JPS6251998A - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は発酵法によるＬ−インロイシンの製造法に関す
るものである。さらに詳しくはエタノールを主炭素源と
する培地にＤＬ−α−アミノ酪酸又はＬ−α−アミノ酪
酸を共存せしめ、ブレビバクテリウム属に属しＬ−α−
アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性の増大したエタノー
ル資化性微生物を好気的に培養してその培養液中のＬ−
イソロイシンを採取することを特徴とするＬ−インロイ
７ンの製造法である。

本発明の方法によればＬ−インロイシンの生成速度が向
上し、目的とするＬ−インロイシンが効率よく製造でき
る。

Ｌ−インロイシンは必須アミノ酸として、人間および動
物の栄養上重装な役割をするアミノ酸であり、医療、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。

先行技術 Ｌ−インロイシンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立木異性体が存在する為、化学合成法
では５本のみの製造は困雄であり、主に発酵法により生
産が行なわれている。

発酵法としてはＤＬ−又はＬ−α−アミノ酪酸、スレオ
ニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使用する方法（
特公昭４３−８７０９号、同４〇＝２８８０号各公報等
）と前駆物質を特に加えない所謂直接元酵法（！￥ｊ公
昭３８−７０９１号、特開昭４９−９３５８６号各公報
等）がある。

これらの方法では目的とするＬ−イソロイシンの生成連
装が十分でなく、この生成速度の向上が望まれていた。

発明の概要 本発明者らは、ＤＬ−α−アミノ酪酸もしくはＬ−α−
アミノ酪酸からＬ−インロイシンを発酵法により製造す
る方法について、Ｌ−インロイジンの生成速度を高める
べくイ１々検討を行い本発明に到達した。

即ち、本発明は、ブレビバクテリウム４に属しＬ−α−
アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性が増大したエタノー
ル資１′ヒ性微生物を、エタノールを主炭素源としかつ
ＤＬ−α−アミノ酪酸もしくはＬ−α−アミノ酪酸を含
む培地に好気的に培養して＠養液中にＬ−イソロインン
分生産４積せしめ、この培養液よりＬ−イソロイシンを
採取することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法を
提供するものである。

発明の効果 本発明によれば、ＤＬ−α−アミノ酪酸もしくはＬ−α
−アミノ酪酸を含む培地に、ブレビバクテリウム嶋に属
しＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性が増大し
たエタノール資化性微生物を好気的に培養することによ
り、Ｌ−イソロイシンが高い収量で効率よく製造できる
。

本発明においてＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ
活性を増大させることで−ＤＬ−α−アミノ酪酸もしく
はＬ−α−アミノ酪酸からＬ−インロイシンの生成速度
が著しく増大し、同一の培養時間でも大巾に目的とする
Ｌ−インロイシンを製造できることは思いがけなかった
ことである。

発明の詳細な説明 本発明において使用するブレビバクテリウム属に属しＬ
−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性が増大したエ
タノール資化性微生物は、公知のブレビバクテリウム属
に属しエタノール資化性微生物が用いられる。この様な
微生物としては、列えばブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３（微工研菌寄　ＦＥＲＭ−Ｐ　３０６８　
）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ　−２３３−Ａ
　Ｂ−４１（微工研菌寄　ＦＥＲＭ−Ｐ３　ｓ　１２　
）等がある。

上記の様な微生物を用いてＬ−α−アミノ酪酸トランス
アばナーゼ活性を増大させるには、公知の変異株Ａ製法
例えば紫外線照射或いは化学的薬剤処理により行うこと
ができる。

この操作の一具本例を示すと、化学的薬剤（例えばＮ−
メｆルーＮ／−ニトローＮ−二トロンクアニジン等）処
理により、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ−Ｐ３０６　Ｒ）に変異を誘起せしめた後、
この菌＠涌液を平板培地（尿素０．２％、硫安０．７％
、　ＫＨ２ＰＯ４０，０５％。

Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｉｌ（２００
，０５％。

ＮａＣｌ２１’ｌＦ／　Ｌ、　　ＺｎＳＯ４０７Ｈ２０
２１１１／　ｔ　、　　ビオチン２００μ？／１．チア
ミン塩酸塩１００μ２／ｌ。

Ｌ−α−アミノ酪酸０．２％を基本培地とし、これに寒
天２．０％、エタノール３容遣％を添加したもの）に、
約３０℃にて数日間培養し生じた大コロニーを分離した
のち、各コロニーを上記基本培地１０ｄを含む２４８大
型試験管に植菌し、エタノール２容１に％を添加後３０
℃で４８時間振とう培＃を行う。

該培養物を遠心分離により集菌した後、１００ｍＭリン
酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７，０）にて２回洗浄後、Ｌ
−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性測定用反応液
（Ｌ−α−アミノ酪酸２５μｍＯムＳ１リン酸カルシウ
ム緩衝液（ｐｆ（７，５）　１００　μｍｏｔｆ３ｓ、
ピリドキサール５リン酸０．０２５μｍｏｔｅｓ、トリ
トンＸ−１００，１重清％、脱イオン水１ｄ）の１ｄ中
に懸濁して、３０℃にて１８時間振盪反応を行う。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間）に
てｍ本を除去した上げ液中のＬ−α−アミノ酪酸の４度
を測定し、単位時間、巣立菌体当りのＬ−α−アミノ酪
酸の減少数をもってＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナ
ーゼ化活性とする。

本発明においてＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ
活性が増大した微生物とは、そのＬ−α−アミノ酪酸ト
ランスアミナーゼ比活性が、変異前の微生物例えばブレ
ビバクテリウム・フラノ（ムＭＪ−２３３の比活性に比
較し約２０％以上増大した変異株を意味する。

上記の操作によって取得した代表的な変異株としては、
ブレビバクテリウム・フラノくムＭＪ−２３３−ＡＢＴ
−１１Ｃ以下略してＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１と記す
）がある。この菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に受託番号微工研菌寄第８４２３号（昭和６０年８月２
２日）として受託されている。

以下に本発明のＬ−イソロイシンの製造法を具体的に説
明する。

本発明の培養に筐用する培地組成は、エタノールを主炭
素源とし、かつＤＬ−α−アミノ酪酸あるいはＬ−α−
アミノ酪酸を含有するものであれば、窒素源無機塩は特
に限定されない。窒素源としてはアンモニヤ、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
等を単独もしくは混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネノウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−インロイシン生成に必要であれば、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行ない、培養
温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行なう
。培養途中のｐＨは５〜１０．好ましくは７〜８付近に
て行ない、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加
して行なう。

ＤＬ−α−アミノ酪酸又はＬ−α−アミノ酪酸の添加濃
度は、０．１〜５重号％好ましくは０．２５〜３重駄％
である。培養開始時のエタノール講度は１〜５容量％、
好ましくは２〜３容曖％が適する。培養期間は２〜９日
間、最適期間は４〜７日間である。

培養液からのＬ−インロイシンの回収は、培養液を遠心
分離等にかけて菌体等の除却後、公知の手法、すなわち
イオン交換樹脂処理法あるいは沈澱法等により容易に行
なうことが出来る。

実験例 以下の実験例において、Ｌ−インロイシンの定ａはペー
パークロマトグラフのＲｆ　ＩＫ、電気泳動法の易動度
、微生物定量法による生物活性僅により確認した。定量
はロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ８０４
２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液体クロマ
トグラフィー（高車ＬＣ−５Ａ）とを併用して行なった
。また下記の実験例において％と表わしたのは重遣％を
意味する。

実施例１ 前培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％
、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、Ｃａｃｔ・２Ｈ２０
２ｐｐｍ。

ＦｅＳＯ４・７ＦｈＯ２ｐｐｍ、　ＭｎＳＯ４・４〜６
Ｈ２０２ｐｐｍ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈｚ０２　ｐｐｍ、
　ＮａＣｌ２　ｐｐｍ、ビオチン　２００μ２／１１チ
アミン・ＨＣｔ１００μｙ／ｌ　。

カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０ｄを２
４８大型試験管に分注、滅菌（滅閑後ｐＨ７，０）した
後ＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（、微工研菌寄第８４２
３号）を植菌し、無菌的にエタノールを０．３ｄ加え、
３０℃にて２日間振盪培養を行なった。

次に本培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．
４％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２　ＨＰＯ４０，０
５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、Ｃａｃｔ２・
２Ｈ２０２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ４＠７Ｈ２０２ｐｐ７Ｈ２
Ｏ２ｐｐ・４〜６６Ｈ２Ｏ２ｐｐ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２０２ｐｐｍ、　ＮａＣ４２ｐｐｍ、ビオチン　２００
μ？／１１チアミン・Ｈ（Ｊ　　１００μ７／１１　コ
ーンステイープリカー１０ｍｅ／ＬＸＤＬ−α−アミノ
酪酸０．５％）１０ｄを、２４２大型試験管に分注、滅
菌後（滅菌後ｐＨ７，０）、前培養液を０．１厘ｌ植菌
し、無菌的にエタノールを０．３４加え、３０℃にて５
日間振盪培養を行なう。エタノールは消費にともない添
加する。（この時エタノールば３容量％を越えないよう
にする。また全エタノール消費量は６．５容量７０でろ
った。）培養５日目に培地中にＬ−イソロイシンが培養
ＱＩｔ当り３．０２蓄積された。

培養液から菌体その他不純物を除いたＰ液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通して、Ｌ−イソ
ロイシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で
溶出したのち、Ｌ−イソロイシン画分・を濃縮し、冷エ
タノールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させ、培養液
１を当り１．９２の粗結晶を得た。

なお、同条件で親株（ＭＪ−２３３）を使用した場合、
培′Ｉ＃５日目の培地中のＬ−イソロイシンの蓄積は培
養液１を当り２．１２であった。

また、Ｌ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ活性は、
親株のそれに比較して約３５％増大していた。

実施例２ 実施例１と同様の条件で前培養を行った。次に本培養培
地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，Ｏｓ％、ＭｇＳＯ
４・７Ｈｚ００．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２ｐｐ
２Ｈ２Ｏ２ｐｐφ７Ｈｚ０２ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏａ・４〜
６）（２０２ｐＰｍ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ
、　Ｎａ（Ｊ　２　ｐｐｍ、ビオｆン２００　ｐ９／ｌ
、　　チ’Ｔミン・ＨＣｌ　　１００μ９／ｌ。

コーンステイブリカー１ｏｕｔ／ｌ、Ｌ−α−アミノ酪
酸０．２５％）１０ｄを、２４ｇ犬型試験管に分注、滅
菌後（滅菌後ｐＨ７−０）　、前培養夜を０．１ｄ植菌
し、無菌的にエタノールを０．３−加え、３０℃にて５
日間振盪培養を行なう。エタノールは消費にともない添
加する。（この時エタノールは３容曖％を越えないよう
にする。また全エタノール消費量は６．５容１％であっ
た。）培養５日目に培地中にＬ−イソロイシンが培養液
１を当り２．８２蓄積された。

実施例１と同様の操作によりＬ−インロイシンの結晶を
析出させたところ、培養Ｈｘｔ当り１．８２であった。

なお同条件にて親株（ＭＪ−２３３）を培養したところ
培養５日目の培地中に培養液１を当り１．９２のＬ−イ
ンロイシンが生成蓄積された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブレビバクテリウム属に属しＬ−α−アミノ酪酸
   トランスアミナーゼ活性が増大したエタノール資化性微
   生物を、エタノールを主炭素源としかつＤＬ−α−アミ
   ノ酪酸もしくはＬ−α−アミノ酪酸を含む培地に好気的
   に培養して培養液中にＬ−イソロイシンを生産蓄積せし
   め、この培養液よりＬ−イソロイシンを採取することを
   特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。