JPH0242995A

JPH0242995A - Ｌ−リジンの製造法

Info

Publication number: JPH0242995A
Application number: JP19060588A
Authority: JP
Inventors: Yukie Sato; 幸江佐藤; Masami Kainuma; 真美貝沼; Shoichi Nara; 昭一奈良; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1988-08-01
Filing date: 1988-08-01
Publication date: 1990-02-13
Anticipated expiration: 2013-03-04
Also published as: JP2721975B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、酵素反応による新規なＬ−リジンの製造法に
関するものである。

本発明によれば、高収量で効率よくＬ−リジンを製造す
ることができる。

Ｌ−リジンは、必須アミノ酸の一つとして人間及び動物
の栄養上重要な役割をするもので、医薬、食品、飼料添
加剤等の需要が近年急激に増加している。

（従来の技術と課題）Ｌ−リジンの工業的製法としては、他のアミノ酸の場合
と同様に立体異性体が存在するので、化学合成法ではし
一体のみの製造は困難となり、主として醗酵法によって
いる。

しかしながら、公知の醗酵法によるＬ−リジンの製法で
は、対糖収率が低いことや、Ｌ−リジンの蓄積に限界が
あり、新たな観点でＬ−リジンをより効果的に生成させ
る方法の堤供が強く求められている。

（発明の構成及び効果）本発明は、ビオチン要求性かつ５−（２−アミノエチル
）−Ｌ−（−）システィン〔以下ＡＢＣと記す〕耐性を
有し、コリネ型細菌に属する微生物菌体をグルコースを
含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−リジ
ンを生成せしめ、これからし−リジンを探取することを
特徴とするしリジンの製造法を提供するものである。

本発明によれば、グルコースを含有する水溶液中で、ビ
オチン要求性かつＡＢＣ耐性を有し、コリネ細菌に属す
る微生物菌体を酵素源として用いて酵素反応をさせると
、該水溶液中にＬ−リジンが生成し、高収量で得られる
。

本発明の方法は酵素法であり、従来の醗酵法に比較し、
グルコースを含有する水溶液として、グルコースを含有
する完全合成培地を使用した場合でも、醗酵法で必要と
される培地の滅菌等の煩雑な操作が必要でないので生産
管理が大幅に容易になるなど、工業的に効率よくＬ−リ
ジンが製造できる。

（発明の詳細な説明）本発明の方法は、微生物菌体の増殖を全く伴わない条件
下にＬ　−ＩＪリジン製造する、酵素反応系を利用した
Ｌ−リジンの製造法を提供するものであり、この様な方
法は従来全く知られていない新規な方法である。

本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性かつＡＢ
Ｃ耐性を有し、コリネ型細菌に属するものである。本発
明に使用される微生物としては例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆ
ｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３３−Ｌ　　１１　　（微工研
菌寄　第１００９４号、以下ＭＪ−２３３−Ｌ１１と記
す）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｓ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　　２３３
　　Ｌ１２（微工研菌寄　第１００９５号、以下ＭＪ２
３３−Ｌ−１２と記す）であり、これらの菌が本発明に
好適に用いられる。

なお、上記のＭＪ−２３３−Ｌ−１１及びＭＪ２３３−
Ｌ−１２は、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕａ＋）　Ｍ　Ｊ　
−２３３（微工研条寄第１４９７号：微工研菌寄　第３
０６８号）〔以下Ｍ、ｌ−２３３と記す〕を親株として
、ＡＢＣ耐性を積極的に付与された微生物である。

本発明にみられるビオチン要求性かつＡＢＣ耐性を有し
、コリネ細菌に屈する微生物は、微生物菌体そのままで
用いることも出来るし、又これらを公知の手法で固定化
された固定化物を使用することも出来る。この固定化手
法としては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマー
を用いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適
当な担体に不溶化させる等がある。

本発明において使用する耐性変異株は、次の操作によっ
て得られる。

紫外線照射、あるいは化学的薬剤（例えばＮ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン等）処理により
該Ｌ−イソロイシン生産菌株に変異を誘起せしめた後、
この菌懸濁液をＡＥＣ及びＬ−スレオニンを含有する平
板培地（尿素０．　２％、硫安０．７％、ＫＨ２ＰＯ４
０，０５％、ＫＨＰＯ４０，０５％、　ＭｇＳＯ４・　
７Ｈ２００、０５％、　Ｆｅ５０＊　　−７８２０６ｍ
ｇ／ｊ２、　Ｍｎ　　ＳＯ４・　４　〜６　８２　０　
　６ｍｇ／　ｊ！　　、　ＺｎＳ　Ｏｘ　　・７　Ｈ２
０６ｍ　ｇ　／　１、ビオチン２００μｇ／２、チアミ
ン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ＡＢＣ２ｇ　／　ｊ！、　Ｌ
−スレオニン１．２ｇ／Ｉｌ、寒天２．０％、グルコー
ス２％）に滅菌後添加し、３０℃にて数日間培養し生じ
た大コロニーを分離することにより、耐性変異株を得る
。代表的な耐性変異株としてはブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓ　　　ｆｌａｖ
ｕ＋ｍ）　　Ｍ　　Ｊ　　−２３３−Ｌｌｌがあり、こ
の菌株は、工業技術院微生物工業研究所に微工研菌寄第
１００９４号として寄託されている。この耐性菌株はブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研
条寄　第１４９７号）より、ＡＢＣ耐性株として誘導さ
れたものである。

前記のＭＪ−２３３−Ｌ−１１（ＡＢＣ耐性株）　ＭＪ
−２３３−Ｌ−１２（ＡＢＣ耐性株）とその親株である
ＭＪ−２３３のＡＢＣに対する相対生育度は次の表−１
の如くである。

表−１（注−１，注−２）（注−１）表中の数値は、ＡＢＣ無添加時の生育度０．
　Ｄ、１゜（吸光度測定：参考文献・東京大学農学部農
芸化学教室・実験農芸化学上巻ｐ２１２朝倉書店）を１
００とし、以下相対生育度を示す。（注−２）使用培地
組成及び培養方法は下記の通り。

使用培地組成：尿素　０．２％、硫安　０．７％、ＫＨ，ＰＯＯ８０５
％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、Ｍｇ５ｏ、　　・７Ｈ２
００，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０５ｍｇ／ｌ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６Ｈ２０６ｍ　ｇ　／Ｉｔ、ＺｎＳＯ４Ｈ
７Ｈ２０６ｍｇ／２、ビオチン　２００μｇ／ｌ、チア
ミン塩酸塩１００μｇ／ｊ！（ＡＢＣは表−１に示す量
を加える）培養方法：上記培地Ｉ　Ｑｍｊ！を２４φ大型試験管に分注、１２
０℃１０分間滅菌後、ＭＪ−２３３−Ｌ−１１株を各々
接種し、グルコースを無菌条件下にて２％添加し、３０
℃、２０時間振盪培養を行った。

なお、本願発明においてＡＢＣ耐性株又は、ＡＥＣに耐
性を有する微生物とは、ＡＥＣｏ、２％を、上記（注−
２）の培地に加え、３０℃２０時間１辰盪培養した時の
相対生育度が８０以上のものと定義する。但し、相対生
育度＝ＡＥＣ０，２％添加時の生育度０、　Ｄ６Ｉ０ＡＢＣ無添加時の生育度　０．Ｄ、、。

とする。

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性かつＡ
ＢＣ耐性を有し、コネリ型細菌に属する微生物菌体の調
製に使用する培地は、特に限定されるものではなく一般
の微生物に使用されるものでよい。

本発明に使用する微生物菌体の調製に使用する培地の窒
素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混
合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−リジン生成に必要であれば、ペプトン
、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カ
ザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用い
る。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調節には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始時のグルコース濃度は、好ましくは１〜５重量
％、更に好ましくは２〜３重量％が適する。培養期間は
０．５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水又
は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に使
用する。

本発明の方法においては、上記で１１５１された微生物
菌体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、
少なくともグルコースを含有する水溶液にて酵素反応さ
せる。ここで該水溶液に添加されるグルコースの濃度は
０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％である
。

該水溶液は、上記の様にグルコースを含有する水あるい
はリン酸又はトリス塩酸塩等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはグルコースを含有する完全合成培地
が用いられる。ここで完全合成培地とは、化学構造が公
知の無機窒素源及び／又は無機塩を含有する水溶液であ
る。本発明に用いられる完全合成培地の無機窒素源とし
ては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が例示で
き、また無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、
硫酸鉄等が例示される。これらの！！＆、機窒素源、無
機塩は、単独でも２種以上混合して用いることもできる
。

これら無機窒素源及び／又は無機塩の水溶液としての濃
度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程
度の範囲でよく、特に限定されない。

完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ４）２Ｓ０４　　
’ｌ　　ｇ　／　ｌ　　；　　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４０−５
ｇ　／　ｌ！；　　Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ／１Ｍｇ５Ｏ
４・　７　Ｈ２００，５ｇ／ｊ！；Ｆｅ５０＊　　・　
７Ｈ２０２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ４・４〜６８２０　２０
ｐｐｍ含有するｐＨ７，６の水溶液がある。

上記の様に、本発明に使用される完全合成培地には、ビ
オチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビオ
チンの含有されないことの明らかな化学構造公知のアミ
ノ酸、ビタミン、ｙＭ類等は添加することはできる。

本発明の方法において使用される、上記の様に調製され
た微生物菌体の使用量は、特に制限されるものではない
が、一般に１〜５０％（ｗｔ／ｖｏ１）の濃度で使用す
ることができる。

本発明において、酵素反応は、約２０〜約５０℃、好ま
しくは約３０〜約４０℃の温度で、通當約１０〜約７２
時間行われる。

上記酵素反応は、反応に用いられるグルコースを含有す
る水溶液、好ましくは上述のグルコースを含有する完全
合成培地中の溶存酸素濃度が０゜Ｏ５ｐｐｍ以上、１３
ｐｐｍ以下となる様に、反応系中に空気若しくは酸素を
、連続又は間歇的に供給して行うのが好ましい。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したＬ　−ＩＪリジン分離・精製は、醗酵法による場合
のアミノ酸の分離・精製と同様に行え、例えば公知のイ
オン交換処理法あるいは、沈澱法等により行うことがで
きる。

実験例以下の実験例において、Ｌ−リジンの定性は、ペーパー
クロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動度、微生物
定量法による生物活性値により確認した。定量はマイク
ロバイオアンセイ法と高速度液体クロマトグラフィー（
島原ＬＣ−５Ａ）とを併用して行った。また、下記の実
施例において％と表したのは重量％を意味する。

実施例−１培地（尿素　０．４％、硫酸アンモニウム　１４％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，０５％、ＫｔＨＰｏ。

０．０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　　・７Ｈ２００，０５
％ＣａＣＮ２　・　２Ｈ２０２ｐｐｍ、　　Ｆｅ５０゜
・　７１１２０　２　　ｐ　　ｐｍ、Ｍｎ５Ｏ，−４〜
６０□０　　２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４・　７Ｈ２０２ｐ、
ｐ　ｍＮａＣｎ　　２ｐｐｍ−ビオチン　２００．ｃｒ
ｇ／ｌ、チアミン・ＨＣＩ！　１００μｇ　’／　ｊ！
、カザミ／酸　０．１％、酵母エキス　０．１％）１０
０ｍｌを５００ｍ１容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌
後ｐＨ７，０）した後ブレビバクテリウム・フラバム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　　ｆｌａｖｕｗ）　
Ｍ　Ｊ　−２３３−Ｌ−１１（微工研菌寄　第１００９
４号）を植菌し、無菌的にグルコースを５　ｇ／Ｉ！の
濃度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培養を行
った。

次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸アンモニウム
２．３％、ＫＨ，ＰＯ４０，０５％、ＫＨＰＯ４０，０
５％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，０５％、Ｆｅ５０．−
ＩＨ，０２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０２ｏｐ
ｐｍ１ビオチン　２００μｇ／ｌ、チアミ７−Ｈ（１！
　　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸　０．３％、酵母エキ
ス０．３％）の１０００ｍｆｆを２１！容通気攪拌槽に
仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培養物
の２０ｍ１を添加して、回転数１００゜ｒｐｍ、通気Ｊ
ｊｌ　ｌ　ｖ　ｖ　ｍ　、　温度３３℃、ｐＨ７゜６に
て２４時間培養を行った。

培養終了後、培養物５００ｍｆから遠心分離にて集菌後
、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液（（ＮＨ４
）２３０４　２　ｇ／ｌ　；　ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ／
ｊ！　；ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ／ｊ！　；Ｍｇ５０４　
　・７Ｈ２００，５ｇ／ｌ　；　Ｆｅ５０４７Ｈ２０２
０ｐｐｍ；Ｍｎ５Ｏ，−４〜６Ｈ２０２０ｐｐｍ；チア
ミン塩酸塩　１００μｇ／Ｎ；ｐＨ７，６）の１０００
　ｍ　７！に！！！１ｉ濁後、該懸濁液を２１容通気攪
拌槽に仕込み、グルコース９ｇを添加して、回転数３０
Ｏｒｐｍ、通気量Ｏ９ｌｖｖｍ、温度３３℃、ｐ）Ｉ’
７．６にて２４時間反応を行った。

反応終了後、遠心骨！（４０００ｒｐｍ、１５分間、４
℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを定量した。

この反応終了後の培養液５００ｍｆを、強酸性陽イオン
交換樹脂（Ｈ“型）のカラムに通してＬリジンを吸着さ
せ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出させた後、Ｌ
−リジン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−リジンの結
晶を析出させた。

結果を次に掲げる第１表に示した。

第１表実施例−２実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ
）　Ｍ　Ｊ　−２３３−Ｌ−１２（ｌｆＩ［工研菌寄　
第１００９５号）を培養し、また実施例−１と同様の条
件にて反応させた後上清液中のＬ−リジンを定量した。

また、実施例＝１と同様にしてＬ−リジンの結晶を析出
させた。結果は第２表に示した。

第２表実施例−１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｍ　　ｆｌａｖ
ｕｍ＞　Ｍ　Ｊ−２３３を培養し、また、実施例−１と
同様の条件にて反応させた後上清液中のＬ−リジンを定
量したところ、０．０６ｇ／ｌであった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビオチン要求性かつＳ−（２−アミノエチル）−
Ｌ−（−）システイン耐性を有し、コリネ型細菌に属す
る微生物菌体の存在下、グルコースを含有する水溶液に
て酵素反応させて該溶液中にＬ−リジンを生成せしめ、
これからＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リ
ジンの製造法。
（２）水溶液が完全合成培地である特許請求の範囲第１
項記載の方法。