a chemical mutagen such as an alkylating agent such as ethyl nitrosourea (ENU) or a base analog such as bromodeoxyperidine (BrdUrd) can be used.
  • the cells treated by the mutation means as described above are further washed with a buffer, spread on an agar medium or the like, and cultured. In order to select a strain having the above properties from the mutants grown by this culture, the following steps are performed.
  • the obtained mutant is cultured in a test tube or the like, and after the cells are grown, levulinic acid and glycine are added. After adding these, the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid in the culture solution may be measured, and a strain having a large amount of 5-aminolevulinic acid may be selected.
  • a microtiter plate In order to culture and evaluate more microorganisms, it is efficient and preferable to use a microtiter plate. Further, if the measurement of 5-aminolevulinic acid is performed by Erich reaction, the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid can be visually recognized, so that the selection can be performed efficiently. First, about 1 to 100 strains with high productivity of 5-aminolevulinic acid were selected from about 15,000 strains of mutant strains obtained by a single mutation treatment. This is done by subculturing the strain on a test tube or agar plate and selecting more strains with stable growth and productivity. Also at this time, it is preferable to use an Ehrlich reaction or a microtiter plate.
  • strains capable of repeated mutation breeding and capable of accumulating a significant amount of 5-aminolevulinic acid under aerobic conditions are characterized by enhanced 5-aminolevulinic acid synthase among enzymes involved in metabolism of 5-aminolevulinic acid. It has the characteristic that there is.
  • a parent strain used first in the above method it is preferable to use a wild type strain of a red non-sulfur bacterium or a mutant strain thereof. Particularly, under aerobic conditions, it grows well on an inexpensive carbon source such as glucose, It is preferable to use a strain having a high tetrapyrrole synthesis ability.
  • Such preferred strains include those belonging to the genus Rhodobacterium, in particular, Rhodobactor sp. Spheroides or mutants thereof. FERMP-1553 12) and the like are preferred parent strains.
  • the strain obtained by the above mutation and selection is preferably a bacterium of the genus Rhodobacterium, in particular, a mutant of Rhodopactor S. hueroides, specifically, named Rhodopactor.
  • FERMBP-632 entered the International Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on April 7, 1998 (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Those deposited are preferred.
  • This strain is This strain was obtained by repeatedly mutating and selecting Rhodopactor S. hueroides CR-002, and is a strain capable of accumulating a significant amount of 5-aminolevulinic acid.
  • Mouth Dopactor sufheroides CR-0072009 strain was obtained by mutagenesis from Mouth Dactor's Sphuloides CR-002 strain as described above. The same is true.
  • Rhodopactor 'Shueroides CR-0072009 strain will be described.
  • the production conditions of 5-aminolevulinic acid using the 5-aminolevulinic acid-producing microorganism of the present invention will be described focusing on the case where the Rhodopactor 'Shu-Mouth Ides CR-0 07209 strain is used.
  • the production conditions of 5-aminolevulinic acid ordinary microbial culture conditions can be applied.
  • sugars such as glucose, or acids such as acetic acid, malic acid, and succinic acid can be used as the carbon source, and saccharides are particularly advantageous in terms of price.
  • the nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonium nitrogen compounds such as ammonium sulfate and sodium chloride, and nitrate nitrogen compounds such as sodium nitrate; and organic nitrogen sources such as glycine, urea, polypeptone, yeast extract, and casamino acid. Can be used.
  • glycine is preferably added to improve the production of 5-aminolevulinic acid.
  • the added amount of glycine is preferably in the range of usually 10 to 100 OmM, and particularly preferably in the range of 10 to 40 OmM.
  • the amount of glycine to be added at one time is preferably 10 to 20 mM, and it is preferable to add glycine several times.
  • components such as vitamins and inorganic salts may be added to the medium.
  • It belongs to the red non-sulfur bacteria such as oral bacterium and oral genus Drosophila.
  • Microorganisms generally have 5-aminolevulinic acid dehydratase and are known to metabolize the generated 5-aminolevulinic acid.
  • the strain of the present invention has a markedly reduced 5-aminolevulinic acid dehydratase activity, so that the 5-aminolevulinic acid dehydratase inhibitor such as levulinic acid can be added without adding a 5-aminolevulinic acid dehydratase inhibitor.
  • Aminolevulinic acid can accumulate extracellularly, but the addition of a small amount of an inhibitor is effective in improving the ability to produce 5-aminolevulinic acid.
  • the addition amount is preferably in the range of 0.01 to 20 mM, particularly preferably in the range of 0.1 to 10 mM.
  • the culturing conditions all the conditions under which the Rhodopactor 'Shueroides CR-007200 9 strain can be grown can be used, but in general, the culturing temperature is preferably 10 to 40 ° C, particularly preferably 20 to 35 ° C.
  • the pH of the medium is preferably 4 to 9, particularly preferably 5 to 8.
  • the pH changes during culturing, it is preferable to adjust the pH to the above range with an alkaline solution such as sodium hydroxide, ammonia, sodium hydroxide, or the like, or an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid.
  • an alkaline solution such as sodium hydroxide, ammonia, sodium hydroxide, or the like, or an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid.
  • the production of 5-aminolevulinic acid can be carried out simultaneously with the growth of the microorganism, but can also be carried out independently.
  • the microorganism used in this case may be either a proliferating cell or a quiescent cell, and can be used as it is for the production of 5-aminolevulinic acid. It can be used with a higher bacterial concentration, such as by resuspension in an appropriate solution such as a liquid.
  • the amount of dissolved oxygen in the culture broth in the range of 0.001 to 2 ppm and the oxidation-reduction potential in the range of 122 to 5 OmV. More preferably, they are in the range of 0.001 to lppm, respectively, and in the range of 20 to 100 OmV.
  • a control method at this time a method of changing the number of rotations of the stirring or the amount of aeration, a method of adding microorganisms such as sugars and yeast extract to activate the respiration of microorganisms, or a combination thereof can be used.
  • the iron component used here is preferably a salt thereof.
  • the valence of iron is not particularly limited.
  • the iron component include ferric chloride, ferric sulfate, and iron citrate.
  • a natural component such as yeast extract or corn steep liquor used as a medium component contains a necessary amount of iron, it can be used as an iron component.
  • the iron component is preferably added to the medium as iron so that the iron content is 5 to 500.
  • a particularly preferred concentration of the iron component is 10 to 300 ⁇ M, more preferably 20 to 200 ⁇ M.
  • the iron component may be contained in the medium in advance, or may be added later.
  • the produced 5-aminolevulinic acid can be separated and purified as necessary by conventional methods such as ion exchange, chromatography, and extraction.
  • Glutamate / glucose medium (medium 1) 1 Oml shown in Table 1 was dispensed into a 2 lmm0 test tube, sterilized at 121 ° C for 15 minutes, and allowed to cool.
  • one platinum loop of Mouth Dopactor hollow-tube (FERMP-1531312) was inoculated, followed by shaking culture at 30 ° C in the dark for 2 days.
  • the culture was centrifuged at 300 Og for 5 minutes for washing, the supernatant was discarded, and the culture was suspended in the same amount of Tris-maleate buffer (pH 6.0) as before centrifugation. This washing operation was repeated twice more.
  • the bacterium thus mutated was washed three times in the same manner as described above, and then transferred to a test tube in which sterilized medium 1 was dispensed, and cultured with shaking in a dark place at 32 ° C for 2 days.
  • the 5- aminolevulinic acid in each well was detected as follows (Erich reaction).
  • the above 6 strains were cultured at 30 ° C. for 48 hours in one test tube of medium 1 and spread on an agar plate having the composition of medium 1 to form a colony.
  • 0.2 ml / well of sterile medium 1 was dispensed into a sterilized 96-well microplate, and 60 colonies derived from each of the above colonies were arbitrarily selected and inoculated. did.
  • the optimal concentration of levulinic acid was 3 OmM.
  • the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid was quantified using the microplate reader to determine the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid when 30 raM of levulinic acid was added.
  • the CR-150 strain was 0. ImM.
  • Example 3 The same operation as in Example 1 was carried out except that the strain to be used was CR-150 strain, and about 15,000 mutant strains were induced. A selection test was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a mutant CR-268 strain having improved productivity compared to the CR-150 strain. When the accumulated amount of 5-aminolevulinic acid was quantified using a microplate reader based on the absorbance at 553 nm of the Erythritz reaction, the CR-268 strain was found to be 0.3 mM.
  • Example 3 Example 3
  • Example 4 The same operation as in Example 1 was performed using the strain CR-268 as the strain to be used, and about 15,000 mutant strains were induced. A selection test was performed in the same manner as in Example 1 to obtain a mutant CR-368 strain having improved productivity as compared to the CR-268 strain. The amount of accumulated 5-aminolevulinic acid was quantified using a microplate reader based on the absorbance at 553 nm of the Erich reaction. As a result, the strain of strain 368 was 0.5 mM.
  • Example 4 The amount of accumulated 5-aminolevulinic acid was quantified using a microplate reader based on the absorbance at 553 nm of the Erich reaction. As a result, the strain of strain 368 was 0.5 mM.
  • Example 5 The same operation as in Example 1 was performed using the strain CR-368 as the strain to be used, and about 15,000 mutant strains were induced. A selection test was performed in the same manner as in Example 1 to obtain a mutant strain CR-405 having improved productivity compared to the CR-368 strain. Using a microplate reader When the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid was quantified by the absorbance at 553 nm of the Erich reaction, the CR-405 strain was found to be 1. OmM.
  • Example 5 Example 5
  • Example 6 The same operation as in Example 1 was carried out except that the strain to be used was CR-405 strain, and about 15,000 mutant strains were induced. A selection test was performed in the same manner as in Example 1 except that the concentration of levulinic acid to be added was 15 m, to obtain a mutant strain CR-502 having improved productivity as compared to the CR-405 strain. Using a microplate reader, the accumulated amount of 5-aminolevulinic acid was quantified by the absorbance at 553 nm of the Erich reaction. The CR-405 strain was 1.2 m, whereas the CR-502 strain was 2. ImM. Example 6
  • Example 7 The same operation as in Example 1 was performed using the strain CR-502 as the strain to be used, to thereby induce about 15,000 mutant strains.
  • a selection test was performed in the same manner as in Example 1 except that the concentration of levulinic acid to be added was 1 mM, and a mutant strain CR-660 having improved productivity as compared to the CR-502 strain was obtained.
  • the amount of accumulated 5-aminolevulinic acid was determined by the absorbance at 553 nm of the Erich reaction.
  • the CR-502 strain was 2.4 mM, whereas the CR-660 strain was 3 mM. It was 3 mM.
  • Example 7 Example 7
  • Example 8 The same operation as in Example 1 was performed using the strain CR-660 as the strain to be used, to thereby induce about 15,000 mutant strains.
  • a selection test was performed in the same manner as in Example 1 except that the concentration of levulinic acid to be added was changed to ImM, and mutants with improved productivity compared to the CR-660 strain CR-007 7201, CR-0072002, CR-0072009 Got the strain.
  • Use a microplate reader to store 5-aminolevulinic acid based on the absorbance at 553 nm of the Erich reaction. When the volume was quantified, the strains of CR-0072001, CR-0072002, and CR-00 72009 were 5.9, 5.6, and 4.6 m, respectively.
  • Example 8 Example 8
  • the mutant strains CR-0072001, CR-0072002, and CR-0072009 strains obtained in Example 7 were inoculated into a 50-Oml permeation flask prepared by preparing 20 Oml of the culture medium 1, and incubated at 32 ° C in the dark for 48 hours. Reciprocal shaking culture was performed. After culturing, centrifuge at 500 Og for 10 minutes to collect the cells, suspend them in the following medium 2 so that the wet cell weight becomes 0.5 gZl Oml, and dispense 3 ml into 21 ⁇ test tubes. did.
  • the test tube obtained in this way is cultured in a dark place at 32 ° C with reciprocal shaking, and the 5-aminolevulinic acid in the culture solution after 20 hours is purified by the method of Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494, 1990).
  • Okayama et al. CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494, 1990.
  • the strains CR-0072001, CR-0072002, and CR-0072009 were 19.0, 21.5, and 31. OmM, respectively.
  • the mutant CR-0072009 strain was inoculated into a 30 Oml Erlenmeyer flask with baffle prepared by preparing 5 Oml of Medium 3 and culturing with shaking in the dark at 32 ° C for 48 hours.
  • 1.8 L of the medium 3 was prepared in a 3 L fermenter, the whole amount was inoculated, and cultured with stirring at 32 ° C., aeration of 0.36 LZ and 40 Orpm.
  • the culture is continued while controlling the pH to 6.5 to 6.6 using sulfuric acid and sodium hydroxide. After 40 hours of culture, 0.210 g of levulinic acid, 8.
  • the average value of the dissolved oxygen concentration in the culture solution after the addition of levulinic acid was 0.1 ppm.
  • the redox potential in the culture solution after the addition of levulinic acid was in the range from -18 OmV to -5 OmV. Table 3
  • the mutant CR-0072009 strain was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask with a baffle prepared by preparing 50 ml of Medium 3 and culturing with shaking at 32 ° C. for 48 hours. This was inoculated into a 3 L fermenter in which 1.8 L of medium 3 was prepared, and the mixture was inoculated at 32 ° C, aeration rate of 0.36 L / min, and 40 Orpm with stirring.
  • PH 6.5 with sulfuric acid and sodium hydroxide Continue culturing while controlling to 6.6.
  • the mutant CR-0072009 strain was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask with baffle prepared by preparing 50 ml of Medium 3 and culturing with shaking in a dark place at 32 ° C. for 48 hours. This was inoculated into a 3 L fermenter in which 1.8 L of medium 3 was prepared, and the mixture was inoculated at 32 ° C, aeration rate of 0.36 L / min, and 40 Orpm with stirring.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution after the addition of levulinic acid was below the detection limit. Further, the oxidation-reduction potential in the culture solution after the addition of levulinic acid was in the range from 122 OmV to 18 OmV.
  • the strain CR-0072009 obtained by repeatedly mutating the oral strain of S. ssploides CR-002 as a source bacterium was glucose and glycine. It is a strain that can produce 5-aminolevulinic acid at a dramatically higher concentration using inexpensive raw materials, and it is possible to industrially produce 5-aminolevulinic acid using this strain. .
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution after adding levulinic acid was 2.Oppm or less, or the oxidation-reduction potential in the culture solution was reduced to It is desirable to control in the range of 22 OmV to 5 OmV, and this can be easily performed by reducing the number of rotations of the stirring.
  • the culture was sampled at about 3 Oml, and the cells were collected by centrifugation.
  • the collected cells were washed with a phosphate buffer (50 mM, pH 7.2), resuspended in 5 ml of a buffer of the same composition, and disrupted with a French press using a conventional method. After centrifugation for 30 minutes, the resulting supernatant was used as a crude 5-aminolevulinic acid synthase enzyme solution.
  • 1 ml of a phosphate buffer (50 mM, pH 7.2) contains 5 OmM of glycine, 0. ImM of pyridoxal phosphate and EDTAlmM, and the above crude enzyme solution is converted to 1.Omg Zml in terms of protein.
  • an enzyme reaction solution was prepared. To this was added succinyl CoA at a concentration of 0.2 mM and incubated at 37 ° C. After 15 minutes, the reaction was stopped by adding 1 ml of 1 Ovol% triclomouth acetic acid.
  • the 5-aminolevulinic acid production rate was determined by the following equation (1), and this was defined as the 5-aminolevulinic acid synthase activity.
  • the relationship between the concentration of dissolved oxygen in the culture solution and the activity of 5-aminolevulinic acid synthase at that time is shown in FIG.
  • a dissolved oxygen concentration of 10% corresponds to 0.7 ppm
  • a dissolved oxygen concentration of 90% corresponds to 6.6 ppm.
  • Example 10 The procedure was performed in the same manner as in Example 10 except that the strain used was CR-002. The results are shown in FIG. 1 and Table 4.
  • CR-007 2009 strain has 5-amino-levulinic acid synthase, which is found in the wild-type photosynthetic bacterium, even when the dissolved oxygen concentration in the culture broth exceeds 2 ppm. Activity is less likely to be suppressed.
  • Table 4
  • yeast extract B of another manufacturer (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., B-2) 5.
  • the following experiment was performed using a medium containing Og / L.
  • the culture solution obtained by culturing the mutant strain CR-0072009 in a 300-ml baffled triangular flask for 48 hours was prepared in a 3 L fermentor using 1.8 yeast extract B Inoculate the whole amount into 3 and agitate at 32 ° C, aeration rate of 0.36 LZ, at 40 Orpm, add 0.210 g of levulinic acid, 8.1 g of glycine and 18 g of yeast extract B, and stir.
  • the rotation speed was reduced to 325 rpm, and the culture was continued.
  • dissolved oxygen remained at 0.5 ppm for about 4 hours, but after 5 hours, dissolved oxygen began to rise. After 6 hours, it increased to 4 ppm, and the production of 5-aminolevulinic acid stopped at 1 OmM.
  • the fermented chloride was added to the fermented chloride to 20 ⁇ , the dissolved oxygen was reduced within 2 hours after the addition. The concentration again became 0.5 ppm or less, and the production of 5-aminolevulinic acid resumed. After further addition of 12, 26, and 38 hours, 8.1 g of glycine was added. The culture was stopped 50 hours after the addition of levulinic acid.
  • the amount of 5-aminolevulinic acid in this culture solution was determined to be 4 OmM by the method of Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494, 1990).
  • the iron contained in the yeast extract used in Example 9, the yeast extract B used in Example 13 and the yeast extract C (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., industrial yeast extract) used in the following Examples were used. When examined by the CPmass method, they were 73 Mg, 25 / zg and 155 g, respectively, per lg of yeast extract.
  • Example 9 when 5-aminolevulinic acid was being produced, the culture solution contained 20 // ⁇ of iron, and in the culture medium before addition of iron in Example 13 6.8 ⁇ , It can be seen that after the addition of iron, 26.8 / ⁇ of iron is contained.
  • Example 14 when 5-aminolevulinic acid was being produced, the culture solution contained 20 // ⁇ of iron, and in the culture medium before addition of iron in Example 13 6.8 ⁇ , It can be seen that after the addition of iron, 26.8 / ⁇ of iron is contained.
  • Mutant strain CR-0072009 strain In a test tube with a 21-diameter diameter, 1 ml of culture broth cultured with 10 ml of yeast extract C for 48 hours (0.2 at an optical density of 66 Onm) was used instead of yeast extract in culture medium 3.
  • Ferric chloride was added to 0.5, 10, 20, 50, 200, and 1 000 ⁇ in a medium prepared with 3 g / L of C.
  • a 300 ml baffled Erlenmeyer flask was prepared. The cells were cultured by rotary shaking at 32 ° C in the dark. Included in yeast extract The amount of iron shown in Table 5 is included together with the amount of iron. Table 5 shows the results of measuring the cell concentration after 30 hours of culture at an optical density of 66 Onm.
  • the mutant CR-0,072,099 strain was used in the same amount as in Example 14, and the yeast extract in the medium 3 was replaced with the yeast extract C in the amount of 3 gZL.
  • the medium was inoculated into a 30-Oml baffled Erlenmeyer flask prepared with 5 Oml, and cultured with shaking in a dark place at 32 ° C for 48 hours.
  • the whole was inoculated into a 3 L fermenter where 1.8 L of the above medium was prepared, and cultured with stirring at 32 ° C., aeration of 0.36 L / min, and 40 O rpm.
  • the average value of the dissolved oxygen concentration in the culture solution after the addition of levulinic acid was 0.001 ppm.
  • the oxidation-reduction potential in the culture solution after the addition of levulinic acid was in the range of 118 OmV to 15 OmV.
  • the microorganism of the present invention is excellent in productivity of 5-aminolevulinic acid, and the method for producing 5-aminolevulinic acid using the microorganism does not require introduction of nitrogen gas even if the dissolved oxygen concentration is relatively high.
  • 5-aminolevulinic acid can be produced.

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Description

明 細 書
5—アミノレプリン酸生産微生物及びこれを用いた 5—アミノレブリン酸の製造法 技術分野
本発明は、 5—アミノレプリン酸を高濃度で生産 ·蓄積することのできる微生物及 びこれを用いた 5—ァミノレブリン酸の製造法に関する。 背景技術
5—ァミノレブリン酸は、 テトラピロール化合物の前駆体として広く生物圏に存在 し、 生体中で重要な役割を果たしている化合物である。 5—アミノレブリン酸は、 除 草剤、 殺虫剤、 植物成長調節剤、 植物の光合成増強剤等として優れた作用を示し、 し かも人畜に対して毒性を示さず、 分解性が高いため環境への残留性もないなど、 優れ た特性を有する天然化合物である （特開昭 6 1— 5 0 2 8 1 4号公報、 特開平 2— 1 3 8 2 0 1号公報等参照）。
しかし、 5—アミノレブリン酸は、 生産コス トが高く、 上記用途に使用するには実 用性に欠けるという問題がある （CHEMICAL WEEK/OCTOBER, 29, 1984)。
このため、 多くの化学合成法が検討されている （例えば、 特開平 2— 7 6 8 4 1号 公報参照） 力 未だ十分な方法は開発されていない。
—方、 ロ ドバクテリ ゥム （ Rhodobacterium) 属、 プロ ピオニバクテリ ゥム ^ropionibac terium) 属、 メタノノくクテリゥム (Me thanobac terium) 属、 メタノサ ルシナ ^ethanosarcin ) 属等の微生物を用いた 5—ァミノレブリン酸の製造方法も 検討されている。 し力、し、 プロピオ二バクテリウム属、 メタノバクテリウム属、 メタ ノサルシナ属等 （特開平 5— 1 8 4 3 7 6号等参照） を用いる方法では生産量が非常 に低く、 満足できるものではない。 ロドバクテリウム属、 ロ ドシユードモナス (^hodopseudomonas 属等の紅色非硫黄 細菌の微生物は、 5—ァミノレブリン酸を代謝中間体とするテトラピロール化合物の 合成能力が高いことが知られている。 しかしながら、 これらの微生物を使用すると、 生成した 5—アミノレブリン酸は、 テトラピロール化合物に代謝されてしまい、 望ま しい量の 5—ァミノレブリン酸が蓄積されないという問題があった。
このように生体内において 5—アミノレブリン酸の生合成は複雑に制御を受けてい るため、 5—ァミノレブリン酸を高濃度に蓄積する菌株を作出することは容易ではな レ、。
これに対し、 グルコースを炭素源とし、 5—アミノレブリン酸を最大 1 4 . 3 mM蓄 積することが可能な口 ドバクテリゥム属変異株を用いる方法が提案されている （特開 平 8— 1 6 8 3 9 1 )。 しかし、 この方法は、 培養中の溶存酸素濃度を低濃度に保つ 必要があり、 空気に窒素ガスを混合し培養槽内に通気することが必要であり、 工業的 に有利な方法とは言えないものであった。
なお、 この方法では、 グルコースを炭素源として好気的に 5—アミノレブリン酸を 蓄積させようとする場合、 酸素が必要となる。 従って、 酸素が十分に存在する条件下 でも微生物がこれを消費することにより、 溶存酸素濃度が下がり、 5—アミノレプリ ン酸が効率よく生産されることも考えられる。 しかし、 この微生物を用い比較的高い 溶存酸素条件下で、 効率良く 5—アミノレブリン酸を生産することは不可能であった。 発明の開示
本発明の目的は、 溶存酸素濃度が比較的高い条件下でも窒素ガス等の導入が不要で、 5—ァミノレブリン酸を効率よく生産し得る微生物を提供することにある。
また、 本研究の目的は、 該微生物を用いた 5—アミノレブリン酸の製造法を提供す ることにある。
斯かる実情に鑑み本発明者らは、 5—ァミノレブリン酸を効率よく生産する微生物 を得るべく鋭意研究を行った結果、 多数の突然変異株から、 生産性のよい 5—ァミノ レブリン酸蓄積微生物を選抜する方法を見出し、 この方法により、 溶存酸素濃度が比 較的高くとも 5—ァミノレブリン酸を高濃度で蓄積する微生物を見出し本発明を完成 した。
さらに、 本発明者らは、 糖類、 グリシン、 レブリン酸等の添加を適切に変化させ、 多数の突然変異株を評価することができる極めて効率のよい 5—アミノレブリン酸蓄 積微生物を選抜する方法を開発することにより、 繰り返し変異処理を施すことを可能 にした。 これらによって、 5—アミノレブリン酸を高濃度に蓄積する菌株の育種に成 功した。 更に、 糖類、 グリシン、 レブリン酸、 鉄分等を適切に添加し、 なおかつ培養 液中の溶存酸素、 酸化還元電位を制御する培養方法を確立することによって、 本発明 を完成するに至った。
すなわち本発明は、 溶存酸素濃度が 0 . 7 0〜6 . 6 O ppmである好気培養条件下 で、 5 —アミノレブリン酸合成酵素活性が 2〜 7 (nmol/min/mgタンパク） である 5—アミノレブリン酸生産微生物を提供するものである。
また、 本発明は、 1種以上の該 5—アミノレブリン酸生産微生物を培養し、 得られ た培養物から 5—ァミノレブリン酸を採取することを特徴とする 5—ァミノレブリン 酸の製造法を提供するものである。
更に、 本発明は、 鉄成分を 5— 5 0 0 // M含有する培地で 5 —アミノレブリン酸生 産微生物を培養し、 得られた培養物から 5—ァミノレブリン酸を採取することを特徴 とする 5—アミノレプリン酸の製造法を提供するものである。
更に、 本発明は、 鉄成分を 5— 5 0 0 含有する培地で 5 —アミノレブリン酸生 産微生物を培養することを特徴とする 5—アミノレプリン酸生産微生物の培養方法を 提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 溶存酸素と 5—ァミノレブリン酸合成酵素活性との関係を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の 5—アミノレブリン酸生産微生物は、 例えば、 紅色非硫黄細菌の野性株又 はその変異株等を親株として、 これを変異処理後、 溶存酸素濃度が 0 . 7 0〜6 . 6 O ppmである条件下で、 5—アミノレブリン酸合成酵素活性が 2〜 7 (nmol/min/mg タンパク） 好ましくは、 溶存酸素濃度が 1 . 4 6〜5 . 8 6 ppmで 5—アミノレブリ ン酸合成酵素活性が 3 . 5〜5 . 6 (nmol/minZmgタンパク） である株を選抜する ことにより得られる。
具体的には、 次の方法が挙げられる。
まず、 親株が増殖し得る液体培地を試験管中に調製し、 滅菌した後、 親株を接種し、 振とう培養する。 そして増殖した菌体を緩衝液で洗浄後、 変異操作を行う。
この変異操作としては、 通常の変異手段を用いることができる。 例えば、 紫外線、 電離放射線等の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、 ェチルメタンスルホ ネート （E M S )、 N—メチノレー N' —ニトロ一 N—二トロソグァ二ジン （N T G )、 ェチルニトロソ尿素 （E N U) 等のアルキル化剤、 ブロモデォキシゥリジン （B r d U r d ) 等の塩基アナログなどの化学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養する 方法を用いることができる。
上記のような変異手段によって処理した菌体を、 更に緩衝液で洗浄し、 寒天培地等 に撒き、 培養する。 なお、 この培養により生育した変異株の中から、 上記の性質を示 す菌株を選抜するには、 以下のような工程にて行う。
得られた変異株を試験管等で培養し、 菌体増殖後、 レブリン酸とグリシンを添加す る。 これらを添加後培養液中の 5—アミノレブリン酸蓄積量を測定して、 5—ァミノ レブリン酸の生産量が多い株を選抜すればよい。
また、 より多くの微生物を培養し、 評価するためには、 マイクロタイタ一プレート を用いることが効率的で好ましい。 更に 5—ァミノレブリン酸の測定をエーリッヒ反 応により行えば、 5—アミノレブリン酸の蓄積量が視覚的に認識できるので効率的に 選抜を行うことができる。 選抜は、 まず一回の変異処理で得られた変異株群およそ 1 5， 0 0 0株から、 5— アミノレブリン酸の生産性の高い株を 1〜1 0 0株程度選び、 次いで、 これらの株を 試験管や寒天プレート上で継代し、 生育度や生産性の安定な菌株を更に選ぶことによ り行われる。 このときも、 エーリツヒ反応やマイクロタイタープレートを用いること が好ましい。
ここで得られた菌株を更に親株として、 上記変異操作及び選抜を繰り返す。 変異を 重ね 5—アミノレブリン酸の生産性が高まるにつれて、 最適なレブリン酸の添加濃度 が変化することがあるので、 レブリン酸の添加濃度は適宜変更することが好ましい。 このようにして変異育種を重ね、 好気条件で 5—ァミノレブリン酸を著量蓄積する 能力を備えた菌株は、 5—ァミノレブリン酸の代謝関連酵素のうち 5—アミノレプリ ン酸合成酵素が増強されているという特徴を持っている。 また、 培養液中の溶存酸素 濃度が 2 ppmを超えるような条件であっても、 同属の光合成細菌の野性株に観られる ような 5—アミノレプリン酸合成酵素活性の抑制が起こりにくくなつている。
上記方法で最初に用いる親株としては、 紅色非硫黄細菌の野性株又はその変異株を 用いることが好ましく、 特に好気条件下で、 グルコース等の安価な炭素源で良く生育 し、 バクテリオクロロフィル等のテトラピロール合成能の高い菌株を用いることが好 ましい。 このような好ましい菌株としては、 ロ ドバクテリウム属のもの、 特にロ ドバ クタ一.スフェロイデス Rhodobactor sphaeroides) 又はこれらの変異株が挙げら れ、 具体的には、 ロ ドパクター 'スフエロイデス C R— 0 0 2株 （F E R M P— 1 5 3 1 2 ) 等が好ましい親株として挙げられる。
また、 上記の変異、 選抜によって得られる菌株としても、 ロ ドバクテリウム属、 特 にロ ドパクター .スフエロイデスの変異株が好ましく、 具体的には、 ロ ドパクター . スフエロイデス C R— 0 0 7 2 0 0 9と命名され、 F E R M B P— 6 3 2 0とし て、 1 9 9 8年 4月 7日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨 城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に国際寄託されたものが好ましい。 この菌株は前記 ロドパクター .スフエロイデス CR— 002株の変異、 選抜を繰り返し行い得られ たもので、 5—アミノレブリン酸を著量蓄積し得る菌株である。
口 ドパクター ·スフエロイデス CR— 0072009株は、 上記の通り口 ドバク ター 'スフヱロイデス CR— 002株を起源として変異処理によって得られたもの であるから、 その菌学的性質の多くは、 CR— 002株と同様である。
以下、 ロ ドパクター 'スフエロイデス CR— 0072009株の菌学的性質につ いて説明する。
a形態的特徴
•細胞の大きさ形
0. 5 X 1〜2. 5 / m、 桿菌、 数個の細胞が長軸方向に連なる
•胞子の有無
なし
b寒天培地における生育状況
'表 1の培地において円形のコロニー、 光沢があり、 赤褐色
c生理学的性質
•グラム染色性： 一
•硝酸塩の還元： +
•ォキシダーゼ： +
•グルコース発酵性： 一
-生育の範囲
pH4. 0力 ら 9. 0、 1 0 から40°〇
d化学分類学的性質
• DNAの GZC含量 （モル0 /。） Q— 1 0
'カロチノイ ド： + (主要成分： クロロキサンチン、 メチルクロロキサンチン） .ノくクテリオタロロフイノレ： +
eその他生育条件など
•光合成生育
表 1の培地で極めて微弱。 起源菌は光合成細菌であるが光合成生育能が低下 している。
•グルコースの資化性 （好気的） ： +
•酢酸ナトリゥムの資化性 （好気的） ： +
• 5—アミノレプリン酸脱水酵素活性
好気培養で、 起源菌 （C R— 0 0 2株） に比べて 1ノ 3以下
以下、 本発明の 5—ァミノレブリン酸生産微生物を用いた 5—ァミノレブリン酸の 生産条件について、 ロドパクター 'スフ-口イデス C R— 0 0 7 2 0 0 9株を用い た場合を中心に説明する。 5—アミノレブリン酸の生産条件については、 通常の微生 物培養条件を適用することができる。 例えば、 炭素源としてグルコース等の糖類、 あ るいは酢酸、 リンゴ酸、 コハク酸等の酸類を用いることができ、 特に糖類が価格の面 で有利である。 また、 窒素源としては、 硫安、 塩安等のアンモニア態窒素化合物、 硝 酸ナトリゥム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源； グリシン、 尿素、 ポリペプトン、 酵母エキス、 カザミノ酸等の有機窒素源を用いることができる。 このうち、 グリシン を添加することが、 5—アミノレブリン酸の生産向上のため好ましい。 グリシンの添 加量は、 通常 1 0〜1 0 0 O mMとなるような範囲が好ましく、 特に 1 0〜4 0 O mMの 範囲が好ましい。 またグリシンの 1回当りの添加量は 1 0〜 2 0 O mMが好ましく、 こ れを数回添加することが好ましい。
また、 培地には、 必要により、 ビタミン類、 無機塩類等の成分を添加してもよい。 口 ドバクテリウム属、 口ドシユードモナス属等の紅色非硫黄細菌に属する.微生物は、 一般に 5—アミノレブリン酸デヒ ドラターゼを有し、 生成した 5—アミノレブリン酸 を代謝してしまうことが知られている。 し力、し、 本発明の菌株は、 5—アミノレプリ ン酸デヒ ドラターゼ活性が顕著に低下しているため、 レブリン酸等の 5—アミノレブ リン酸デヒ ドラターゼ阻害剤を添加しなくとも 5—アミノレブリン酸を菌体外に蓄積 し得るが、 わずかな量の阻害剤を添加すると 5—ァミノレブリン酸生産能の向上に効 果的である。 この場合、 その添加量は 0. 01〜20mM、 特に 0. l〜1 0mMの範囲 が好ましい。 培養条件としては、 ロドパクター 'スフエロイデス CR— 007200 9株が生育可能な条件はすべて用いることができるが、 一般には、 培養温度は 1 0〜 40°C、 特に 20〜35°Cとするのが好ましく、 培地の pHは 4〜9、 特に 5〜8とす ることが好ましい。
なお、 培養時に pHが変化する場合には、 水酸化ナトリウム、 アンモニア、 水酸化ナ トリゥム等のアルカリ溶液や、 塩酸、 硫酸、 リン酸等の酸で上記範囲に調製すること が好ましい。
5—アミノレブリン酸の生産は、 微生物の増殖と同時に行うことができるが、 独立 しても行うことができる。 この場合に使用する微生物は、 増殖菌体、 休止菌体のいず れでもよく、 そのまま 5—アミノレブリン酸の生産に使用できるが、 遠心分離機等の 装置により集菌し、 培地やリン酸緩衝液等の適当な溶液に再懸濁させるなど、 菌濃度 を高く して用いることもできる。
また、 更に 5—アミノレブリン酸の生産性を向上させるには、 培養液中の溶存酸素 量を 0. 001〜2ppm、 酸化還元電位を一 22 OmVから 5 OmVの範囲で制御するこ とが望ましく、 更に望ましくは、 それぞれ 0. 001〜lppm、 一 20 OmVから OmV の範囲である。 このときの制御方法としては、 攪拌回転数や通気量を変化させる方法、 糖類や酵母ェキスなどを添加して微生物の呼吸を活発化する方法、 あるいはそれらを 組み合わせて行うことができる。 また、 更に安定的に溶存酸素あるいは酸化還元電位を制御するには、 微生物の生育 速度を上げ、 呼吸活性を安定化させるべく培地中に鉄分を含有せしめることが有効で ある。 ここで用いる鉄成分は、 その塩が好ましく、 この場合の鉄の価数は特に制限が 無い。 鉄成分としては、 塩化第二鉄、 硫酸第三鉄、 クェン酸鉄などが挙げられる。 ま た、 培地成分として用いられる酵母エキスやコーンスティーブリカーなどの天然成分 中に必要量の鉄分が含まれている場合、 これを鉄成分として用いることができる。 鉄 成分は、 培地中に鉄として、 5〜5 0 0 となるように添加することが好ましい。 これが 5 未満であると生育促進効果及び呼吸活性を安定化させる効果が得られず、 5 0 0 μ Μを超えると微生物の生育が阻害されることがある。 特に好ましい鉄成分の 濃度は、 1 0〜3 0 0 μ Μ、 更に好ましくは 2 0〜2 0 0 μ Μである。 また、 鉄成分は 予め培地中に含有されていてもよいし、 後から添加されてもよい。
生産された 5—アミノレブリン酸はイオン交換法、 クロマト法、 抽出法等の常法に よって必要に応じて分離 ·精製することができる。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、 これらは単に例示の目的で掲げるもので あり、 本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例 1
表 1に示すグルタメート ·グルコース培地 （培地 1 ) 1 O mlを 2 l mm 0の試験管に 分注し、 1 2 1 °Cで 1 5分間滅菌した後、 放冷した。 これに口 ドパクター ·スフエロ イデス C R— 0 0 2株 （F E RM P— 1 5 3 1 2 ) の一白金耳を植菌後、 3 0 °C、 暗所にて 2日間振とう培養した。
別の 2 1 醒 φの試験管に培地 1を 1 O ml分注して、 上記と同様にして滅菌した。 こ れに、 上記の培養液 0 . 5 mlを植え継ぎ、 3 2 °Cの条件下暗所にて 1 8時間振とう培 養した。 g/L (蒸留水）
グノレタミン酸ナトリウム 3. 8
グノレコース 9. 0
リン酸 1水素ナトリウム 1. 1 3
リン酸 2水素ナトリウム 1. 07
リン酸アンモニゥム 0. 8
硫酸マグネシウム 0. 2
塩化カルシウム 0. 053
硫酸マンガン 1. 2 X 1 0 3 ニコチン酸 1. 0 X 1 0 3 ピオチン 1. 0 X 1 CT 5 チアミン 1. 0X 1 0-3 酵母エキス 2. 0
この培養液を洗浄のため 300 Ogにて 5分間遠心分離し、 その上清を捨て、 遠心 分離前と同量のトリス ·マレイン酸緩衝液 （pH 6. 0 ) に懸濁させた。 この洗浄操作 を更に 2度繰り返した。
この後、 再び 300 Ogにて 5分間遠心分離し、 その上清を捨て、 1 00 i gZmlの NTGを含むトリス 'マレイン酸 （pH6. 0) に懸濁させ、 室温にて 80分間静置培 養した。
このようにして変異処理した菌を、 上記と同様の方法で 3回洗浄した後、 滅菌した 培地 1を分注した試験管に植え継ぎ、 暗所 32 °Cにて 2日間振とう培養した。
培地 1に寒天 1 5g/Lを添加し、 1 2 1°Cで 1 5分間滅菌して調製した寒天プレー 卜に、 上記の培養液を希釈して塗布し、 喑所 32 °Cで 4日間培養した。 これにより、 約 1 5000株のコロニーを得た。
次に、 滅菌済みの 96穴マイクロプレートに 1ゥエル当り 0. 2 mlの滅菌済みの培 地 1を分注し、 上記の約 1 5000株の変異株をそれぞれ植菌した。
これを、 30°C、 喑所にてマイクロプレートシヱイカーを用いて振とう培養し、 4 8時間後、 各ゥエルにグリシン、 レブリン酸が最終濃度それぞれ 3 OmMとなるように 添加した。 更に 24時間上記と同じ条件下で振とう培養した。
各ゥエルの 5一アミノレブリン酸は以下のように検出した （エイリッヒ反応)。
(1) 各ゥエルから培養液を別のマイクロタイタープレートに採取し、 1 %のァセチ ルァセトンを含む 1 Mの酢酸緩衝液 0. 1 mlを添加し、 シールで蓋をして、 1 00 °C、 1 5分インキュベートした後、 マイクロタイタープレートを氷中で急冷した。
(2) 次に、 2%の p—ジメチルァミノべンズアルデヒ ド、 1 6%の過塩素酸を含む 酢酸溶液を 0. ΙπιΓ添加し、 室温で 1 5分後、 エイリ ツヒ反応による赤紫の呈色を観 察し、
(3) このとき、 反応液を一部取り TLC分析によって 5—アミノレブリン酸に由来 しない赤紫の呈色を示す菌株を排除し、 5—ァミノレブリン酸生産の高い変異株 6株 を選抜した。
上記 6株を培地 1試験管にて喑所、 30 °Cにて 48時間培養し、 培地 1の組成の寒 天プレート上に塗布し、 コロニーを形成させた。
次に、 滅菌済みの 96穴マイクロプレートに 1 ゥエル当り 0. 2mlの滅菌済みの培 地 1を分注し、 上記の各コロニーに由来した 60個のコロニーを任意に選び、 それぞ れ植菌した。
これを、 32°C、 喑所にてマイクロプレートシヱイカーを用いて振とう培養し、 4 8時間後、 各ゥエルにグリシンが、 最終濃度 3 OmMとなるように添加し、 上記 60コ ロニーの 20コロニーずつについて、 レブリン酸を 30、 1 5、 IraM添カ卩した。 更に 24時間上記と同じ条件下で振とう培養し、 各ゥエルから培養液を採取しエイリツヒ 反応により、 5—アミノレブリン酸の生産性及びレブリン酸の至適濃度を調べた。 こ の操作を 3回繰り返し、 生産性の高さ及びコロニー間の生産性のバラツキを指標にし て、 CR— 002株より安定的に生産性の高い変異株 1株を分離した。 これを CR— 1 50株と名付けた。 レブリン酸の至適濃度は 3 OmMであった。 30raMのレブリン酸 を添加した場合のエーリッヒ反応の 553nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを 用いて、 5—アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、 じ尺_002株が0. 0 ImMであるのに対して CR— 1 50株は 0. ImMであった。 実施例 2
用いる菌株を CR— 1 50株として実施例 1と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 実施例 1と同様に選抜試験を行い、 CR— 1 50株にくらベて 生産性の向上した変異株 CR— 268株を得た。 マイクロプレートリーダーを用いて エーリツビ反応の 553 nmの吸光度により 5—アミノレブリン酸の蓄積量を定量した ところ、 CR— 268株は0. 3mMであった。 実施例 3
用いる菌株を CR— 268株として実施例 1 と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 実施例 1と同様に選抜試験を行い、 CR— 268株にくらベて 生産性の向上した変異株 CR— 368株を得た。 マイクロプレートリーダーを用いて エーリッヒ反応の 553 nmの吸光度により 5—ァミノレブリン酸の蓄積量を定量した ところ、 じ尺ー368株は0. 5mMであった。 実施例 4
用いる菌株を CR— 368株として実施例 1 と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 実施例 1と同様に選抜試験を行い、 CR— 368株にくらべて 生産性の向上した変異株 CR— 405株を得た。 マイクロプレートリ一ダーを用いて エーリッヒ反応の 553 nmの吸光度により 5—アミノレブリン酸の蓄積量を定量した ところ、 CR— 405株は1. OmMであった。 実施例 5
用いる菌株を CR— 405株として実施例 1 と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 加えるレブリン酸濃度を 1 5 m とする以外は実施例 1と同様に 選抜試験を行い、 CR—405株にくらベて生産性の向上した変異株 CR— 502株 を得た。 マイクロプレートリーダーを用いてエーリッヒ反応の 553 nmの吸光度によ り 5—アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、 CR— 405株が1. 2m であ つたのに対して、 CR— 502株は 2. ImMであった。 実施例 6
用いる菌株を CR— 502株として実施例 1 と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 加えるレブリン酸濃度を 1 mMとする以外は実施例 1 と同様に選 抜試験を行い、 CR— 502株にくらベて生産性の向上した変異株 CR— 660株を 得た。 マイクロプレートリーダーを用いてエーリ ッヒ反応の 553 nmの吸光度により 5—アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、 CR— 502株が 2. 4mMであつ たのに対して、 CR— 660株は 3. 3mMであった。 実施例 7
用いる菌株を CR— 660株として実施例 1 と同様に操作を行い、 約 1 5000株 の変異株を誘導した。 加えるレブリン酸濃度を ImMとする以外は実施例 1 と同様に選 抜試験を行い、 CR— 660株にくらベて生産性の向上した変異株 CR— 00720 0 1、 CR— 0072002、 C R— 0072009株を得た。 マイクロプレートリ —ダーを用いてエーリッヒ反応の 553 nmの吸光度により 5—アミノレブリン酸の蓄 積量を定量したところ、 CR— 0072001、 CR— 0072002、 CR— 00 72009株はそれぞれ 5. 9、 5. 6、 4. 6mであった。 実施例 8
実施例 7で得た変異株 C R— 0072001、 CR— 0072002、 CR— 00 72009株を、 培地 1を 20 Oml調製した 50 Oml容の浸透フラスコに植菌し、 暗 所、 32 °Cで 48時間往復振とう培養した。 培養後、 500 Ogで 1 0分間遠心して 菌体を集め、 それぞれ湿菌体重量が 0. 5 gZl Omlとなるように下記培地 2で懸濁 させ、 21圆の試験管に 3 mlずつ分注した。 このようにして得られた試験管を暗所、 32°Cで往復振とう培養し、 20時間後の培養液中の 5—ァミノレブリン酸を岡山ら の方法 （CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36， No. 8, p. 1494, 1990) で測定した。 その 結果、 CR— 0072001、 CR— 0072002、 C R— 0072009株はそ れぞれ 1 9. 0、 2 1. 5、 3 1. OmMであった。
表 2
Figure imgf000017_0001
実施例 9
変異株 CR— 0072009株を、 培地 3を 5 Oml調製した 30 Oml容のバッフル 付三角フラスコに植菌し、 暗所、 32 °Cで 48時間回転振とう培養した。 これを 3 L 容の発酵槽に 1. 8 Lの培地 3を調製したところ全量植菌し、 32°C、 通気量 0. 3 6LZ分、 40 Orpmで攪拌培養した。 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pHを 6. 5〜 6. 6に制御しながら培養を続け、 培養 40時間後、 レブリン酸 0. 2 1 0g、 グリ シン 8. lg、 酵母エキス （日本製薬社製、 D— 3) 1 8gを添加し、 攪拌回転数を 3 25rpmにして、 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pH 6. 3から 6. 4に保ちながら 培養を続けた。 更に 1 2時間、 26時間、 38時間後にグリシンを 8. lgづっ添加 した。 レブリン酸添加後 50時間で培養を止めた。 この培養液中の 5—アミノレブリ ン酸を岡山らの方法 （CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494， 1990) で定 量したところ 6 OmMであった。 このときのレブリン酸添加後の培養液内の溶存酸素濃 度の平均値は、 0. O lppmであった。 また、 レブリン酸添加後の培養液内の酸化還 元電位は、 — 1 8 OmVから— 5 OmVの範囲で推移していた。 表 3
Figure imgf000018_0001
実施例 1 0
変異株 CR— 0072009株を、 培地 3を 50ml調製した 300ml容のバッフル 付三角フラスコに植菌し、 喑所、 32 °Cで 48時間回転振とう培養した。 これを 3L 容の発酵槽に 1. 8 Lの培地 3を調製したところへ全量植菌し、 32°C、 通気量 0. 36L/分、 40 Orpmで攪拌培養した。 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pHを 6. 5 〜6. 6に制御しながら培養を続け、 培養 40時間後、 レブリン酸 0. 2 1 0g、 グ リシン 8. lg、 酵母エキス 1 8 gを添加し、 通気量を 0. 72Lノ分、 攪拌回転数 6 0 Orpmにして、 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pH6. 3から 6. 4に保ちながら 培養を続けた。 更に 1 2時間、 24時間、 38時間後にグリシンを 8. lgずつ添加 した。 レブリン酸添加後 50時間で培養を止めた。 この培養液中の 5—アミノレプリ ン酸を岡山らの方法 （CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494, 1990) で定 量したところ 1 3mMであった。 このときのレブリン酸添加後の培養液内の溶存酸素濃 度の平均値は、 2. 3ppmであった。 また、 レブリン酸添加後の培養液内の酸化還元 電位は、 5 OmVから 7 OmVの範囲で推移していた。 実施例 1 1
変異株 CR— 0072009株を、 培地 3を 50ml調製した 300ml容のバッフル 付三角フラスコに植菌し、 暗所、 32 °Cで 48時間回転振とう培養した。 これを 3L 容の発酵槽に 1. 8 Lの培地 3を調製したところへ全量植菌し、 32°C、 通気量 0. 36L/分、 40 Orpmで攪拌培養した。 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pHを 6. 5 〜6. 6に制御しながら培養を続け、 培養 40時間後、 レブリン酸 0. 2 1 0g、 グ リシン 8. lg、 酵母エキス 1 8 gを添加し、 通気量を 0. 1 8L/分、 攪拌回転数を 20 Orpmにして、 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pH6. 0から 6. 5に保ちなが ら培養を続けた。 更に 1 2時間、 24時間後にグリシンを 8. lgずつ添加した。 レ ブリン酸添加後 50時間で培養を止めた。 この培養液中の 5—アミノレプリン酸を岡 山らの方法 （CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36， No. 8， p. 1494, 1990) で定量したと ころ 1 5mMであった。 このときのレブリン酸添加後の培養液内の溶存酸素濃度は、 検 出限界以下であった。 また、 レブリン酸添加後の培養液内の酸化還元電位は、 一 22 OmVから一 1 8 OmVの範囲で推移していた。
実施例 7に示されるごとく口 ドパクター .スフヱロイデス CR— 002株を起源 菌として変異を重ねて得られた CR— 0072009株は、 グルコースやグリシンな ど安価な原料を用いて飛躍的に高い濃度で 5—ァミノレブリン酸を生産する.ことので きる菌株であり、 本菌株を用いれば工業的に 5—アミノレプリン酸を製造することが 可能である。 また、 実施例 1 0、 1 1からわかるように、 生産性を高めるには、 レブ リン酸添加後の培養液内の溶存酸素濃度を 2. Oppm以下、 あるいは培養液内の酸化 還元電位を一 22 OmVから 5 OmVの範囲で制御することが望ましく、 これは、 攪拌回 転数を低下させることによって容易に行うことができる。 実施例 1 2
培地 3を 5 Oml調製した 30 Oml容のバッフル付三角フラスコ 3つを調製し、 それ ぞれに変異株 C R- 0072009株を植菌し、 喑所、 32 °Cで 48時間回転振とう 培養した。 これを 3基の 3 L容の発酵槽に 1. 8 Lの培地 3を調製したものへそれぞれ 全量植菌し、 32°Cで培養した。 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて pHを 6. 5〜6. 6に制御しながら、 通気量 0. 36L/分とし、 攪拌数を 40 Orpmとし、 うち 1基に ついては培養 25時間後に攪拌回転数を 25 Orpmとし、 それぞれ 90時間まで培養 を続けた。 培養中、 溶存酸素濃度、 5—アミノレブリン酸合成酵素活性を測定した。 5—ァミノレブリン酸合成酵素活性は以下のように測定した。
培養液を約 3 Omlサンプリングし、 遠心分離により菌体を集めた。 集めた菌体をリ ン酸緩衝液 （50mM、 pH7. 2) で洗浄後、 同じ組成の緩衝液 5 mlに再懸濁し、 常法 によりフレンチプレスにて、 菌体を破砕し 1 000 Ogで 30分間遠心分離して、 得 られた上清を 5—アミノレプリン酸合成酵素粗酵素液とした。
リン酸緩衝液 （50mM、 pH7. 2) の 1 ml中にグリシン 5 OmMと、 ピリ ドキサール リン酸 0. ImMと EDTAlmMを含み、 更に上記の粗酵素液を蛋白量換算で 1. Omg Zmlとなるように加え酵素反応液を調製した。 これにスクシ二ルー C o Aが 0. 2mM の濃度で含有するように加え、 37°Cでインキュベートした。 1 5分後、 1 Ovol% トリクロ口酢酸を 1 ml加えて反応を停止させた。 これを 350 Orpmで 1 0分間遠心分離し、 上清を 1 mlとり、 1 %のァセチルァセ トンを含む 1M酢酸緩衝液 （pH4. 7) 2mlを加え 1 00°C、 1 5分反応させて直ち に氷冷した。 3. 5mlのエイリツヒ試薬を加え 1 5分後の 553ηπιの吸光度からピロ ール化合物生成量を測定し、 酵素反応による 5—アミノレブリン酸生成量 （a) を算 出した。
次の数 1の式によって 5—ァミノレブリン酸生成速度を求め、 これを 5—ァミノレ ブリン酸合成酵素活性とした。 培養液中の溶存酸素濃度と、 そのときの 5—アミノレ ブリン酸合成酵素活性の関係を図 1及び表 4に示す。
尚、 図 1中溶存酸素濃度 1 0%は 0. 7 ppmに、 溶存酸素濃度 90%は 6. 6 ppm に相当する。
t X p
V ：酵素活个生 （nmolZmin/mgタンパク）
a ：酵素反応液 lmlに含まれる 5—アミノレブリン酸 （nmol)
p ：酵素反応液 lml中に含まれるタンパク量 （= lmg)
t ：反応時間 （= 1 5分） 比較例 1
用いる菌株を CR— 002株とする以外は実施例 1 0と同様に行った。 結果を図 1 及ぴ表 4に示す。
図 1からわかるように、 CR— 007 2009株は培養液中の溶存酸素濃度が 2 ppmを超えるような条件であっても、 光合成細菌の野性株に観られるような 5—アミ ノレブリン酸合成酵素活性の抑制が起こりにくくなつている。 表 4
DO (%) 実施例 1 2 DO (%) 比較例 1
0 6. 7 0 5. 5
0 9. 2 0 7. 6
0 7. 3 20 0. 6
1 7. 1 50 0. 5
20 4. 7
23 4. 1
23 4. 2
49 3. 7
50 5. 2
75 4. 9
76 3. 5
79 5. 6 実施例 1 3
実施例 9で用いた培地 3に含まれる酵母エキスに代え別のメーカーの酵母エキス B (オリエンタル酵母社製、 B— 2) 5. Og/Lを含有する培地を用い以下の実験を行 つた。 実験例 9と同様、 変異株 CR— 0072009株を 300ml容のバッフル付三 角フラスコで 48時間培養した培養液を、 3L容の発酵槽中で、 1. 8しの酵母エキス Bで調製した培地 3へ全量植菌し、 32°C、 通気量 0. 36LZ分、 40 Orpmで攪拌 培養し、 レブリン酸 0. 2 1 0g、 グリシン 8. 1 g、 酵母エキス B 1 8gを添カロし、 攪拌回転数を 325rpmに低下させ培養を続けた。 レブリン酸添加後、 およそ 4時間 の間は溶存酸素が 0. 5ppmを推移したが、 5時間後溶存酸素が上昇し始めた。 6時 間後 4ppmまで上昇し、 5—アミノレブリン酸の生成が 1 OmMで停止した。 これに、 塩化第二鉄が 20 μΜとなるように添カ卩したところ、 添加後 2時間以内に溶存酸素が 再び 0. 5ppm以下となり、 5—アミノレブリン酸の生成が再開したので、 更に 1 2 時間、 26時間、 38時間後にグリシンを 8. 1 gづっ添加した。 レブリン酸添加後 50時間で培養を止めた。 この培養液中の 5—ァミノレブリン酸を岡山らの方法 (CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8， p. 1494, 1990) で定量したところ 4 OmM であった。
実施例 1 3から明らかなように鉄分の添加が呼吸を回復させる効果があることがわ 力 る。 参考例 1
実施例 9で用いた酵母エキス、 実施例 1 3で用いた酵母エキス B、 更に下記実施例 で用いる別のメーカーの酵母エキス C (オリエンタル酵母社製、 工業用酵母エキス） に含まれる鉄分を I CPmass法にて調べたところ、 酵母エキス lgあたり、 それぞれ 73 Mg, 25 /zg、 1 55 gであった。
この鉄分量から、 それぞれの酵母エキスを用いて調製した培地 3に含まれる鉄分は、 それぞれ 6. 64、 2. 27、 1 4. 1 μ Mであることがわかる。 これより、 実施例 9では 5—ァミノレブリン酸を生産している時点で培養液中に 20 //Μの鉄分が含ま れており、 実施例 1 3の鉄添加以前の培地では 6. 8 μΜ、 鉄添加後は、 26. 8 / Μ の鉄分が含まれていることががわかる。 実施例 14
変異株 CR— 0072009株 （直径 21隱の試験管中、 酵母エキス C 1 0mlで 4 8時間培養した培養液 lml (66 Onmの光学密度で 0.2)) を、 培地 3の酵母エキスに 代え酵母エキス Cを 3 g/Lとして調製した培地に塩化第二鉄を 0. 5、 1 0、 20、 50、 200、 1 000 μΜ添カ卩した培地を 50ml調製した 300ml容のバッフル付 三角フラスコに植菌し、 暗所、 32 °Cで回転振とう培養した。 酵母エキス中に含まれ る鉄分とあわせると表 5に示す量の鉄分を含んでいる。 培養 3 0時間後の菌体濃度を 6 6 Onmの光学密度で測定した結果を表 5に示す。
表 5
菌体濃度 塩化第二鉄 M) 鉄分量 (μ Μ)
(光学密度（6 6 Onm))
0. 5 8. 4 1 0. 3
1 0 1 3. 4 1 2. 5
2 0 2 8. 4 1 6. 3
5 0 5 8. 4 1 6. 5
2 0 0 2 0 8. 4 1 5. 3
1 0 0 0 1 0 0 8. 4 6. 3
表 5から明らかなように、 適切な鉄分の添加が生育速度を上昇させる効果がある とがわカゝる。
実施例 1 5
変異株 C R— 0 0 7 2 0 0 9株を実施例 1 4と同量、 培地 3の酵母エキスに代え酵 母エキス Cを 3gZLとして調製した培地に更に 20 μΜの塩化第二鉄を添加した培地 を 5 Oml調製した 3 0 Oml容のバッフル付三角フラスコに植菌し、 暗所、 3 2°Cで 4 8時間回転振とう培養した。 これを 3L容の発酵槽に 1 . 8Lの上記培地を調製したと ころへ全量植菌し、 3 2°C、 通気量 0. 3 6L/分、 4 0 Orpmで攪拌培養した。 培養 2 4時間後、 レブリン酸 0. 2 1 0g、 グリシン 8. 1 g、 酵母エキス C 9gを添カロし、 攪拌回転数を 3 2 5rpmにして、 硫酸と水酸化ナトリウムを用いて p H 6. 3力 ら 6. 4に保ちながら培養を続けた。 更に 1 2時間、 2 6時間、 3 8時間後にグリシンを 8. 1 gづっ添加した。 レブリン酸添加後 5 0時間で培養を止めた。 この培養液中の 5— アミノレブリン酸を岡山らの方法 （CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 36, No. 8, p. 1494, 1990) で定量したところ 5 5 mMであった。 このときのレブリン酸添加後の培養液内の 溶存酸素濃度の平均値は、 0 . O l ppmであった。 また、 レブリン酸添加後の培養液 内の酸化還元電位は、 一 1 8 O mVから一 5 O mVの範囲で推移していた。 産業上の利用可能性
本発明の微生物は、 5—アミノレブリン酸の生産性に優れ、 これを用いた 5—アミ ノレブリン酸の製造方法は、 溶存酸素濃度が比較的高くとも窒素ガス導入等の必要が なく、 工業的に有利に 5—ァミノレブリン酸を製造することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 溶存酸素濃度が 0. 70〜6. 6 Oppmである好気培養条件下で、 5—ァミノ レブリン酸合成酵素活性が 2〜 7 (nmolZmin/mgタンパク） である 5—アミノレブ リン酸生産微生物。
2. 該微生物が口 ドバクテリウム Uihodobacteriuni) 属に属するものである請求項 1記載の微生物。
3. 該微生物がロ ドパクター 'スフエロイデス Rhodobacter sphaeroide ) 又は その変異株である請求項 1又は 2記載の微生物。
4. 該微生物が口 ドバクタ一'スフエロイデス hodobacter sphaeroides) C R — 00 7 2 009、 （受託番号： F ERM B P— 6 3 20) 又はその変異株である 請求項 1〜 3レ、ずれか 1項記載の微生物。
5. 請求項 1〜4記載の 1種以上の微生物を培養し、 得られた培養物から 5—アミ ノレブリン酸を採取することを特徴とする 5—アミノレプリン酸の製造法。
6. 培養中にレブリン酸又はグリシンを添加することを特徴とする請求項 5記載の 製造法。
7. ダリシンの添加量が 20 OmM,回以下であることを特徴とする請求項 6記載の 製造法。
8. 培養液中の溶存酸素濃度を 0· 001〜2ppm又は酸化還元電位を— 220〜 5 OmVの範囲で行うことを特徴とする請求項 5〜 7いずれか 1項記載の製造法。
9. 鉄成分を 5— 500 μ Μ含有する培地で 5—アミノレプリン酸生産微生物を培 養し、 得られた培養物から 5—アミノレプリン酸を採取することを特徴とする 5—ァ ミノレブリン酸の製造法。
1 0. 該 5—アミノレプリン酸生産微生物が請求項 1〜 4記載の 1種以上の微生物 であることを特徴とする請求項 9記載の製造法。
1 1. 鉄成分を 5— 500 μΜ含有する培地で 5—ァミノレブリン酸生産微生物を 培養することを特徴とする 5—アミノレプリン酸生産微生物の培養方法。
1 2. 該 5—アミノレプリン酸生産微生物が請求項 1〜 4記載の 1種以上の微生物 であることを特徴とする請求項 9記載のの培養方法。
第 1図 o実施例 12
•比較例 1
Figure imgf000028_0001
0 20 40 60 80 100
DO (%)
DO (溶存酸素） = 100%は 7.32ppmである
1/1
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6929705B2 (en) 2001-04-30 2005-08-16 Ak Steel Corporation Antimicrobial coated metal sheet
KR102127104B1 (ko) * 2013-03-22 2020-06-26 네오 Ala 가부시키가이샤 5-아미노레불린산 또는 그 염의 제조 방법
CN114181921B (zh) * 2022-02-16 2022-04-26 天津大学 沼泽红假单胞菌5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0595782A (ja) * 1991-10-08 1993-04-20 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法
JPH06169758A (ja) * 1990-10-09 1994-06-21 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法
JPH08168391A (ja) * 1994-12-20 1996-07-02 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk ５−アミノレブリン酸の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1041154B1 (en) * 1994-12-20 2003-03-12 Cosmo Research Institute Process for the preparation of 5-aminolevulinic acid

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06169758A (ja) * 1990-10-09 1994-06-21 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法
JPH0595782A (ja) * 1991-10-08 1993-04-20 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法
JPH08168391A (ja) * 1994-12-20 1996-07-02 Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk ５−アミノレブリン酸の製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEIDLE E L, KAPLAN S: "5-AMINOLEVULINIC ACID AVAILABILITY AND CONTROL OF SPECTRAL COMPLEX FORMATION IN HEMA AND HEMT MUTANTS OF RHODOBACTER SPHAEROIDES", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 175, no. 08, 1 April 1993 (1993-04-01), US, pages 2304 - 2313, XP002917830, ISSN: 0021-9193 *
SASAKI K, ET AL.: "INFLUENCE OF IRON ON THE EXCRETION OF 5-AMINOLEVULINIC ACID BY A PHOTOSYNTHETIC BACTERIUM, RHODOBACTER SPHAEROIDES", JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING., SOCIETY OF FERMENTATION TECHNOLOGY., JP, vol. 68, no. 05, 1 January 1989 (1989-01-01), JP, pages 378 - 381, XP002917829, ISSN: 0922-338X, DOI: 10.1016/0922-338X(89)90016-0 *
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