JPH04349879A

JPH04349879A - ブレビバクテリウム属微生物の培養法

Info

Publication number: JPH04349879A
Application number: JP12380591A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Yamagata; 山縣　恒; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1991-05-28
Filing date: 1991-05-28
Publication date: 1992-12-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はブレビバクテリウム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、α−アミノ酪
酸耐性を有しかつフマラーゼ活性を有する微生物の培養
方法に関するものであり、さらに詳しくは、該酵素活性
の高い菌体を培養取得する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フマラーゼはフマル酸の二重結合を水和
しＬ−リンゴ酸を生成する酵素であり、Ｌ−リンゴ酸の
製造のため産業上有用なものである。該酵素を含有する
ブレビバクテリウム属微生物の培養法としては、ブレビ
バクテリウム・フラバムをマロン酸、コハク酸、酒石酸
を主炭素源として培養すると高いフマラーゼ活性を示し
、酢酸、グルコース等通常培養基質として用いられる炭
素源では低い値を示すことが明らかにされている〔（タ
カタ（Ｔａｋａｔａ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バ
イオテクノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　　ｏｆ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第
７巻，１６１〜１７２頁（１９７９年）参照〕。さらに
本発明者らもα−アミノ酪酸耐性を有するブレビバクテ
リウム属微生物をエタノールを主炭素源とする培地で培
養してＬ−リンゴ酸の製造に用いる方法を提案している
（特開昭６１−２６５０９６号公報参照）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法は主炭素源とする有機酸、アルコールが高価であ
るという欠点を有しており、工業上使用する方法として
は不満足なものであった。本発明は、上記の課題を解決
し、高いフマラーゼ活性を含有するブレビバクテリウム
属に属する微生物を培養取得する方法の提供を目的とす
るものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討の結果、α−アミノ酪酸耐性を有
するブレビバクテリウム属微生物の培養時に、培地の主
炭素源として酢酸を用いることによりその課題が解決さ
れることを見出し、本発明を完成した。かくして本発明
によれば、ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ酪
酸耐性を有しかつフマラーゼ活性を有する微生物を好気
的に培養するに際し、培養主炭素源に酢酸を用いること
を特徴とするブレビバクテリウム属微生物の培養方法が
提供される。

【０００５】本発明の方法に用いられるフマラーゼ活性
を有する微生物は、ブレビバクテリウム属に属し、α−
アミノ酪酸耐性を有する微生物である。この微生物は、
該耐性機構を人為的に付与された微生物に限定されるも
のではなく、自然界における偶発的変異によって該耐性
機構を取得した微生物であってもよい。この様な微生物
の例としては、例えば特公昭５７−２６７５５号公報に
開示されているブレビバクテリウム　　フラバム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）等がある。

【０００６】本発明の方法に用いられるα−アミノ酪酸
耐性を有する微生物は、上述の天然から取得されたその
ままの微生物でも用いられるが、好ましくはブレビバク
テリウム属に属しα−アミノ酪酸耐性を積極的に付与さ
れた及び／又は高められて有する微生物が用いられる。この様な微生物としては例えば特公昭５９−２８３９８
号公報に開示されているブレビバクテリウム　　フラバ
ム　　ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１４９８）等がある。

【０００７】本発明の方法に好ましく使用される上述の
、ブレビバクテリウム属に属しα−アミノ酪酸耐性を積
極的に付与された及び／又は高められて有する微生物は
、ブレビバクテリウム属に属しα−アミノ酪酸耐性を有
する微生物を公知の方法、例えば次の操作により誘導す
ることができる。即ち、紫外線照射、あるいは化学的薬
剤（例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン等）処理により例えばブレビバクテリウム　　
フラバム　　ＭＪ−２３３に変異を誘起せしめた後、こ
の菌懸濁液をα−アミノ−ｎ−酪酸１０ｍｇ／ｍｌ含有
する平板培地（尿素０．２％、硫安０．７％、ＫＨ２　
ＰＯ４　　　０．０５％、Ｋ２　ＨＰＯ４　　　０．０
５％、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．０５％、Ｎａ
Ｃｌ　　２ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　２
ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　２ｍｇ／ｌ、
ＭｎＳＯ４　・４〜６Ｈ２　Ｏ、ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２
　Ｏ　　２ｍｇ／ｌ、ビチオン２００μｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１００μｇ／ｌ、α−アミノ−ｎ−酪酸１．０
％、寒天２．０％、エタノール３容量％〔滅菌後添加〕
）に、３０℃にて数日間培養し、生じた大コロニーを分
離することにより耐性変異株を得ることができる。

【０００８】ここで、本願発明において使用する微生物
のα−アミノ酪酸耐性は、α−アミノ酪酸２％を（注−
１）の培地に加え、３０℃、３日間振盪培養した時の相
対生育度で定義され、α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与された及び／又は高められて有する微生物の前記相対
生育度は１５以上、好ましくは３０以上である。なお、
前記相対生育度は次式で示される。

【０００９】

【数１】

【００１０】（上式中、α−ＡＢはＤＬ−α−アミノ酪
酸の略号である）（注−１）使用培地組成及び培養方法尿素０．２％、硫安０．７％、ＫＨ２　ＰＯ４　　　０
．０５％、Ｋ２　ＨＰＯ４　　　０．０５％、ＭｇＳＯ
４　・７Ｈ２　Ｏ　　０．０５％、酵母エキス０．０１
％、カザミノ酸０．０１％、ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ
　　２ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４　・４〜６Ｈ２　Ｏ２ｍｇ
／ｌ、ＮａＣｌ　　２ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ２　・２Ｈ２
　Ｏ　　２ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　２
ｍｇ／ｌ、ビチオン２００μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩１
００μｇ／ｌからなる培地（ＤＬ−α−アミノ酪酸は、
表１に示す量を加える）１０ｍｌを口径２４ｍｍの大型
試験管に分注、１２０℃、１０分間滅菌後、微生物例え
ばブレビバクテリウム　　フラバム　　ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１株を各々接種し、エタノールを無菌条件にて
０．３ｍｌ（３　ｖ／ｖ％）添加し、３０℃で３日間振
盪培養を行なった。（注−２）生育度Ｏ．Ｄ６１０　、相対生育度生育度Ｏ
．Ｄ６１０　は、６１０ｎｍの波長における吸光度を示
し、この吸光度測定は東京大学農学部農芸化学教室実験農芸化学上巻２１
２頁、朝倉書店（１９７５）に従い測定した。また、Ｄ
Ｌ−α−アミノ酪酸無添加時の生育度Ｏ．Ｄ６１０　を
１００とし、相対生育度で表わす。

【００１１】上述の定義に従い測定したブレビバクテリ
ウム　　フラバム　　ＭＪ−２３３及びブレビバクテリ
ウム　　フラバム　　ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１のＤＬ
−α−アミノ酪酸に対する相対生育度は第１表に示す通
りであった。

【００１２】

【表１】

【００１３】上述したブレビバクテリウム属に属しフマ
ラーゼ活性を有しかつα−アミノ酪酸耐性を有する微生
物を好気的に培養する。この時培養に使用される窒素源
、無機塩等の炭素源を除く培地組成は特に限定されるも
のではなく、例えば、窒素源としてはアンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素等が、無機塩としてはリン酸−水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。これらの窒素源および無機塩はそれぞれ単独又は混合し
て用いることができる。

【００１４】更に、これらの他に菌の生育に必要であれ
ば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地
に添加することができる。培養は通気攪拌、振盪等の好
気的条件下で行ない、培養温度は２０〜４０℃、好まし
くは２５〜３５℃で行なう。培養途中のｐＨは５〜１０
、好ましくは７〜８付近にて行ない、培養液中のｐＨの
調整には酸、アルカリを添加して行なう。

【００１５】培養開始時の主炭素源である酢酸濃度は０
．１〜５容量％、好ましくは０．１〜２容量％が適して
おり、培養の当初に一括して加えてもよいし、逐次的あ
るいは連続的に添加し、総量が上述の濃度となるように
するのもまた好ましい。酢酸はそのまま加えてもよいし
、ナトリウム、アンモニア等のアルカリとの塩として添
加してもよい。

【００１６】培養期間は１０時間〜４日間、好ましくは
１２時間〜３日間である。上記の如く培養した培養物を
遠心分離等により集菌することにより、高いフマラーゼ
活性を含有する菌体を取得することができる。以下、実
施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

【００１７】

【実施例】

〔実施例１〕尿素４．０ｇ、硫酸アンモニウム１４．０
ｇ、硫酸−カリウム５００ｍｇ、リン酸二カリウム５０
０ｍｇ、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　５００ｍｇ、Ｆ
ｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　６ｍｇ、ＭｎＳＯ４　・４
〜６Ｈ２　Ｏ　　６ｍｇ、ビオチン　　２００μｇ、チ
アミン塩酸１００μｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）１．
０ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）１．０ｇを脱イオン水
１リットルに溶解しｐＨをＫＯＨで約７．３に調整した
。この培地に炭素源として、酢酸、マロン酸又はクエン
酸を２％（ｗ／ｖ　）となるように各々添加し、口径２
４ｍｍ試験管には１０ｍｌ、５００ｍｌ容三角フラスコ
には５０ｍｌ分注し、１２０℃２０分間蒸気滅菌を行な
った。なお、炭素源としてエタノール又はグルコースを
用いた場合は、分注及び蒸気滅菌後２％濃度（エタノー
ル：ｖ／ｖ％、グルコース：ｗ／ｖ　％）となるように
添加した。

【００１８】口径２４ｍｍ試験管にブレビバクテリウム
　　フラバム　　ＭＪ−２３３を一白金耳植菌し、３０
℃で４０時間（グルコースの場合）、５０時間（その他
の炭素源の場合）培養した。該培養液を５００ｍｌ容三
角フラスコに１ｍｌ植菌し、３０℃で２１時間（エタノ
ール、グルコース、酢酸、マロン酸の場合）、３７時間
（クエン酸の場合）培養し、遠心集菌した。

【００１９】得られた菌体を１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）に６１０ｎｍの濁度が約２０〜２５
になるように懸濁し、その０．２ｍｌを、０．５Ｍフマ
ル酸（ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）９．８ｍｌに加
えた。４５℃で２０分間反応を行い、遠心分離で菌体を除去し
、上清中のＬ−リンゴ酸生成量を高速液体クロマトグラ
フィーにて定量した。活性は単位濁度あたりのＬ−リン
ゴ酸生成量をエタノール培養菌体の値を１．０とする相
対活性で表示した。結果を第２表に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】〔実施例２〕実施例１の培地で尿素を０ｇ
とし、硫酸アンモニウムを２３ｇ（ただし炭素源を酢酸
アンモニウムとするときは０ｇ）としたもの１．５リッ
トルを３リットル容ジャーファーメンターに入れ１２０
℃、２０分間滅菌した。炭素源をエタノール、グルコー
ス又は酢酸として、実施例１と同様の方法でブレビバク
テリウム　　フラバム　　ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１を
口径２４ｍｍ試験管、５００ｍｌ容三角フラスコで培養
した。

【００２２】該培養液３０ｍｌを、上記３リットル容ジ
ャーファーメンターに植菌し、１００％エタノール、５
０％（ｗ／ｖ）グルコース、５０％（ｗ／ｖ）酢酸アン
モニウムを各々初発２％（酢酸アンモニウムの場合、酢
酸として２％）添加し、１０００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３
３℃で通気攪拌、培養を行った。ｐＨは７．６になるよ
うに濃アンモニア水又は１０％塩酸で調節した。炭素源
の消費枯渇に伴う溶存酸素濃度の急激な上昇を溶存酸素
電極で測定し、各炭素源を初発濃度と同じ濃度となるよ
う添加した。

【００２３】エタノール、グルコースの場合は４８時間
、酢酸の場合は３０時間で培養を終了し、実施例１と同
じ方法で活性を比較した。結果を第３表に示す。

【００２４】

【表３】

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、α−アミノ酪酸耐性を
有するブレビバクテリウム属微生物を、主炭素源を酢酸
で培養することにより、フマラーゼ活性の高い菌体を得
ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ブレビバクテリウム属に属し、α−ア
ミノ酪酸耐性を有しかつフマラーゼ活性を有する微生物
を好気的に培養するに際し、培養主炭素源に酢酸を用い
ることを特徴とするブレビバクテリウム属微生物の培養
方法。