JPS63192396A - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、醗酵法によるＬ−イソロイシンの製造法に関
する。更に詳しくは、ブレビバクテリウふ（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｔｍに属し、エタノール資化性
部を有する微生物を、α−ケト酪酸又はその塩を含有す
る培地に好気的に培養するに際し、α−ケト酪酸又はそ
の塩を逐次添加することを逐次添加するＬ−イソロイシ
ンの製造法に関する。

（発明の背景） Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間及び動物
の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食品
、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつあ
る。Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のア
ミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合
成法ではＬ体、）８．）製造、よ困Ｎ７あり、主に醗酵
法により生産が行われている。醗酵法としてはＤＬ−α
−アミノ酪酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆
物質を使用する方法（特公昭４３−８７０９゜特公昭４
０−２８８０等）、前駆物質を特に加えない所謂直接醗
酵法（特公昭３８−７０９１．特開昭４９−９３５８６
等）がある。

（従来の技術と課題） 前駆体醗酵法の中で、比較的効率良くＬ−イソロイシン
を製造する為の原料としては、α−ケト酪酸が知られて
いるが、α−ケト酪酸は微生物菌体への生育阻害が著し
くこれまで実用的な使用についての報告は全く無い。

本発明者らは、α−ケト酪酸又はその塩からのＬ−イソ
ロイシン製造に関し、最適醗酵方法について鋭意検討し
本発明を完成した。

（発明の構成及び効果） 本発明者らは−、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｓ）属に属し、エタノール資化性を存する
微生物をα−ケト酪酸又はその塩を含有する培地に好気
的に培養して、培地中にＬ−イソロイシンを製造するに
際し、α−ケト酪酸又はその塩を培養中の培地に逐次添
加することにより、菌体への生育阻害を回避し、Ｌ−イ
ソロイシンが、培地中に高収量で蓄、積することを見出
し本発明に到達した、従来、α−ケト酪酸又はその塩を
前駆物質として使用した場合、微生物菌体への生育阻害
が著しい為にＬ−イソロイシン製造に関するプロセスの
確立はなされていない、従って、本発明は新規な方法で
ある。

（発明の具体的方法） 本発明に使用される微生物はブレビバクテリウム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｊｕｍ）属に属しエタノール資化性
のものであれば好い、このなかにはＬ−イソロイシン生
産菌が含まれる。該生産菌は例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌ
ａｖｕｍ）　ＭＪ−２３３（微工研菌寄　第３０６８号
）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｓ　　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３３−ＡＢ
　　４１　　（微工研菌寄　第３８１２号）、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｆｌａｖｕｓ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＴ−１１
（機工ＶｒＷＩ寄　第８４２３号）及びプレビバクテリ
ウふ・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆ
ｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（微工研菌
寄　第８０５５号）等であり、本発明に好適に用いられ
る。

なお、上記の（微工研菌寄　第３８１２号）は（微工研
菌寄　第３０６８号）を親株としてＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物で
ある（特公昭５９−２８３９８号公報３〜４欄参照）、
（微工研菌寄　第８４２３号）は、（微工研菌寄　第３
０６８号）を親株としたし一α−アミノ酪酸トランスア
ミナーゼ高活性変異株である（特願昭６０−１９０６０
９号明細書３〜５頁参照）、また、（ｍ１研菌寄第８０
５５号）は（微工研菌寄　第３０６８号）を親株とした
Ｄ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（
特願昭６０−０１７５０１号明細書５〜７頁参照）。

以下、更に本発明のＬ−イソロイシンの製造法を具体的
に説明する。

本発明の菌体ｍ製に使用する培地組成は、好ましくはエ
タノールを主炭素源とするが、特に主炭素源の限定は無
く、一般の微生物に使用されるもので良い、窒素源とし
てはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混合して用
いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。

Ｌ−イソロイシンの前駆体となるα−ケト醋酸は又はそ
の塩の初発濃度は、０．５ｍＭ〜３０ｍＭ１好ましくは
、１ｍＭ〜２０ｍＭである。培養ト 中の培地のα−ケト酪酸の濃度は、液体クロマ壷グラフ
ィーにより経時的に測定し、３０ｍＭを越えないように
α−ケト酪酸又はその塩を逐次添加して培養する。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量％
、更に好ましくは２〜３容量％が適する。培養期間は１
〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

上記のような培養方法によって得られる培養液中に生成
したＬ−イソロイシンの分離・精製は、イオン交換樹脂
処理法あるいは、沈澱法等により行うことが出来る。

（実施例） 以下に実施例を示す、なお、Ｌ−イソロイシンの定性は
、ペーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動
度及び微生物定量法による生物活性値により確認した。

定量はロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃ
ｏｎｏｓｔｏｃ　ｓ＋ｅｓｅｎＬｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴ
ＣＣ８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速
液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）とを併用し
て行った。また、下記の実施例において％と表したのは
重量％を意味する。

実施例−１ 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
，ＰＯ４０，０５％、Ｋ、ＨＰＯ４０゜０５％、Ｍｇ５
Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０５％、ＣａＣｌ、　　・２Ｈ２０
２ｐｐｍ％Ｆｅ５Ｏａ　　・７Ｈ，０２ｐｐｍ、Ｍｎ５
Ｏ，・４〜６Ｈ３０２ｐｐｍ、Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ２０２
ｐｐｍ。

ＮａＣ１２ｐＩｌ）ｍ−ビオチン　２００＃ｇ／ｌ、チ
アミン・ＨＣＩ！　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸　０．
１％、酵母エキス　０．１％　＞１００ｍ１を５００ｍ
ｌ容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）し
た後ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕ＋ｓ　　目ａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（微工研
菌寄　第３０６８号）を植菌し、無菌的にエタノールを
’ｌ　ｍ　ｌ加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った
（前培養）。

次に、本培養培地（ｆＬ酸アンモニウム２．３％、ＫＨ
２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２　ＨＰＯ４０，０５％、Ｍｇ
５Ｏ，−ＩＮ２Ｏ３，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２
０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ２０ｐｐｍ、ビオチン
２００ｔｔｇ／ｌ、チアミン・ＨＣＪ！　　１００＃ｇ
／ｊ！、カザミノ酸０．３％、酵母エキス０．３％、α
−ケト酪酸ナトリウム０．１２％）の１０１００Ｏを２
１容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）
後、エタノールの２０ｍｌと前記前培養物の２０ｍ１ｌ
を添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量ｌｖｖｍ、
温度３３℃ｐＨ７，６にて２４時間培養を行った。

尚、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を越え
ないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

また、α−ケト酪酸は３０ｍＭを越えないように約１〜
２時間ごとに逐次添加し、最終添加の後の総量が５０ｍ
Ｍとなるようにした。

培養終了後、遠心分ｊｌｌ　（４０００ｒｐｍ、１５分
間、室温）にて除菌した上清液中のＬ−イソロイシンを
定量した。また、培養終了後の培養液５００ｍ１を、強
酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通してＬ−
イソロイシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア
水で溶出させたのち、Ｌ−イソロイシン画分を濃縮し、
冷エタノールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。

結果を後に掲げる第１表に示した。

尚、α−ケト酪酸ナトリウムを培養開始時の培地に一括
して５０ｍＭ添加した場合のＬ−イソロイシンの生成量
を比較例とした。

実施例−２ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（ＢｒｅｖｉｂａｃＬｅｒｉｕｓ＊　　ｆｌａｖｕ
ｗ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄　第
３８１２号）を培養し、且実施例−１と同様に精製した
。結果は、後に掲げる第２表に示した。

実施例−３ 実施例〒１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌｊｖｕｍ
）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＴ−１１（微工研菌寄　第
８４２３号）を培養し、且実施例−１と同様に＃ｒＩＳ
！Ｊした。

結果は、後に掲げる第３表に示した。

実施例−４ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ
）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＤ−２１（微工研菌寄　第
８，０５５号）を培養し、且実施例−１と同様に精製し
た。

結果は、後に掲げる第４表に示した。

第１表 第２表 第３表

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ）属に属するエタノール資化性微生物をα−ケト酪
   酸又はその塩を含有する培地に好気的に培養して培地中
   にＬ−イソロイシンを生成せしめるに際し、培養中の培
   地にα−ケト酪酸又はその塩を逐次添加することを特徴
   とするＬ−イソロイシンの製造法。
2. （２）培地中のα−ケト酪酸又はその塩の濃度が３０ｍ
   Ｍを越えないように断続的又は連続的にα−ケト酪酸又
   はその塩を逐次添加する特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。
3. （３）ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ）属に属し、エタノール資化性を有する微生物がブ
   レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
   ｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３、ブレビバクテリ
   ウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１、ブレビバク
   テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１、ブレ
   ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１
   である特許請求の範囲第１項又は同第２項記載の製造法
   。